Hsp90

O sistema escolhido para aplicação e confirmação da eficiência do método desenvolvido foi o da Hsp90 na ausência e presença de dois ligantes: ADP e AMP. O sistema Hsp90 tem propriedades peculiares, uma delas é que os vários estados conformacionais de seu ciclo são afetados por nucleotídeos e existem em equilíbrio. São bem documentadas na literatura informações estruturais do ciclo da Hsp90 de diferentes organismos usando diferentes técnicas, como FRET e dinâmica molecular (HUANG et al., 2019; KRUKENBERG et al., 2011; LI; SOROKA; BUCHNER, 2012; MINARI et al., 2019; SAHASRABUDHE et al., 2017; SCHMID; GÖTZ; HUGEL, 2018; SHIAU et al., 2006). Esses trabalhos mostram que os domínios C-terminais estão envolvidos na dimerização, neste caso a formação de dímero é independente da ligação com ligante de qualquer natureza. Em contrapartida, a dimerização do N- terminal é dependente de interação com os nucleotídeos, resultando em um equilíbrio conformacional que varia de uma forma aberta (em V) para uma orientação alongada em que o domínio N-terminal dimeriza e uma fenda entre os domínios centrais permanece, como pode ser visualizado na Figura 14. Dessa forma, a Hsp90 é um alvo interessante para o estudo de mudança conformacional aplicando a técnica de ligação cruzada quantitativa associada à espectrometria de massas.

Figura 14. Modelos das estruturas da Hsp90 e Hsp90:ADP humana obtidos por meio de

modelagem usando como molde as estruturas do PDB 2IOQ e 2IOP, respectivamente. O domínio N-terminal (resíduos 1-236) está representado em amarelo, o domínio central (resíduos 237-561) em laranja e o domínio C-terminal em azul (resíduos 562-732).

ApoHsp90

O processamento inicial dos dados mostrou que o mapa de cobertura da sequência foi aproximadamente de 80% para a Hsp90 com e sem ligantes (Figura 15). Para avaliar a acessibilidade da proteína ao agente de ligação cruzada, foram analisadas as espécies modificadas do tipo dead-end.

Figura 15. Mapa de cobertura para a Hsp90 obtido a partir do PatternLab.

Para a proteína Hsp90, foram observadas coberturas dos resíduos de lisina modificados de 71,2%, 66,2% e 53,8% para as amostras apoHsp90, Hsp90:AMP e Hsp90:ADP, respectivamente. Para os resíduos de serina, uma porcentagem bem menor foi observada: 14,3%, 21,4% e 26,2% nas proteínas apoHsp90, Hsp90:AMP e Hsp90:ADP, respectivamente (Figura 16). Esses dados indicam que os resíduos da apoHsp90 estão mais acessíveis ao solvente e isso pode ser devido ao fato da sua estrutura ser aberta nesta condição (BRON et al., 2008; KRUKENBERG et al., 2011; LI; SOROKA; BUCHNER, 2012; ONG, 2003; SHIAU et al., 2006). Nas demais condições ela possui uma conformação fechada (ATP) ou parcialmente fechada (ADP), o que diminui a área de acesso ao solvente (MINARI et al., 2019; SCHMID; GÖTZ; HUGEL, 2018). Esse dado mostra que a técnica de XL-MS amostra de forma coerente as diferentes populações conformacionais para as condições apoHsp90 e Hsp90:ADP.

Os modelos das estruturas da Hsp90 humana foram gerados utilizando o I- MPEETQTQDQ PMEEEEVETF AFQAEIAQLM SLIINTFYSN KEIFLRELIS

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TASSER (ZHANG, 2008). Para guiar a modelagem foram escolhidas as estruturas do PDB 2IOQ (apoHsp90) com similaridade de sequência de 76% e 2IOP (Hsp90:ADP) com similaridade de sequência de 83%. Esse processo foi realizado para avaliar os dados de ligação cruzada, pois não foi encontrada estrutura cristalográfica da Hsp90 humana na sua forma apo e ligada ao ADP. Além disso, as estruturas cristalográficas por serem de organismos diferentes têm diferentes resíduos de aminoácidos na estrutura primária inviabilizando analisar as espécies modificadas pelo DSS nessas regiões. Vale ressaltar que não foi encontrado na literatura nenhuma estrutura da Hsp90 ligada ao nucleotídeo AMP.

Figura 16. Sequência de aminoácidos da Hsp90. Destacados em azul os resíduos

identificados por modificações do tipo dead-end após a reação de ligação cruzada utilizando o DSS.

Hsp90:AMP

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Hsp90:ADP apoHsp90

Os dados gerados inicialmente pelo SIM-XL estão presentes todas as espécies identificadas pelo software com score nas espécies interpeptídeo e intrapeptídeo acima de 3 e 2, respectivamente, além de cada uma das espécies terem spectral count de no mínimo 2. A distribuição de todas as ligações cruzadas obtidas pode ser visualizada por meio do mapa de restrições (Figura 17). É possível observar que existe uma diferença na quantidade de espécies de ligação cruzada formada nas diferentes condições. A condição que contém o maior número de espécies modificadas é a apoHsp90, seguida da Hsp90:AMP e Hsp90:ADP. Uma possível explicação é que na estrutura aberta (apoHsp90) os resíduos reativos estão mais expostos ao solvente e quando a proteína se liga a um nucleotídeo e se fecha parcialmente ou completamente os resíduos tornam-se menos acessível ao solvente. Como discutido anteriormente, o mesmo comportamento foi observado para espécies do tipo dead-end.

Figura 17. Mapa das ligações cruzadas identificadas para a Hsp90, Hsp90:AMP e

Hsp90:ADP.

apoHsp90

Hsp90:AMP

Com intuito de comparar dados experimentais com dados de ligação cruzada teóricos, foram calculadas, com os modelos gerados da apoHsp90 e Hsp90:ADP, por meio da distância topológica entre os resíduos, as possíveis espécies modificadas pelo agente de ligação cruzada com a distância máxima compatível com a cadeia espaçadora do DSS. Para o cálculo foi utilizado o software TopoLink (FERRARI et al., 2019). Para amostra da Hsp90:AMP não foi possível fazer esse cálculo porque não foi encontrado, até o momento, estrutura cristalográfica da mesma. O resultado obtido corrobora aos dados experimentais, um total de 303 espécies modificadas podem ser formadas na apoHsp90 e 266 para Hsp90:ADP.

É possível notar ainda que devido ao tamanho da proteína e a abundância de resíduos reativos e à grande quantidade de possíveis espécies modificadas, um grande volume de dados foi gerado (como é possível notar na Figura 17). Dessa forma, a quantificação manual de todas as espécies de ligação cruzada formadas nessas amostras demandaria um tempo muito grande para ser realizada, assim como suas respectivas correlações estruturais. Portanto, foi feita uma colaboração com o grupo dos Dr. Paulo C. Carvalho (Fiocruz-PR) e Dr. Diogo B. Lima (Instituto Pasteur- França) para o desenvolvimento de uma ferramenta de automatização das análises de dados, o programa SIM-Q.