As técnicas de amostragem de voláteis mais empregadas utilizam pouco ou nenhum solvente orgânico, assim como, também não é necessário o uso de altas temperaturas (NOGUEIRA, 2002), reduzindo dessa forma, a possibilidade de degradação de algumas substâncias comparado ao método de extração convencional, hidrodestilação. Como qualquer outro método de amostragem, dependem da partição entre os analitos da matriz e uma fase extratora que pode ser um gás, um líquido ou um adsorvente.
Entre essas técnicas, as duas principais metodologias são: Microextração em fase sólida e a extração em fase sólida voltada para compostos voláteis.
A microextração em fase sólida pode ser realizada no modo direto (DI-SPME) ou no modo “headspace” (HS-SPME) (FIGURA 1.10) e em ambas é utilizado uma fibra revestida por fases de diferentes polaridades. Os principais revestimentos disponíveis comercialmente são: polidimetilsiloxano (PDMS), polidimetilsiloxano/divinilbenzeno (PDMS/DVD), carboxen/polidimetilsiloxano (CAR/PDMS), carbowax/Divinilbenzeno (CW/DVB) e poliacrilato (PA). O uso do tipo de revestimento da fibra depende da aplicação, assim como das características dos voláteis que são adsorvidos ou absorvidos pela fase da fibra. O equilíbrio é controlado pelo coeficiente de partição dos solutos entre três fases (headspace, matriz da amostra e revestimento da fibra) (OCHIAI et al., 2012).
FIGURA 1.10 - Sistema para extração de voláteis por HS-SPME.
A extração em fase sólida (SPE) voltada para isolamento de compostos voláteis utiliza materiais adsorventes (em geral polímeros polorosos)
Introdução
em cartuchos de vidro e é classificada como “headspace” estático (SHS) e “headspace” dinâmico (DHS).
“Headspace” estático (SHS) é o caminho mais simples para avaliar a composição química de um aroma, no entanto, devido os compostos voláteis estarem presentes em concentrações muito baixas, muitas vezes torna-se inviável a aplicação desta técnica. Todavia quando instrumentos com baixos limite de detecção são utilizados e dependendo da concentração do analíto, o “headspace” estático pode ser utilizado. Nesta técnica, a amostra é fechada em um recipiente, onde o equilíbrio é atingido entre o “headspace” e a fase extratora a uma temperatura predeterminada sem passagem de fluxo de ar (FIGURA 1.11). Os voláteis presentes no material adsorvente são eluídos termicamente ou com poucos microlitros de solventes e analisados em cromatógrafo gasoso (AGELOPOLUS e PICKETT, 1998).
FIGURA 1.11 - Sistema para extração de voláteis por ”headspace” estático.
Na técnica de extração de voláteis por “headspace” dinâmico (DHS) (FIGURA 1.12), através da passagem de um fluxo de ar os compostos ficam adsorvidos, geralmente em polímeros porosos, os quais são posteriormente dessorvidos termicamente no cromatógrafo ou eluído com solventes orgânicos adequados. Não há o estabelecimento de um estado de equilíbrio, fazendo com que a maioria dos compostos voláteis dispersos na matriz deixe a amostra e passe para o “headspace”. O processo físico de adsorção é baseado em atrações eletrostáticas entre os grupos funcionais da superfície dos adsorventes e os das moléculas dos constituintes adsorvidos. Os principais materiais adsorventes utilizados são os polímeros porosos, nos quais podemos destacar o Tenax TA, Poli (óxido de 2,6-difenilfenileno), e Porapak Q®, etilvinilbenzeno-divinilbenzeno,
Introdução
algumas moléculas como terpenos e com área superficial de aproximadamente 550 m2.g-1 (HARPER, 2000; NOGUEIRA, 2002). As condições ótimas de coleta
dos compostos voláteis são fortemente dependentes da velocidade do gás de arraste e da seletividade do processo de adsorção e dessorção (ZHEN, 2005).
FIGURA 1.12 - Sistema de extração por “headspace” dinâmico.
A cromatografia gasosa é uma das técnicas mais utilizadas em análises qualitativas e quantitativas. Hoje é a técnica mais utilizada para análise da composição química de compostos voláteis, devido a sua alta sensibilidade, rapidez na análise, boa precisão quantitativa e alto poder de resolução. Nesta técnica os componentes de uma amostra, volatilizáveis e termicamente estáveis, são separados em consequência de sua partição entre uma fase móvel gasosa e uma fase estacionária líquida ou sólida contida dentro de uma coluna cromatográfica. A eluição é feita por um fluxo de fase móvel gasosa inerte (He, H2
ou N2) que não interage com as moléculas do analito, pois sua função é apenas
transportar o analito através da coluna (SKOOG et al., 2002). As colunas capilares empregadas atualmente propiciam um poder de resolução mais satisfatório para misturas complexas como em óleos essenciais, pois são feitas de sílica fundida, o que garante uma maior eficiência, inércia e longevidade quando comparada às antigas colunas de vidro. Para aplicações mais gerais, as melhores fases são os dimetilsiloxianos (DB-1 ou equivalente) e as 5% fenil 95% dimetilsiloxano (DB-5 ou equivalente), ou seja, pouco polares.
Quando a técnica de cromatrografia gasosa é utilizada de forma hifenizada, a espectrometria de massas é a mais aplicada para identificação de compostos voláteis, podendo também ser utilizada para quantificação. Os
Introdução
compostos passam pelo cromatógrafo gasoso e quando chegam ao espectrômetro de massas são geralmente ionizados por impacto de elétrons, que consiste de bombardeamento de um feixe de elétrons (normalmente 70 ev), provocando ionização e quebra em muitos fragmentos da molécula original. Alguns dos fragmentos possuem carga positiva ou negativa, os quais são detectados no analisador de massas através de sua razão massa/carga (m/z). Os sinais gerados (fragmentos de massas) chegam ao detector (geralmente um multiplicador de elétrons) onde são amplificados e posteriormente são registrados na forma de espectro de massas.
Justificativas
2 - Justificativas
Embora o sequenciamento do genoma de Xac tenha sido concluído (Da silva et al., 2002), ainda não há medidas de controle satisfatórias que possam ser recomendadas para esse patossistema, sendo a única maneira de eliminar a doença por meio da erradicação das plantas contaminadas e suspeitas (FUNDECITRUS, 2008).
Uma alternativa para a inibição do crescimento desta bactéria pode ser a atenuação da produção do fator de virulência por meio do processo conhecido como anti-quorum sensing ou quorum-quenching, ou seja, bloqueando a rota biossintética das moléculas sinalizadoras por modificação de genes que codificam para a síntese desses compostos ou mesmo administrando “reagentes” que fazem a degradação das moléculas sinalizadoras. Como uma molécula sinalizadora nunca foi isolada ou identificada em Xac, um estudo químico da bactéria buscando isolar e/ou identificar compostos possivelmente relacionada à comunicação bacteriana pode contribuir para a compreensão do fator de virulência e, consequentemente, do controle da doença. Ou seja, o estudo químico desta bactéria fornecerá possíveis estratégias para o controle do cancro cítrico.
Além disso, há uma necessidade na busca por novos métodos fáceis e rápidos para a diagnose da doença, antes mesmo dos sintomas aparecerem, pois as plantas podem, por exemplo, conter alguns compostos naturais que inibem a amplificação dos ácidos nucléicos na PCR (Reação de Polimerase em Cadeia) (WILSON, 1997), podendo gerar um resultado falso-negativo. Dessa forma, o estudo do perfil químico de Citrus sinensis, após a inoculação com X.
axonopodis pv. citri, utilizando as técnicas HS-SPME e “headspace” dinâmico
associadas à GC-MS e a técnica MALDI-TOF/MS fornecerá possíveis estratégias para o controle do cancro cítrico, por meio, principalmente, da busca de biomarcadores químicos (voláteis, semi-voláteis ou macromoléculas) que indiquem a presença da bactéria na planta.
Objetivos