Identificação de genótipos de cianobactérias

Uma visão geral de todas as etapas envolvidas nesta metodologia está representada na Figura 10.

4.6.1 Extração de DNA. Alíquotas de água foram filtradas em filtros Whatman GF/F 0,7 µm e os filtros armazenados a -20ºC até o momento da extração de DNA. A extração de DNA foi feita segundo Jungblut et al., 2006. Os filtros foram cortados em pequenos pedaços e embebidos em solução de extração (metilxantonato de potássio 1%; acetato de potássio 800 mM; EDTA 20 mM pH 8,0; SDS 1%; Tris–HCl 100 mM pH 7,4). A mistura foi homogeneizada no vortex, incubada a 65ºC por 2 h e depois resfriada no gelo por 10 min. Os debris foram retirados por centrifugação a 12000 x g por 10 min e o sobrenadante passado para outro tubo. A este foi adicionado o mesmo volume de

Figura 9- Conjunto de genes relacionados à síntese de microcistina em diferentes gêneros de cianobactérias. Em diferentes cores, os genes alvos dos iniciadores utilizados neste estudo. Em laranja, o gene alvo do primer mcyA, comum as cianobactérias produtoras de microcistina. Em verde, o alvo do par de primers mcyE específico de Microcystis. Em Azul o gene alvo do par de primers mcyE de Anabaena e em vermelho o gene alvo do par de primers mcyB específico de Microcystis.

fenol:clorofórmio, a mistura homogeneizada por inversão e centrifugada a 12000 x g por 5 min, sendo recolhida a fase aquosa. Este procedimento foi realizado 2 vezes com fenol:clorofórimio e uma vez com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). Ao final, adicionou-se à fase aquosa 1 volume de isopropanol 100%, com incubação a -20ºC durante a noite. Após centrifugação a 12000 x g por 20 min, o pellet foi lavado com 500 µL de etanol 70%, seguido de centrifugação a 12000 x g por 5 min. Após a secagem do pellet, o DNA foi ressuspenso em 100 µL de água MilliQ e armazenado a -20ºC.

Figura 10 - Resumo das etapas realizadas para a obtenção (A) e análise de sequências de cpcBA (B)

A

4.6.2 PCR da região cpcBA e purificação do produto. Para amplificar a região intergência e parte da região codificante de 2 genes do operon da c-ficocianina (cpcBA), utilizou-se os primers descritos por Neilan et al.,1995 (Tabela 4). As reações foram realizadas em 20 µl, contendo 0,5 U de GoTaq Flexi DNA polimerase (Promega), tampão de reação (Promega), dNTPs 0,2mM (Fermentas), MgCl2 2,5mM (Promega), 0,5 pmol dos primers foward (PCβF) e reverse (PCαR) e 1 µL de DNA. As PCRs foram realizadas no termociclador PTC-200 (MJ Research) com o programa a seguir: desnaturação inicial de 94ºC por 5 min, 40 ciclos de (94º 30 seg, 50º 30 seg, 72º 45 seg) e 72º por 2 min.

Os produtos de amplificação foram separados em gel de agarose 0,8% em TAE 1X (Sambrook et al., 2001) corados com brometo de etídio e visualizados em transiluminador de UV. Como parâmetro de migração aplicou-se no gel o padrão de fragmentos de DNA 1 Kb Plus Ladder (Fermentas). A banda na região de interesse (~700 pb) foi retirada do gel com um bisturi e o DNA purificado com o auxílio de kit de purificação Silica Bead DNA Gel Extraction (Fermentas). Após purificação, o DNA ressuspenso em água MilliQ foi precipitado por adição de 1/10 volume de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol absoluto, sendo incubado a -20°C por no mínimo 1 h. Após centrifugar a 12.000 x g por 20 min e descartar o sobrenadante, o precipitado foi lavado com etanol 70% gelado. Depois de seco, o DNA foi suspenso em 10 µl de H2O Milli-Q.

Este procedimento foi realizado repetidamente utilizando como molde na PCR DNA extraído de cada mês amostrado, gerando produtos de cpcBA de amostras coletadas de outubro a abril.

Tabela 5 - Sequências dos primers utilizados para clonagem e sequenciamento da região cpcBA

Primers Sequência (5’-3’ ) Referência PCβF GGCTGCTTGTTTACGCGACA Neilan et al, 1995 PCαR CCAGTACCACCAGCAACTAA Neilan et al, 1995 SP6 ATTTAGGTGACACTATAG Primers comerciais

(Promega)

T7 TAATACGACTCACTATAGGG

4.6.3 Clonagem do produto cpcBA. O produto de amplificação da região cpcBA (obtido das amostras de DNA de cada mês) foi utilizado em reação de ligação com o vetor pGEM-Teasy (Promega), realizada segundo instruções do fabricante, a 4ºC durante a noite. Após este período, a enzima DNA ligase foi inativada a 65ºC por 5 min e a reação dialisada contra água.

4.6.4 Preparo de células competentes e transformação. A partir de 100 mL de uma cultura de Escherichia coli DH5-α em fase exponencial, as bactérias foram coletadas por centrifugação a 10000 xg por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso. Este procedimento foi realizado 4 vezes, sendo que na primeira vez

o pellet foi ressuspenso em 100 mL de H2O MilliQ gelada estéril, da segunda vez em 50 mL de H2O MilliQ gelada estéril, da terceira vez em 10 mL de glicerol 10% estéril e da quarta vez em 500 µL de glicerol 10% estéril. As células competentes foram aliquotadas e armazenadas em nitrogênio líquido até o momento da transformação.

Após a retirada do nitrogênio líquido, as células foram acondicionadas no gelo por 20 min. Para cada transformação bacteriana foi adicionado a 60 µL de células competentes 1 µL da ligação, seguindo-se de incubação por 20 min no gelo. O aparelho utilizado para a eletroporação foi o Bio-Rad Gene Pulser com os seguintes parâmetros

1,5 volts; 1000; 25Faraday. Após a eletroporação, as bactérias foram transferidas para 1 mL de meio SOB (Sambrook et al., 2001) e incubadas a 37°C por uma hora. Após este período, 150 µL foram plaqueados em placas de LB com ampicilina (100 µg/L), IPTG (0,1 mM) e X-gal (20mg.mL^-1) (Sambrook et al., 2001). Foram realizadas transformações com os produtos das ligações cpcBA:pGEMTeasy de cada mês amostrado.

4.6.5 Extração de DNA plasmidial. As minipreparações plasmidiais foram feitas conforme descrito em Sambrook et al., 2001, com algumas alterações. Ao menos 50 colônias brancas oriundas de cada transformação (com amostras da região cpcBA de cada mês amostrado) foram cultivadas em 0,5 mL de LB líquido com ampicilina (100 µg/L) por 4-6 hs a 37°C, sob agitação. As bactérias foram coletadas por centrifugação a 12000 x g por 5 min à temperatura ambiente e o pellet foi ressuspenso em 50 L de solução 1 (EDTA 10 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8,0). Após a adição de 50 L de solução 2 (NaOH 200 mM, SDS 1%) a suspensão foi homogeneizada por inversão. Ao tubo foram adicionados 150 L de solução 3 (acetato de potássio 3M pH 5,5). Após centrifugação a 12000 x g por 10 min o sobrenadante foi transferido para outro tubo, ao qual foi adicionado 1 volume de isopropanol, sendo incubado por 20 min à temperatura ambiente. A amostra foi novamente centrifugada a 12000 x g por 20 min, o sobrenadante foi descartado e o pellet lavado com 500 L de etanol 70%. Após secar a temperatura ambiente, o DNA foi suspenso em 50 µL de água estéril e armazenado a -20°C.

4.6.7 Seleção de clones e sequenciamento. Para identificar os produtos clonados foram feitas PCRs com os primers PCβF e PCαR (Tabela 4), usando como molde os DNAs plasmidiais. No caso dos clones positivos, foram feitas a seguir PCRs com os primers SP6 e T7 (Tabela 4). Os produtos foram aplicados em gel de agarose e purificados como descrito no item 4.5.2. O DNA resultante (50-100 ng) foi utilizado para o sequenciamento, realizado com o primer PCαR (3,2 pmol) (Tabela 4). O sequenciamento foi realizado no equipamento ABI PRISM 3130 na Unidade Multidisciplinar de Genômica do Instituto de Biofísica.

4.6.8 Análise das sequências. A qualidade das sequências foi analisada pela visualização dos cromatogramas no programa Chromas Lite 2.1 (http://technelysium.com.au). Sequências com qualidade das bases acima de 20 (probabilidade de erro de 1%) foram consideradas satisfatórias. Foi realizada a busca por similaridade com sequências depositadas no GenBank utilizando a ferramenta blastn. Foi feito o reverso complemento das sequências e estas foram alinhadas pelo

programa M-COFFEE (Moretti et al., 2007). Após o alinhamento, as regiões das sequencias não utilizadas foram eliminadas manualmente, no programa Jalview 2.8 (Waterhouse et al., 2009).

4.6.9 Análise de clusters. A análise de cluster foi utilizada para obter o agrupamento das sequências em genótipos. Para esta análise foram utilizadas parte da região do gene cpcB (220 pb) e a região intergência entre cpcB e cpcA (de 65-120 pb). O agrupamento foi realizado pelo programa FASTGRUP II (Yu et al.,2006) e foram agrupadas no mesmo genótipo sequências com 99,7% ou mais de identidade. O

cálculo do índice de Shannon também foi feito pelo programa FASTGRUP II, segundo a fórmula abaixo (Yu et al., 2006).

A estimativa de cobertura de amostragem foi feita utilizando o índice S Chao1 , segundo a equação abaixo. (Kemp & Aller, 2004)

Onde Sobs é o número de genótipos observados, F1 e F2 são o número de genótipos que foram observados uma e duas vezes, respectivamente.

4.6.10 Minimum spanning tree

Com o intuito de analisar a similaridade entre as sequências obtidas neste trabalho foi utilizado o método de Median Joining Network. Este método possibilita, através da construção de árvores denominadas minimumg spanning tree, avaliar as relações entre sequências que apresentam baixa divergência. A análise de median joining e a construção da minimum spanning tree foram realziadas através do programa Network 4.6 (fluxus-engineering.com), utilizando os parâmetros padronizados do programa.

4.6.11 Construção das árvores filogenéticas. Para a construção das árvores filogenéticas foi utilizada a região codificante cpcB (220pb) das sequências obtidas.

Nesta análise, além das sequências geradas neste trabalho foram utilizadas sequências disponíveis no GenBank dos gêneros que ocorrem no reservatório do Funil, com maior contribuição de sequências de Microcystis (Anexo 2). Foi construída uma árvore para as sequências obtidas de cada mês, totalizando sete árvores. Após o alinhamento das sequências, foi calculado qual o modelo evolutivo mais adequado para o grupo de sequências analisadas e partir disso, foi feita a construção das árvores filogenéticas pelo método Neighbor Joining, no programa MEGA 5.10 (Tamura et al., 2011)