e R6 (IC 50 = 15,1 M), derivado da vanilina benzilada, tendo como substituintes do anel

A duas metoxilas nas posições 2 e 4. De modo geral, observa-se que o grupo 2-naftil como anel B parece ser importante para reduzir a atividade da PtpA, quando associado à posição ideal de metoxilas no anel A (C37, C33 e C31) ou quando o anel A é um heterociclo (C12; IC50 = 32,1 M;

no caso, um anel tiofeno substituído). C33 (IC50 = 23,1 M) apresenta duas metoxilas nas posições

3 e 4 do anel A, e C31 (IC50 = 53,7 M) possui uma metoxila na posição 3 e uma hidroxila na

posição 4 do anel A, ambos compostos tendo o grupo 2-naftil como anel B.

N N O CH3 A ne l A O Anel B

167

A hidrofobicidade do anel B aparece como um fator fundamental na inibição da PtpA, e a presença de substituintes que podem estar em ligações hidrogênio com resíduos de aminoácidos no sítio ativo da enzima (como metoxilas e/ou hidroxilas em C37, R6, C33 e C31, e o átomo de enxofre em C12), também parece estar relacionada com a atividade das chalconas, concordando com os estudos de Lin e col. (2002). Estes autores, ao estudar chalconas frente a cepas de M.

tuberculosis H37Rv, concluíram que os compostos mais ativos apresentavam o anel B hidrofóbico e

o anel A hidrofílico, com substituintes capazes de fazer ligações hidrogênio.

A chalcona P11, que também apresentou inibição significativa da PtpA (IC50 = 44,7 M),

diferencia-se das demais por ter substituintes hidrofílicos nos dois lados da molécula; entretanto, certa hidrofobicidade é garantida pela presença dos anéis aromáticos.

c) Discussão dos resultados de IC50 obtidos para PtpB

Dentre os valores de IC50 obtidos para as chalconas avaliadas na PtpB de M. tuberculosis, o

maior efeito inibitório desta enzima foi provocado pelo composto R32 (IC50 = 11,9 M), que tem

como anel A o grupo 2-naftil, e como anel B o grupo 4-carboxifenil.

Grundner e col. (2007) demonstraram que o grupo oxalilamino da OMTS, estrutura que inibe especificamente a proteína PtpB (IC50 = 0,44 M), forma seis ligações hidrogênio com

resíduos de aminoácidos no sítio catalítico da enzima, sendo que 5 delas são entre o grupo carboxila e os resíduos Cys160, Lys164 e Arg166. A inibição provocada por R32 pode estar diretamente relacionada à formação de ligações hidrogênio entre o grupo carboxila do anel B e resíduos de aminoácidos do sítio ativo da enzima.

Da mesma forma que o observado para a PtpA, o grupo hidrofóbico 2-naftil também parece ter um importante papel na redução da atividade da PtpB, porém, independe de estar no anel A ou B, o que fica claro pela estrutura de R32 e dos demais compostos com atividade inibitória significativa, incluindo C25 (IC50 = 25,2 M), R9 (IC50 = 53, 6M) e C12 (IC50 = 57,2 M), que

possuem o grupo 2-naftil como um dos anéis. A chalcona P4, que também apresenta atividade importante (IC50 = 51,4 M), diferencia-se das demais por não ter em sua estrutura o grupo 2-naftil,

tendo como anel B o grupo 3,4-metilenodioxifenil.

Uma característica comum para as três estruturas mais ativas frente à PtpB (R32, C25 e P4), é a presença de substituintes retiradores de elétrons do anel aromático volumosos (como o átomo de bromo, grupo nitro e carboxila), na posição 4 de um dos anéis. R9 e C12 não se enquadram nessa observação e, no entanto, são os compostos menos ativos dentre os cinco citados.

168

d) Determinação do mecanismo de inibição – Estudos cinéticos

Estudou-se o mecanismo de inibição das seis chalconas mais ativas na PtpA (C37, R6, C33,

C12, P11 e C31) e das três mais ativas na PtpB (R32, C25 e P4), seguindo a mesma metodologia

usada para os testes de percentual de inibição e determinação da IC50, porém, variando as

concentrações do substrato pNPP (para-nitro-fenilfosfato). Os valores de velocidade de reação foram expressos como atividade específica da proteína (mol pNP.min-1_.mg-1_{) e a concentração de}

pNPP em mM.

d.1) Estudos cinéticos para a PtpA

A cinética dos compostos C37, C33 e C31 foi apresentada e discutida na dissertação de Mestrado de Alessandra Mascarello (2009), concluindo-se que as três chalconas são inibidores competitivos da PtpA de M. tuberculosis. A continuação do estudo nesta Tese de Doutorado resultou nos gráficos correspondentes aos compostos R6, C12 e P11, apresentados nas Figuras 53, 54 e 55, respectivamente.

Os gráficos de Michaelis-Menten mostram que, em baixas concentrações do substrato, a velocidade da reação aumenta proporcionalmente à concentração do mesmo. Como a concentração deste vai aumentando, torna-se fácil para a enzima encontrá-lo, até que todos os sítios ativos estejam ocupados pela ligação com ele ou com o produto. Nesta situação, dizemos que a enzima está “saturada” (existe mais substrato que sítio ativo disponível); então, em altas concentrações de substrato, a velocidade da reação se mantém constante, e se aproxima da velocidade máxima, que independe da concentração do mesmo.

Analisando as curvas 53(a), 54(a) e 55(a), observa-se que a taxa de saturação e liberação do fosfato segue um mecanismo enzimático clássico, consistente com as propriedades cinéticas de outras fosfatases para o substrato pNPP (Guo et al., 2002).

Devido ao valor de Vmax ser alcançado somente em uma concentração de substrato infinita

nas curvas de Michaelis-Menten, o valor real nunca poderá ser atingido; essa dificuldade experimental leva à transformação da equação de Michaelis-Menten (Equação 1, Esquema 26) em formas lineares, que possibilitam a determinação exata dos valores de Km e Vmax (Silverman, 2000).

A forma linear mais usada é o gráfico de Lineweaver-Burk, obtido pelo duplo-recíproco da curva de Michaelis-Menten, e dado pela Equação 2 (Esquema 26), que é usado para determinar o mecanismo de ação de um inibidor enzimático. A velocidade da reação é medida em relação à concentração de substrato, na presença e ausência de inibidores.

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Figura 53: Estudo cinético de inibição da PtpA pela chalcona R6. (a) Gráfico Michaelis-Menten.

(b) Gráfico duplo-recíproco de Lineweaver-Burk.

Esquema 26. Equações de Michaelis-Menten (Equação 1) e de Lineweaver-Burk (Equação 2). *KM

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Figura 54: Estudo cinético de inibição da PtpA pela chalcona C12. (a) Gráfico Michaelis-Menten.

(b) Gráfico duplo-recíproco de Lineweaver-Burk.

Analisando os gráficos 53(b), 54(b) e 55(b), fica evidente que as chalconas R6, C12 e P11 apresentam mecanismo de inibição competitivo, porque:

i) a inclinação das retas com o inibidor muda em relação à reta sem inibidor, onde = KM /

Vmax;

ii) a intersecção em x muda, onde a interceptação do eixo x = -1 / KMapp. O KM eleva-se com

o aumento da concentração de composto; desta forma, mais pNPP é necessário para a reação chegar a uma determinada velocidade na presença das chalconas do que em sua ausência.

iii) a intersecção em y não muda, onde a interceptação do eixo y = 1 / Vmax. Assim, a Vmax

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Figura 55: Estudo cinético de inibição da PtpA pela chalcona P11. (a) Gráfico Michaelis-Menten.

(b) Gráfico duplo-recíproco de Lineweaver-Burk.

As constantes cinéticas Ki, KMapp e Vmax foram determinadas graficamente para as seis

chalconas ativas na PtpA, e estão apresentadas na Tabela 22. KMapp e Vmax foram obtidas do gráfico

duplo-recíproco de Lineweaver-Burk, enquanto Ki foi determinada pelo inverso da velocidade

versus concentração do inibidor (gráfico de Dixon) (Dixon, 1953) e, alternativamente, pelo replot

do gráfico de Lineweaver-Burk: KMapp x [I].

Observa-se que os valores de KMapp aumentam na presença de concentrações crescentes dos

inibidores, quando comparados ao KM da PtpA sem inibidores, indicando um decréscimo na

interação enzima-substrato. Os valores fixos de Vmax caracterizam a inibição competitiva dos

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Tabela 22. Parâmetros cinéticos experimentais da PtpA para o substrato pNPP e as chalconas C37,

R6, C33, C12, P11 e C31. Vmax = velocidade máxima, KMapp = constante de Michaelis-Menten

aparente, Ki = constante de dissociação do complexo enzima-inibidor.

Chalcona [I] (M) Vmax (mol pNP min-1 mg-1) KMapp (mM) Ki (M) C37† 0 0,813 3,57 5 6,67 2,9* 10 11,11 5,4# 15 13,33 R6 0 4,500 1,18 5 1,43 16,5* 15 2,00 15,0# 20 2,70 C33† 0 0,991 2,51 5,5* 6,4# 10 6,25 15 8,33 25 9,17 C12 0 3,380 1,54 10 1,92 20 2,00 25,0* 30 2,44 29,5# 40 2,70 50 4,17 P11 0 4,188 0,95 20 1,67 34,5* 30 2,22 35,0# 50 2,38 60 2,94 C31† 0 1,200 2,22 10 3,33 13,0* 20 4,00 22,3# 40 6,25 50 10,0

[I] = [chalcona]; *Gráfico de Dixon: 1/V x [I]; #

Replot do gráfico de Lineweaver-Burk: KMapp x [I]; †Determinadas na

dissertação de Mestrado de Alessandra Mascarello (2009).

Ainda, é importante ressaltar que os valores obtidos para Ki são menores que os valores de

KMapp, indicando que a PtpA parece ter maior afinidade pelos inibidores que pelo substrato pNPP.

Os parâmetros cinéticos Ki, KMapp e Vmax também podem ser obtidos teoricamente pela

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(Equação 3)