Nesta parte do trabalho foi realizado um estudo com objetivo de identificar o composto ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico (FIGURA 5.10) no extrato hexânico das células bacterianas de Xac (EXPH), cujo processo de obtenção foi descrito na seção 5.1.2.2.
OH O
FIGURA 5.10 - Estrutura química do ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico. O ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico foi descrito em 2004 por WANG e colaboradores como sendo a substância responsável pelo processo de comunicação celular na bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) e o mesmo está associado ao mecanismo de patogenicidade em plantas hospedeiras de Xcc. Como a bactéria Xcc e a bactéria estudada neste trabalho,
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Xac, apresentam uma boa similaridade genômica (>80%), assim como ambas
possuem algumas enzimas responsáveis pela produção desse e outros ácidos graxos (DSF) (DENG et al., 2011), houve uma motivação para a busca do ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico em Xac. Dessa forma, o ácido 11-metil-cis-2- dodecenóico foi adquirido junto a Sigma-Aldrich para dar início aos estudos de identificação do mesmo na bactéria.
A solução padrão do composto foi analisada no modo SCAN (FIGURAS 5.11 e 5.12) e no modo SIM, sendo selecionados os pares de íons com m/z 86; 194 (FIGURA 5.13) e 194; 212 (FIGURA 5.14). Estes pares de íons foram escolhidos para a identificação do ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico no extrato hexânico das células bacterianas de Xac (EXPH), porque os mesmos forneceram uma melhor detecção, haja vista que outros íons diferentes estão presentes em muitos outros compostos do extrato.
A análise no modo SCAN no extrato EXPH forneceu um pico de interesse em 13,143 min (FIGURA 5.15), o mesmo tempo de retenção para o ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico na solução padrão (FIGURA 5.11). O espectro de massas referente a este pico no extrato (FIGURA 5.16) também foi similar àquele para o ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico na solução padrão (FIGURA 5.12), porém não foi observado o íon molecular, m/z 212, porque o composto está presente em baixa quantidade no extrato. A análise do extrato no modo SIM buscando os pares de íons m/z 86 e 194 (FIGURA 5.17) e os íons m/z 194 e 212 (FIGURA 5.18) confirma que o composto ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico está presente no extrato hexânico das células bacterianas de Xac (EXPH), comprovando que a bactéria Xac produz este composto, porém nas células. O extrato hexânico do meio NBY (no qual a bactéria foi cultivada) foi selecionado como branco e o ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico não foi detectado no mesmo após análise tanto no modo SCAN (FIGURA 5.19) quanto no modo SIM (FIGURAS 5.20 e 5.21) injetado nas mesmas condições da solução padrão e do extrato.
Em muitos trabalhos na literatura (DENG et al., 2011; RYAN & MAXWELL, 2011; WANG et al., 2004) é relatado o isolamento e/ou detecção dos ácidos graxos e outros compostos apenas no sobrenadante, porém provavelmente a maioria das bactérias produz os compostos nas células e, posteriormente, libera determinada quantidade para o meio.
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FIGURA 5.11 - Cromatograma de íons totais (TIC) da solução do ácido 11-metil-
cis-2-dodecenóico obtido por GC-MS. Condições: coluna ZB-WAX 30 m x 0,25
mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.). Injetor: 250º C, Detector: 260º C; He-1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.
FIGURA 5.12 - Espectro de massas do ácido 11-metil-cis-2-dodecenóico obtido por GC-MS. Impacto eletrônico, 70 eV.
FIGURA 5.13 - Cromatograma de íons selecionados da solução do ácido 11-metil-
cis-2-dodecenóico obtido por GC-MS. Condições: modo SIM (íons m/z 86 e 194);
coluna ZB-WAX 30 m x 0,25 mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.); Injetor: 250º C; Detector: 260º C; He-1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.
FIGURA 5.14 - Cromatograma de íons selecionados da solução do ácido 11-metil-
cis-2-dodecenóico obtido por GC-MS. Condições: modo SIM (íons m/z 194 e 212);
coluna ZB-WAX 30 m x 0,25 mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.); Injetor: 250º C; Detector: 260º C; He-1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.
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FIGURA 5.15 - Cromatograma de íons totais (TIC) do extrato hexânico das células bacterianas de Xac (EXPH) obtido por GC-MS. Condições: coluna ZB- WAX 30 m x 0,25 mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.). Injetor: 250º C, Detector: 260º C; He-1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.
FIGURA 5.16 - Espectro de massas referente ao pico com tempo de retenção 13,143 min obtido por GC-MS. Impacto eletrônico, 70 eV.
FIGURA 5.17 - Cromatograma de íons selecionados do extrato hexânico das células bacterianas de Xac (EXPH) obtido por GC-MS. Condições: modo SIM (íons m/z 86 e 194); coluna ZB-WAX 30 m x 0,25 mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.); Injetor: 250º C; Detector: 260º C; He-1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.
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FIGURA 5.18 - Cromatograma de íons selecionados do extrato hexânico das células bacterianas de Xac (EXPH) obtido por GC-MS. Condições: modo SIM (íons m/z 194 e 212); coluna ZB-WAX 30 m x 0,25 mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.); Injetor: 250º C; Detector: 260º C; He- 1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.
FIGURA 5.19 - Cromatograma de íons totais (TIC) do extrato do meio NBY obtido por GC-MS. Condições: coluna ZB-WAX 30 m x 0,25 mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.). Injetor: 250º C, Detector: 260º C; He- 1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.
FIGURA 5.20 - Cromatograma de íons selecionados do extrato do meio NBY obtido por GC-MS. Condições: modo SIM (íons m/z 86 e 194); coluna ZB-WAX 30 m x 0,25 mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.); Injetor: 250º C; Detector: 260º C; He-1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.
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FIGURA 5.21 - Cromatograma de íons selecionados do extrato do meio NBY obtido por GC-MS. Condições: modo SIM (íons m/z 194 e 212); coluna ZB-WAX 30 m x 0,25 mm, ID., 0,25 µm; rampa de 80º C(1 min.) (10º C/min)-260º C (15 min.); Injetor: 250º C; Detector: 260º C; He-1,2 mL/min. [ ] = 1 mg/mL; 1μL injeção no modo splitless.