DIVERSIDADE E DINÂMICA DE CIANOBACTÉRIAS E
PRODUÇÃO DE MICROCISTINAS NO RESERVATÓRIO DO
FUNIL-RJ
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOFÍSICA)
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2013
Iamê Alves Guedes
DIVERSIDADE E DINÂMICA DE CIANOBACTÉRIAS E
PRODUÇÃO DE MICROCISTINAS NO RESERVATÓRIO DO
FUNIL- RJ
Dissertação de mestrado submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro visando a obtenção do grau de mestre em Ciências Biológicas (Biofísica).
Orientadoras: Dra. Sandra Maria Feliciano de Oliveira e Azevedo Dra. Ana Beatriz Furlanetto Pacheco
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Guedes, Iamê Alves
Diversidade e Dinâmica de cianobactérias e produção de microcistinas no Reservatório do Funil- RJ / Iamê Alves Guedes. Rio de Janeiro, 2013.
137 p.: il.
Dissertação de Mestrado– Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho / Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica), 2013.
Orientadoras: Sandra Maria Feliciano de Oliveira e Azevedo Ana Beatriz Furlanetto Pacheco.
1. Diversidade molecular. 2. cpcBA. 3. qPCR. 4. Microcistinas. 5. Fitoplâncton.
I. Sandra M.F.O e Azevedo, Ana Beatriz Furlanetto Pacheco. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Biofísica).
“Andar com fé eu vou,
que a fé não costuma "faiá" “
Agradecimentos
Tenho certeza que este trabalho só foi possível com a colaboração de muitos. Nesses breves dois anos de mestrado foram muitos momentos vividos, de grande aprendizado e crescimento. E com momentos tão intensos, tenho que agradecer muito a muitas pessoas.
Agradeço ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo que possibilitou a minha dedicação a este trabalho
À minha orientadora, Profa. Sandra Azevedo, pela possibilidade de realizar este projeto, apoio e incentivo ao longo da iniciação científica e mestrado. Sem dúvida a sua ajuda foi fundamental para a realização deste trabalho e contribui muito para o meu amadurecimento
A minha orientadora, Profa Ana Beatriz Pacheco, que sempre muito disposta, ajudou muito na realização deste trabalho. Obrigada pelo apoio e pelas discussões ao longo desses dois anos
A Profa Rosane Silva, pela revisão da dissertação.
À minha mãe, que desde sempre apoiou as minhas escolhas e permitiu que eu chegasse até aqui.
Ao elcinho, meu p.p. querido, sempre presente À minha irmã Maitê, grande companheira
Aos meus irmãos Gabi, Chris e Fábio e meus sobrinhos lindos
À minhas tias Cilene e Rose, que sempre me mimaram e me deram muito carinho! À minha vó Adelaide e vô Abel, sempre dispostos, com seus bolinhos e pastéis. À nininha, mel, toro e xangô, pelo amor incondicional
Aos queridos amigos da faculdade, que tornaram a Biologia muito mais divertida! Lívia, Naná, Dani, Rafa, Mari, Mina, Rosa, Hugo, Henrique, Juarez e Suisso
Às queridas amigas da escola, com quem compartilhei muitos momentos, desde a federal de química até hoje. Adriana, Gou e Patrícia.
À Nicoleta, companheira de todas as horas, com sua risada contagiante e com o lençol sempre esticado.
À Bel, orientadora querida e incentivadora que me apresentou as cianobactérias e o reservatório do funil!
Aos amigos do LABUP, onde passei grande parte da iniciação científica e aprendi muito, principalmente com meu orientador Ulysses Lins.
As queridas amigas Fernanda e Thaís, que conheci no LABUP, mas que quero manter pela vida toda.
Aos amigos do LETC, com quem compartilho todos os meus dias. Muito obrigada pelo apoio ao longo de todo o trabalho. Ricardinho, Roberta F. Roberta G. Carol, Dedéia, Priscila, Rosane, Fernanda, Adriana, Lorena, Daniel, Barbara, Elis, Ana Svoboda, D. Mirian, Luciane, Thabata e Simone
Às Profas Raquel e Valéria, com quem o convívio é muito prazeroso e enriquecedor. À Dedéia e Carol, queridas amigas do laboratório e também da vida.
Ao Pedro, pela ajuda em todas as coletas, pelas discussões dos mais diversos temas e pela amizade.
Ao Daniel pela imensa paciência e ajuda na análise das sequências A Larissa, pela ajuda na obtenção das sequências.
A todos os membros da Unidade Genômica, especialmente à Lívia, Carol e Letícia, sempre muito dispostas em sanar minhas dúvidas.
A meu namorado querido e amado, que consegui me aguentar nessa reta final! Obrigada pelos momentos de relaxamento e compreensão!
R
esumoGUEDES, Iamê Alves – Diversidade e dinâmica de cianobactérias e produção de microcistinas no Reservatório do Funil – RJ. Rio de Janeiro (2013). Dissertação (mestrado em Biofísica) – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho- Universidade Federal do Rio de Janeiro. 2013
O reservatório do Funil é localizado no município de Resende e apresenta frequentes florações de cianobactérias. O objetivo deste estudo foi analisar a diversidade molecular e de morfotipos de cianobactérias e sua dinâmica temporal durante um período de maior incidência de florações no Reservatório do Funil, assim como a produção de microcistinas. Foram realizadas coletas de outubro de 2011 a abril de 2012 e as maiores biomassas fitoplanctônicas foram detectadas em amostras do mês de outubro (5,7 mm3.L-1), dezembro (7,6 mm3.L-1) e fevereiro (5,8 mm3.L-1). As cianobactérias dominaram ao longo de todo o período e sua contribuição variou de 88% a 99,8% da biomassa fitoplanctônica. Os principais táxons encontrados foram Microcystis spp., Dolichospermum sp. e Cylindrospermopsis raciborskii. Foi observada a alternância de dominância entre eles, e Microcystis spp dominou em outubro e dezembro, C. raciborskii em janeiro e Dolichospermum sp. em fevereiro. Foi detectada microcistina em amostras de todos os meses, identificando-se 3 variantes, microcistina-LR, RR e YR e as concentrações variaram de 589,9 a 13,6 ng.L-1. Não foram detectadas células de Dolichospermum potencialmente produtoras de microcistina, indicando que Microcystis foi o gênero responsável pela produção de microcistina nas amostras analisadas. A proporção de genótipos de Microcystis potencialmente produtores de microcistina foi avaliada por qPCR e foi observada variação de 9 a 100%. A diversidade genética das cianobactérias foi avaliada através das sequências cpcBA obtidas em cada mês. Foram sequenciados 204 clones e observou-se ao todo 58 genótipos. Desses, 48 foram genótipos de Microcystis, 7 de Cylindrospermopsis, 1 de Pseudoanabaena e 1 de Dolichospermum. Sequências únicas corresponderam a 44 genótipos. Um genótipo de Microcystis ocorreu em todos os meses, dois ocorreram em 5 meses e a maioria ocorreu em apenas 1 ou 2 meses. O marcador cpcBA foi útil para diferenciar gêneros de cianobactérias e para revelar a variabilidade intraespecífica, mas sua análise não concordou com a designação de espécies no gênero Microcystis.
Abstract
GUEDES, Iamê Alves – Diversity and dynamics of cyanobacteria and microcystin production in the Funil Reservoir - RJ. Rio de Janeiro (2013). Master thesis (Master in Biophysics) – Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho- Federal University of Rio de Janeiro. 2013
The Funil reservoir is located in Resende, RJ and presents frequent cyanobacterial blooms. The aim of this study was to analyze the diversity of cyanobacteria and their temporal dynamics during a bloom in the Funil reservoir, as well as the production of microcystins (MC), using different approaches. Water samples were collected from October 2011 to April 2012 and the largest values of phytoplankton biomass were detected in samples of October (5.7 mm3.L-1), December (7.6 mm3.L-1) and February (5.8 mm3.L-1). Cyanobacteria dominated throughout the period and contributed with 88% to 99.8% of the phytoplankton biomass. The major taxa found were Microcystis spp., Cylindrospermopsis raciborskii and Dolichospermum sp. We observed the alternation of dominance between these three taxa, where Microcystis spp was dominant on October and December, C. raciborskii samples on January and Dolichospermum sp. on February samples. Phytoplankton biomass correlates positively with Microcystis biomass , NH4+, chlorophyll and pH and negatively with NO3- and DIN. MC was detected in all samples, including three isoforms, MC-LR, RR and YR, and concentrations ranged from 589.9 to 72.8 ng.L-1. The proportion of Microcystis genotypes potentially producing MC was measured by qPCR and high variation was observed , ranging from 9 to 100%. Genetic diversity of cyanobacteria was evaluated by means of cpcBA sequences from each month. We sequenced 204 clones and observed 58 genotypes. Of these, 48 were genotypes of Microcystis, 7 Cylindrospermopsis 1, Pseudoanabaena and 1 Dolichospermum; 44 unique sequences were found. One Microcystis genotype was observed in all samples, 2 occurred in 5 months and the majority only in 1 or 2 months. The cpcBA marker was useful to distinguish cyanobacteria genera and to reveal intraspecific variability, but the analysis did not support species assignment in the Microcystis genera.
Lista de Figuras
Figura 1- Lista de fatores ambientais positivos e negativos relacionados às florações de
cianobactérias. ...18
Figura 2- Representação esquemática da via de biossíntese da microcistina. ...22
Figura 3 - Estrutura da molécula da microcistina ...24
Figura 4 –Grupamento gênico da microcistina. ...26
Figura 5- Representação esquemática do conjunto de genes da ficocianina. ...32
Figura 6 - Localização do Reservatório do Funil. ...39
Figura 7- Foto aérea da região da barragem do Reservatório do Funil ...39
Figura 8 - Floração de cianobactérias registrada próximo à barragem ...40
Figura 9- Conjunto de genes relacionados à síntese de microcistina em diferentes gêneros de cianobactérias. ...47
Figura 10 - Resumo das etapas realizadas para a obtenção (A) e análise de sequências de cpcBA (B) ...48
Figura 11 - Variação mensal (out 2011 - abril 2012) da temperatura média e precipitação no município de Resende-RJ. ...55
Figura 12 - Variação de temperatura (a) e pH (b) na zona eufótica ao longo dos meses ( ...56
Figura 13 - Variação da concentração de clorofila e da biomassa fitoplanctônica. ...59
Figura 14 - Principais morfotipos de cianobactérias encontrados no reservatório do Funil. ...60
Figura 15 - Variação mensal (2011-2012) da biomassa fitoplanctônica tota (A)l e contribuição relativa dos principais táxons de cianobactérias ...62
Figura 16 - Variação mensal das concentrações dos três variantes de microcistinas...63
Figura 17 - Variação mensal (2011-2012) de valores de equivalentes de célula/mL para cianobactéria total (cya), Microcystis (micr) e genótipos mcyB+ de Microcystis (mcyB) no reservatório do Funil. ...66
Figura 18 - Variação mensal (2011-2012) da razão entre equivalente de células mcyB+ e equivalente de células de Microcystis. ...67
Figura 19 - Variação mensal dos valores de (a) equivalentes de células de Microcystis potencialmente produtoras de microcistina (mcyB) e concentrações de microcistina. (b) cota celular de microcistina por número de genótipos de Microcystis potencialmente ...68 Figura 20 - Produtos da amplificação por PCR da região (a) rDNA16S (b) mcyE Microcystis e (c) mcyE Dolichospermum. 1 - padrão de peso molecular de DNA, banda mais forte indica 1 kb; 2 - DNA cromossômico de uma linhagem isolada de M. aeruginosa; 3 a 9 - DNA
cromossômico de amostras de água dos meses de: outubro, novembro, dezembro, janeiro, fevereiro, março, abril; 10 - controle negativo, sem DNA molde. ...69 Figura 21 - Produtos da amplificação por PCR da região cpcBA usando como molde DNA cromossômico total de amostras ambientais. Gel de agarose 0,8% em TAE. À direita o padrão de peso molecular de DNA 1KB gene Ladder. ...70 Figura 22 - Variação mensal da ocorrência relativa de genótipos de cianobactérias, segundo a região cpcBA. M, Microcystis; C, Cylindrospermopsis; A Dolichospermum; P, Pseudoanabaena;UC genótipos únicos de Cylindrospermopsis; e UM, genótipos únicos de Microcystis. ...72 Figura 23 - Minimmum spaning tree de todas as sequências obtidas. ...74 Figura 24 - Minimmum spanning tree das sequências do gênero Microcystis. ...75 Figura 25 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de outubro. ...77 Figura 26 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de novembro. ...78 Figura 27- Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de dezembro. ...79 Figura 28 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de janeiro. ...80 Figura 29 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de fevereiro. ...81 Figura 30 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de março. ...82 Figura 31 - Árvore filogenética baseada nas sequências parciais de cpcB calculada pela análise de distância (Neighbor-Joining) do mês de abril. ...83 Figura 32- Desenho esquemático da associação entre biomassa de Microcystis, proporção de genótipos tóxicos, cota celular e concentração de microcistina. ... 107
Lista de Tabelas
Tabela 1- Valores de DL50 de cianotoxinas ... 21 Tabela 2- Levantamento de dados da proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina. ... 28 Tabela 3 - Primers utilizados em ensaios de PCR quantitativo ... 44 Tabela 4 - Condições de amplificação para os primers utilizados nos ensaios de PCR quantitativo ... 45 Tabela 5 - Sequências dos primers utilizados para clonagem e sequenciamento da região cpcBA ... 50 Tabela 6 - Variáveis limnológicas na amostra integrada da zona eufótica do ponto amostrado do reservatório do Funil. . ... 58 Tabela 7 - Análise de correlação da biomassa de cianobactérias e de Microcystis com as variáveis abióticas. . ... Erro! Indicador não definido. Tabela 8 - Parâmetros da curva de calibração do PCR quantitativo e temperatura de desnaturação dos produtos gerados com cada par de primer utilizado. ... 65 Tabela 9 - Estimativa de riqueza, cobertura da amostragem e índice de diversidade de Shanonn dos genótipos de cianobactérias do reservatório do Funil ... 73
Lista de Abreviaturas Ct – cycle threshold
cpcBA - genes que codificam para de ficocianina b e a DGGE- Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante DL 50 - dose letal mediana
dNTP – desoxirribonucleotídeos trifosfatados IPTG - isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo kb – quilobases
LETC - Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias MC - Microcistina
NID – Nitrogênio Inorgânico Dissolvido pb – pares de base
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase qPCR – PCR quantitativo
rDNA – gene que codifica para RNA ribossomal
RFLP - Polimorfismo de Tamanhos de Fragmentos de Restrição PCA - Análise de Componentes Principais
RDA – Análise de Redundância SRP- Fósforo Solúvel Reativo TAE - Tris Acetato EDTA TP - Fósforo total
U - unidade
X-GAL- 5-bromo-4-cloro-3-indolil-alfa-D-galactopiranosídeo WHO- Organização Mundial de Saúde
Sumário
1- Introdução ... 14
1.1 Florações de cianobactérias ... 15
1.2 Florações de cianobactérias em reservatórios brasileiros ... 19
1.3 Cianotoxinas ... 20
1.4 Microcistinas ... 22
1.5 Diversidade genética das cianobactérias ... 30
1.6 Ocorrência de cianobactérias no Reservatório do Funil ... 34
2. Objetivos ... 37 2.1 Objetivo Geral ... 37 2.2 Objetivos específicos... 37 3. Área de estudo ... 38 4. Materiais e Métodos ... 41 4.1 Amostragem ... 41 4.2 Clorofila a e nutrientes ... 41 4.3 Fitoplâncton ... 42 4.4 Análise de microcistinas ... 43
4.5 Proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina ... 43
4.6 Identificação de genótipos de cianobactérias ... 47
4.7 Análise estatística ... 54
5. Resultados ... 55
5.1 Dados Abióticos ... 55
5.2 Fitoplâncton ... 58
5.3 Microcistinas ... 63
5.4 Quantificação de genótipos potencialmente produtores de microcistina ... 64
5.5 Diversidade de genótipos de cianobactérias. ... 70
6 – Discussão ... 84
Relação entre fatores abióticos e biomassa fitoplanctônica ... 84
Identificação e dinâmica de gêneros/espécies de cianobactérias ... 89
Genótipos potencialmente produtores de microcistina ... 97
Cota celular de microcistina ... 103
Dinâmica de genótipos de cianobactérias ... 108
7- Perspectivas ... 115
8- Conclusões ... 115
9 - Referências... 117
Anexo 1 - Táxons identificados no reservatório do Funil ... 133
Anexo 2- Sequências utilizadas nas árvores filogenéticas construídas neste trabalho ... 134
1-
Introdução
As cianobactérias são procariotos fotossintetizantes amplamente distribuídos em ecossistemas de água doce, marinho e estuarino.Este grupo possui uma longa história evolutiva, e evidências fósseis indicam que já eram abundantes há mais de 2,5 bilhões de anos , e podem ter surgido há 3,5 bilhões de anos (Schopf, 2000). As cianobactérias foram os primeiros organismos primitivos conhecidos a produzir oxigênio através da fotossíntese e possuem papel fundamental na produção primária global e fixação do nitrogênio (Carey et al., 2012).
Este grupo apresenta características estruturais e metabólicas que lhe confere grande plasticidade adaptativa, podendo ser encontrado também colonizando solos e rochas, onde desempenha importante papel nos processos funcionais do ecossistema e na ciclagem de nutrientes (Azevedo, 1998). As cianobactérias apresentam grande variação morfológica, podendo ser unicelulares, coloniais ou filamentosas e estão classificadas em aproximadamente 150 gêneros e mais de 2000 espécies (Van den Hoek et al., 1995). Possuem clorofila-a, carotenóides e ainda outros pigmentos acessórios como as ficobilinas: ficocianina, ficoeritrina e aloficocianina. Também apresentam uma série de adaptações, descritas a seguir, que as auxiliam a sobreviver em ambientes em que outros microrganismos fotossintetizantes não são capazes de sobreviver (Yoo et al., 1995). Vários gêneros de cianobactérias possuem a capacidade de fixar nitrogênio atmosférico (Gallon, 1992), estocar fósforo em vesículas
intracelulares (Carr & Whitton et al., 1992) e acumular ferro e outros metais. Outra adaptação importante presente em algumas espécies são os acinetos, células de
resistência que permitem que as cianobactérias sobrevivam em momentos desfavoráveis, mesmo na ausência de luz, e depois regenerem em melhores condições. A presença de vacúolos gasosos é outra característica adaptativa importante que permite que algumas cianobactérias flutuem na zona fótica e explorem de forma otimizada a coluna d’ água (Padisák, 2004). As cianobactérias constituem um grupo bastante antigo e diverso, incluindo espécies que apresentam estratégias ecofisiológicas muito diferentes e algumas vezes até contrastantes.
A grande variedade de fenótipos observados nas cianobactérias permite que este
grupo ocupe tanto ambientes com escassez de nutrientes, como ambientes
enriquecidos (Paerl & Otten, 2013). Todas essas características permitem que algumas espécies de cianobactérias formem florações nos ambientes aquáticos, principalmente em ambientes eutrofizados. A eutrofização ocorre quando o enriquecimento por nutrientes excede a capacidade de assimilação em um sistema (Reynolds, 2006). Esse processo pode ser natural, ocorrendo ao longo de décadas, mas a crescente urbanização, sem o devido avanço dos sistemas de tratamento de efluentes, tem levado ao lançamento de esgoto em rios e outros sistemas aquáticos, o que aumenta a carga de nutrientes e reduz a concentração de oxigênio na água, contribuindo para a eutrofização artificial ou cultural.
1.1 Florações de cianobactérias
As florações de cianobactérias, resultado do crescimento massivo de células desses microrganismos na coluna d’água, culminam em grandes alterações na qualidade da
água. As florações resultam na diminuição de transparência da água, que suprime o crescimento de macrófitas aquáticas, afetando negativamente habitats de invertebrados e peixes. Outro aspecto importante é a decomposição das florações de cianobactérias por bactérias heterotróficas, levando à diminuição ou até mesmo esgotamento do oxigênio, e consequentemente causando a mortandade de peixes. (Paerl & Otten, 2013). As florações também levam à diminuição da diversidade ecológica, alterações nas cadeias alimentares, com potenciais efeitos na ciclagem de nutrientes e diminuição da diversidade de espécies planctônicas (Pearl, 2008).
Além de profundas mudanças ecológicas no ambiente, as florações de cianobactérias podem ser formadas por espécies produtoras de toxinas, que podem causar intoxicação em organismos aquáticos e mamíferos (incluindo seres humanos), o que representa um sério problema de saúde pública, principalmente quando da ocorrência dessas florações em mananciais de abastecimento.
As principais espécies de cianobactérias formadoras de florações tóxicas em ambientes de água doce são pertencentes aos gêneros Dolichospermum, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Microcystis e Planktothrix (Pearl, 2008).
Vários fatores relacionados às florações de cianobactérias são bastante explorados e conhecidos (Figura 1) (Pearl, 2008, Paerl & Otten, 2013). O enriquecimento de nutrientes dos ambientes aquáticos é sem dúvida o fator mais associado ao aparecimento e persistência das florações de cianobactérias (Paerl & Otten, 2013). Tradicionalmente, o fósforo tem sido considerado o principal elemento limitante ao crescimento das cianobactérias e altas concentrações deste elemento são relacionadas às florações, especialmente no caso daquelas formadas por espécies fixadoras de
nitrogênio, que podem suprir a sua demanda por este elemento através da fixação do nitrogênio atmosférico (Downing et al., 2001). Entretanto, recentemente foi proposta a revisão do paradigma de que somente o fósforo seria o fator preponderante para o aparecimento de florações e diversos trabalhos têm demonstrado que a fixação de nitrogênio não é suficiente para suprir as demandas por este elemento (Ferber et al., 2004, Lewis & Wurtsbaugh, 2008). O alto custo energético deste processo, a inibição da fixação de nitrogênio provocada pela produção de oxigênio durante a fotossíntese e a necessidade de outros cofatores podem limitar a fixação de nitrogênio (Paerl & Otten, 2013).
Temperaturas elevadas também favorecem gêneros formadores de florações de superfície, por estes possuírem taxas máximas de crescimento em temperaturas acima de 25ºC (Paerl & Otten, 2013). A temperatura é um dos fatores ambientais que mais afetam o crescimento das microalgas e cianobactérias, uma vez que influencia diretamente processos metabólicos relacionados à fotossíntese e outras vias biossintéticas (Robarts & Zohary, 1987; Davidson, 1991; Cole & Jones, 2000). Embora a variação anual da temperatura nos trópicos não seja tão grande quanto na região temperada, a ocorrência de cianobactérias em muitos sistemas brasileiros tem sido relacionada a períodos de temperaturas mais elevadas (Branco & Senna, 1994; Bouvy et al., 2000; Huszar et al., 2000; Marinho & Huszar, 2002).
A dominância das cianobactérias também é associada a algumas condições ambientais características, tais como: regime de mistura com estratificação duradoura da coluna d’água (Reynolds, 1987) ou diária (constância ambiental) (Ganf, 1974); baixa disponibilidade de luz (Zevenboom & Mur, 1980; Smith, 1986); reduzida razão Zona eufótica/Zona de mistura (Jensen et al., 1994); pH elevado com baixa disponibilidade de CO2 (Caraco & Miller, 1998).
Quanto à pressão de herbivoria sobre o fitoplâncton, que seria um potencial fator controlador de florações, esta tende a ser maior em ambientes oligotróficos do que em ambiente eutróficos. Além disso, certas características morfológicas de espécies formadoras de florações, como formação de colônias e grandes filamentos, dificultam a herbivoria, apesar de alguns grupos zooplanctônicos possuírem a capacidade de manipular filamentos de cianobactérias. (Paerl & Otten, 2013).
Figura 1- Lista de fatores ambientais positivos e negativos relacionados às florações de cianobactérias. ↑indicam fatores que favorecem as florações de cianobactérias e ↓ indicam condições desfavoráveis ao crescimento de cianobactérias. (Modificado de Paerl & Otten, 2013)
1.2 Florações de cianobactérias em reservatórios brasileiros
Os reservatórios são ecossistemas artificiais com grande potencial de eutrofização, devido à liberação de matéria orgânica da área alagada, além da forte influência da entrada de material alóctone da bacia de drenagem e, portanto, constituem um dos ecossistemas mais favoráveis à expansão das florações de cianobactérias no Brasil (Sant’Anna et al., 2008). A maioria dos reservatórios de água apresenta essas características durante grande parte do ano, concorrendo para a intensificação e ocorrência de florações. A disposição inadequada de rejeitos domésticos e industriais nos mananciais de abastecimento tem contribuído para que a ocorrência destes fenômenos seja cada vez mais comum nestes ambientes (Lapolli et al., 2011). Florações de cianobactérias potencialmente tóxicas têm sido registradas em vários ecossistemas aquáticos no Brasil (Costa et al, 2006), geralmente em épocas de maior consumo de água, nos meses de verão, causando entupimento de filtros nas estações de tratamento de água, problemas estéticos e muitas vezes levando à impossibilidade de uso da água (Fernandes et al. 2009).
Segundo Sant’Anna et al. (2008) já foram descritas 32 espécies de cianobactérias tóxicas no Brasil, distribuídas em vários estados, principalmente na região Sudeste. Segundo esses autores, a região tropical no Brasil apresenta menor diversidade de cianobactérias tóxicas (14 espécies) se comparada à região subtropical (27 espécies). Provavelmente esta discrepância entre o número de espécies descritas em cada região é relacionada ao maior esforço de amostragem nas regiões Sul e Sudeste. Os gêneros com maior número de espécies tóxicas já estudadas são Microcystis (7 espécies) e Dolichospermum (6 espécies) e as espécies potencialmente tóxicas Microcystis
aeruginosa e Cylindrospermopsis raciborskii foram as mais frequentemente registradas,
ocorrendo em áreas tropicais e subtropicais (Sant´Anna et al. 2008). Segundo Dorr et al., (2010), florações de cianobactérias já foram registradas em 11 dos 26 estados
brasileiros, principalmente em reservatórios artificiais no Nordeste, mas também em lagoas costeiras, estuários e rios. A maioria das florações tóxicas no Brasil é formada por espécies produtoras de microcistina (Dorr et al., 2010).
1.3 Cianotoxinas
Alguns gêneros de cianobactérias são capazes de produzir metabólitos secundários altamente prejudiciais à saúde humana e de animais (Tabela 1). Estas toxinas têm sido classificadas, de acordo com os sintomas observados em vertebrados, em hepatotoxinas (microcistinas e nodularina), neurotoxinas (anatoxina-a, anatoxina-a(S), saxitoxinas e β-Metilamino-L-alanina - BMMA), citotoxinas (cilindrospermopsina) e dermatotoxinas (lygyatoxina e aplysiatoxinas) (Carmichael, 2001; Dittman et al., 2013). Ao longo das últimas três décadas, relatos de produção de substâncias tóxicas por cianobactérias aumentaram, tanto em frequência quanto em distribuição global, ao mesmo tempo intoxicações humanas têm ocorrido regularmente (Neilan et al., 2012).
Tabela 1- Valores de DL50 de cianotoxinas (Dittman et al., 2013)
Recentemente, vêm sendo descritas as bases genéticas para a biossíntese de diversas cianotoxinas, com a identificação e caracterização dos genes envolvidos na sua síntese (Figura 2) (Neilan et al., 2012). Algumas cianotoxinas, como microcistina e a nodularina são sintetizadas por um mecanismo enzimático conhecido como síntese não-ribossômica de peptídeos (Dittman et al., 2013). Este tipo de síntese utiliza uma grande variedade de substratos e é catalisada por enzimas com atividade peptídeo sintetase e/ou policetídeo sintase (Welker & von Döhren, 2006). Essas enzimas são encontradas em fungos, cianobactérias e outras bactérias, e são capazes de sintetizar peptídeos independentemente de ribossomos. A maioria dos peptídeos não ribossomais de microrganismos é classificada como metabólitos secundários, o que significa que eles não têm um papel no metabolismo primário, crescimento ou reprodução, mas de algum modo beneficiam o organismo que o produz (Valerio et al, 2010).
DL50 para injeção intraperitonial em camundongos µg kg-1
Microcistina-LR 50–60 Microcistina-RR 500 Nodularina 30–50 Cilindrospermopsina 200 Anatoxina-a 375 Homoanatoxina-a 250 Saxitoxina 10
1.4 Microcistinas
A maioria das florações de cianobactérias tóxicas reportada em todo o mundo é constituída por espécies produtoras dos cianopeptídeos microcistina e nodularina. (Dittman et al., 2013). Microcistinas são heptapeptídeos cíclicos que possuem uma estrutura básica comum (Figura 3). A estrutura química geral das microcistinas se
Figura 2- Representação esquemática da via de biossíntese da microcistina. Os nomes das enzimas caracterizadas bioquimicamente são mostrados em vermelho. As outras reações propostas são baseadas em análises de bioinformática. Cada círculo e retângulo representam domínios enzimáticos PKS (policetídeo sintase) e NPRS(enzimas peptídeo sintetase não-ribossômica) respectivamente (Dittman et al., 2013)
compõe de 5 D-aminoácidos conservados e 2 L-aminoácidos variáveis, formando uma estrutura cíclica. Além da maior parte dos aminoácidos da molécula ser de isomeria D, pouco comum em estruturas biológicas, há dois aminoácidos raros: 3-amino-9-metoxi- 2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-ácido dienóico (ADDA) e N-metildehidroalanina (Mdha) (Harada et al., 1996; Soares, 2009b). A variação estrutural da microcistina pode ocorrer em todos os sete aminoácidos, no entanto, mais substituições ocorrem nas duas regiões variáveis de L-aminoácidos, nas posições X e Z (Figura 3). Essas variações garantem à molécula maior ou menor hidrofilia e diferentes potenciais tóxicos. Mais de 80 variantes de microcistina já foram descritas, variando o grau de metilação, hidroxilação, sequência peptídica e toxicidade (Tabela 1) (Welker & von Döhren, 2006). As microcistinas inibem proteínas fosfatases 1 e 2A de eucariotos, ligando-se covalentemente a um resíduo de cisteína presente no sítio catalítico destas enzimas (Neilan et al., 2012). Esta inibição enzimática resulta na hiperfosforilação de diversos alvos subcelulares. O efeito estrutural mais pronunciado dessa hiperfosforilação é a desorganização do citoesqueleto e perda de forma celular (Falconer & Yeung, 1992). As microcistinas são predominantemente produzidas por cianobactérias dos gêneros Microcystis, Planktothrix e Anabaena (Sivonen & Jones, 1999), apesar de já terem sido
descritas em gêneros terrestres, como Nostoc e Hapalosiphon (Oksanen et al., 2004) e bentônicos Phormidium (Izaguirre et al., 2007) e outros gêneros planctônicos como Pseudoanabaena (Paerl & Otten, 2013).
A concentração de microcistinas no ambiente é usualmente determinada a partir de amostras liofilizadas das florações de cianobactérias. A maior concentração de microcistina na água já descrita foi de 7300 µg.L-1 (Zhang et al., 1991), e em florações de superfície já foram detectados 2500 µg.L-1 (Chorus & Bartram, 1999). A maior parte da microcistina é intracelular, e pouco ou quase nada é encontrada dissolvida na água. Normalmente, as concentrações encontradas dissolvidas na água não excedem 1 µg.L -1
, valor máximo recomendado pela WHO (Organização Mundial de Saúde) para que água possa ser usada para o consumo humano. Apesar disto, já foi detectada dissolvida na água, após o colapso de uma floração, uma concentração de cerca de 1800 µg.L-1 de microcistina dissolvida (Jones & Orr, 1994). A bioacumulação já foi bem caracterizada em zooplâncton, peixes, crustáceos e moluscos (Ferrão-Filho et al. 2002, Magalhães et al. 2003, Soares et al. 2004, Vasconcelos 1995).
Microcistina
MC-LR L-Leu L-Arg CH3 MC-RR L-Arg L-Arg CH3 MC-YR L-Tyr L-Arg CH3
Figura 3 - Estrutura da molécula da microcistina (MC). Os aminoácidos X e Z e o grupo R1 são variáveis conforme tabela à direita. Os aminoácidos que formam a molécula de MC estão numerados de 1 a 7 (adaptado de Tanabe et al., 2009)
A elucidação dos genes envolvidos na síntese da microcistina iniciou-se com o estudo comparativo de duas linhagens de Microcystis aeruginosa, uma produtora e outra não produtora de microcistina (Dittmann et al., 1997). Posteriormente, o agrupamento gênico completo de 55 kb, contendo 10 genes, foi descrito nesta espécie (Nishizawa et al., 1999, Tillett et al., 2000). Os genes envolvidos na síntese de microcistina também
foram caracterizados em linhagens de Planktothrix agardhii (Christiansen et al., 2008) e Anabaena sp. (Rouhiainen et al., 2004). Em todos os gêneros o agrupamento gênico é
semelhante, apesar de algumas diferenças como o arranjo dos genes, seu tamanho e orientação (Figura 4) (Dittman et al, 2013).
Nem todas as linhagens de um gênero possuem a capacidade de produzir toxinas e, portanto, linhagens tóxicas e não tóxicas podem coexistir no mesmo ambiente. Inicialmente, a distribuição variável da capacidade de síntese de microcistina entre as linhagens de um gênero era atribuída à transferência lateral de genes (Schwabe et al., 1988), mas estudos filogenéticos vieram a demonstrar que a presença de genes para produção de toxinas é uma característica ancestral das cianobactérias e que linhagens não tóxicas aparecem devido a mutações e perda parcial ou completa destes genes (Rantala et al., 2004). Portanto, pode-se supor que um número maior de gêneros de cianobactérias do que os descritos até agora podem apresentar a capacidade de produção de microcistina (Dittman et al, 2013) (Figura 4).
Atualmente, métodos baseados na detecção da presença de genes relacionados à produção de toxinas são bastante utilizados para indicar o potencial de produção de microcistina por cianobactérias no ambiente (Sivonen & Borner 2008). O PCR quantitativo (qPCR) vem sendo cada vez mais utilizado para o monitoramento de ambientes aquáticos e através desta técnica é possível quantificar o número total de cianobactérias e também de cianobactérias potencialmente produtoras de microcistina
Figura 4 - (a) Arranjos diversos do agrupamento de genes da microcistina apresentam origem monofilética e evoluíram de um ancestral comum. A organização dos genes e presença de domínios específicos varia de acordo com os gêneros produtores. (b) Diversificação dos genes envolvidos na síntese de microcistina. A diversificação ocorre pela recombinação dos genes e também por mutações pontuais. O processo de diversificação é refletido em mais de 80 variantes de microcistinas já descritos na literatura. Exemplos são mostrados para microcistina sintetase de Microcystis. (c) Perda da capacidade de produção de microcistina pela exclusão parcial ou total do conjunto de genes envolvidos na síntese de microcistina. Exemplos são mostrados para microcistina sintetase de Planktothrix (adaptado de Dittman et al, 2013).
(Koskenniemi et al, 2007; Briand et al. 2008; Rinta-Kanto et al. 2009; Orr et al. 2010). Essas estimativas são importantes para avaliar a dinâmica de subpopulações com capacidade de produção de microcistina assim como o risco potencial de ocorrência de florações tóxicas, já que a maior parte da variação na concentração de microcistina observada durante uma floração é devida à variação na proporção de células tóxicas (Kurmayer et al, 2003).
Nos últimos anos, diversos trabalhos têm sido realizados para determinar a variação espacial e temporal na proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina em populações naturais (Hotto et al., 2008; Briand et al., 2009, Sabart et al., 2010) e diferentes genes têm sido utilizados como marcadores para quantificar o
número de genótipos tóxicos, como mcyE (Vaitomaa et al., 2003), mcyA (Furukawa et al., 2006), mcyD (Rinta-Kanto et al., 2005) e mcyB (Okello et al., 2010) (Tabela 2).
A variação observada na proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina ao longo do tempo é muito grande na maioria dos trabalhos realizados (Tabela 2). Por exemplo, Kurmayer & Kutzenberger, 2003 reportaram que a variação da porcentagem de genótipos positivos para mcyB foi de1,7 a 71% do total da população de Microcystis durante um ciclo sazonal. No Lago Erie, a variação da proporção de genótipos positivos para mcyD variou de 0 a 48% do total de células de Microcystis. Apesar do grande número de trabalhos neste tema, nenhum padrão geral de variação sazonal pode ser determinado. Além disso, a variação da proporção de genótipos tóxicos pode ser ainda maior espacialmente do que temporalmente (Martins & Vasconcelos, 2011).
Diversos trabalhos tentaram relacionar a quantidade de genótipos potencialmente produtores de microcistina com variáveis ambientais, mas ainda não foi observada uma correlação clara. Por exemplo, Yoshida et al, 2007 correlacionaram positivamente o número de cópias de mycA no ambiente com a disponibilidade de nitrogênio; Rinta-Kanto et al, 2009 correlacionaram o número de cópias de mcyD com ortofosfato e Davis et al, 2009 correlacionaram o aumento de cópias de mcyE com o aumento da
temperatura e disponibilidade de ortofosfato.
Tabela 2- Levantamento de dados da proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina. * genes mcy usados para quantificar genótipos tóxicos e genes cpc ou 16S rRNA usados para quantificar o total de cianobactérias **Diferentes pontos amostrais abordados no mesmo trabalho
Cianobactéria
dominate Local Genes alvo*
% células
tóxicas Referências
Microcystis sp. Lago Wannsee,
Alemanha mcyB, cpc 0,9 – 38,3 Kurmayer et al, 2003
Microcystis sp. Lago Champlain,
Estados Unidos mcyD, 16S rRNA 6 **Davis et al, 2009
Microcystis sp. Lago Agawam,
Estados Unidos mcyD, 16S rRNA 0,01 - 1,56 **Davis et al, 2009
Microcystis sp.
Lago Ronkonkoma, Estados Unidos
mcyD, 16S rRNA 12 - 100 **Davis et al, 2009
Planktothrix agardhii
Lago
Viry-Châtillon, França mcyA, cpc 31 - 93 Briand et al, 2008
Microcystis sp. Lago Erie,
Estados Unidos mcyD, 16S rRNA 0 - 59,5 Rinta-Kanto et al, 2009
Microcystis sp. Lago Oneida,
Estados Unidos mcyD, 16S rRNA 0 - 37 Hotto et al, 2008
Microcystis sp. Lago
Cianobactéria
dominate Local Genes alvo*
% células
tóxicas Referências
Microcystis sp. Lago Mikata,
Japão mcyA, cpc 0,5 - 35 Yoshida et al, 2007
Microcystis aeruginosa
Lago Grangent,
França mcyB, cpc 6 - 93 Briand et al, 2009
Microcystis aeruginosa
Lago Sables,
França mcyB, cpc 9,2 – 27,6 **Sabart et al, 2011
Microcystis aeruginosa
Lago Place,
França mcyB, cpc 75,5 - 82 **Sabart et al, 2011
Microcystis
aeruginosa Cuzieu, França mcyB, cpc 81,9 - 100 **Sabart et al, 2011
Microcystis
aeruginosa Feurs, França mcyB, cpc 75 – 82,2 **Sabart et al, 2011
Microcystis aeruginosa
Reservatório Torrão, Portugal
mcyA, mcyB,
16SrRNA 2 - 100 Martins et al, 2011
Microcystis Estuário São
Francisco, EU mcyD,16SrRNA
0,37 - 20,2
Baxa et al, 2010
Microcystis Reservatório
Kranji, Cingapura mcyE, 16S rRNA 21,7 - 100 Te & Gin, 2011
Microcystis
Baia de Missisquoi,
Canadá
mcyA, mcyE,
mcyG, 16SrRNA 1,7 - 21,6 Ngwa et al, 2012
Microcystis e Anabaena
Lagoa Durgakund,
Índia mcyA, cpc 0,01 - 14,3 Srivastava et al, 2012
Microcystus Lago Taihu, China mcyE , cpc 11,1 - 42,6 Otten et al, 2012
Microcystis
Reservatório Roodeplaat, África
do Sul
mcyD, mcyB,
1.5 Diversidade genética das cianobactérias
O estudo da diversidade molecular de bactérias iniciou-se nos anos 90 e revolucionou o conhecimento acerca da diversidade de espécies e da estrutura de comunidades bacterianas. A utilização de ferramentas moleculares, como a construção de bibliotecas de clones seguida de sequenciamento de genes marcadores, hibridização in situ e DGGE, possibilitou um rápido avanço do conhecimento nesta área (Case et al., 2007). Apesar disso, nenhum dos métodos baseados na amplificação de uma região específica do DNA de bactérias consegue, de forma acurada, representar completamente a diversidade genética. As limitações destas metodologias estão relacionadas à amostragem, preservação das amostras, extração de DNA e reação de amplificação de DNA (de Lipthay et al., 2004). Apesar disso, a construção de bibliotecas de regiões gênicas de rDNA 16S ainda é uma das abordagens mais utilizadas no estudo da diversidade procariótica em ambientes aquáticos (Kemp & Aller, 2004).
A caracterização da estrutura das comunidades durante florações de cianobactérias mostra-se problemática uma vez que vários gêneros ainda não têm a taxonomia resolvida (Moustaka-Gouni et al. 2009). Apesar de as cianobactérias mostrarem maior diversidade morfológica que outros grupos de bactérias, a discriminação no nível de gênero ou de espécie é muitas vezes difícil. Além disso, vários caracteres morfológicos utilizados na classificação dos grupos são influenciados por condições ambientais, dificultando a correta identificação (Anagnostidis & Komarek,1988). Mesmo atualmente, grande parte da taxonomia de cianobactérias é baseada em caracteres morfológicos, o que já não se aplica aos outros grupos bacterianos. Segundo Oren, 2011, pouquíssimas descrições de novos gêneros e espécies são publicadas no International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, a publicação oficial para o registro
de novos taxa procarióticos, e a nomenclatura e classificação de cianobactérias ainda não é completamente organizada. Esta situação tem evidenciado a necessidade de métodos mais confiáveis de classificação e vem promovendo o uso de uma abordagem polifásica, combinando dados morfológicos e moleculares (Gkelis et al. 2005).
Usualmente, uma floração de cianobactérias é formada por diversas linhagens de um ou mais gêneros, apesar de uma ou poucas linhagens poderem predominar em algum estágio. Somente a identificação microscópica não fornece informação acerca da presença, diversidade ou abundância de linhagens ou de sua toxicidade (Saker et al, 2009). Técnicas moleculares baseadas na análise de sequências gênicas têm se mostrado valiosas neste contexto e têm usado como alvos mais frequentes regiões intergênicas de loci de rDNA 16S e regiões intergênicas de genes de ficocianina (cpcBA) (Neilan et al., 1995). Desta forma, pode-se avaliar a composição e a dinâmica de populações de cianobactérias temporal e espacialmente, e ainda tentar correlacionar tal dinâmica a fatores ambientais, físicos e químicos ou biológicos. Durante o desenvolvimento de florações, por exemplo, pode-se indicar se um, poucos, ou muitos genótipos são selecionados em diferentes momentos ou locais no ecossistema (Briand et al., 2009).
As primeiras descrições de estudos moleculares de diversidade de cianobactérias foram publicadas por Nübel et al. 1997, tendo como alvo os genes rDNA 16S e também por Neilan et al., 1995, tendo como alvo os genes que codificam ficocianinas. A ficocianina é um pigmento presente em cianobactérias e, portanto, o uso dos genes correspondentes como alvo é um bom marcador da diversidade de cianobactérias
mesmo em comunidades complexas como o fitoplâncton. Dentro do domínio Bacteria, os genes de ficocianina são encontrados em ambientes de água doce exclusivamente em cianobactérias (Bryant, 1982). O conjunto de genes envolvidos na síntese de ficocianina contém genes que codificam para duas subunidades da bilina e três polipeptídios ligadores. O espaçador intergênico entre os dois genes das subunidades das bilinas, designados b (cpcB) e a (cpcA) (Figura 5), apresentam uma sequência altamente variável, capaz de diferenciar linhagens (Neilan et al., 1995). Apesar da região do rDNA 16S ser utilizada na taxonomia de cianobactérias (Wilmotte &Golubic, 1991; Nelissen et al., 1996), a divergência entre sequências dentro da uma espécie é relativamente baixa, normalmente abaixo de 1% (Rudi et al., 1997; Otsuka et al., 1998). Já a região intergênica do cpc tem se mostrado muito mais variável e pode ser uma ferramenta mais adequada para avaliar a diversidade de linhagens (Bolch et al., 1996; Bittencourt-Oliveira et al., 2001; Haande et al, 2007; Tan et al, 2010).
Figura 5- Representação esquemática do conjunto de genes da ficocianina. As regiões pretas indicam as regiões intergênicas e as cinzas as regiões codificantes. Neste exemplo, o tamanho total do fragmento obtido com os primers descritos neste trabalho é de 685 pb, com uma região intergênica de 94 pb. As setas indicam as posições relativas dos primers PCβF(Foward) e PCαR (Reverse) (Neilan et al, 1995).
A maioria dos trabalhos sobre identificação e ecologia de populações naturais de cianobactérias no Brasil é baseada apenas em dados morfológicos (Mártires, 2012). Os poucos estudos existentes associando dados morfológicos com técnicas moleculares, têm sido desenvolvidos com linhagens isoladas (Bittencourt-Oliveira et al., 2009, Silva, 2010). Por exemplo, Bittencourt-Oliveira et al., 2010, detectaram a presença de genes relacionados à síntese de microcistina em amostras de reservatórios do Nordeste; Lorenzi, 2004 estudou amostras de populações naturais da Represa de Billings e Guarapiranga, localizadas no estado de São Paulo, através de rDNA 16S por DGGE. Mais recentemente, Mártires, 2012, utilizando como marcador rDNA 16S em DGGE no estudo de quatro reservatórios do Rio Grande do Norte, identificou diferentes filotipos de cianobactérias, principalmente dos gêneros Planktothrix e Microcystis. Portanto, há uma escassez de trabalhos que utilizem técnicas moleculares visando não só a identificação e a taxonomia de cianobactérias, mas também a sua diversidade espacial e temporal, a partir da dinâmica de genótipos em ambientes brasileiros. Além dos poucos trabalhos no Brasil que abordam a diversidade de cianobactérias em populações naturais, não há registros de trabalhos que acompanhem a flutuação temporal de genótipos de cianobactérias e a sua relação com fatores ambientais. O entendimento mais aprofundado sobre a dinâmica de genótipos de cianobactérias durante uma floração pode auxiliar na compreensão dos fatores relacionados ao sucesso de uma espécie em detrimento de outra e também à variação de produção de toxinas durante esses eventos.
1.6 Ocorrência de cianobactérias no Reservatório do Funil
O Reservatório do Funil é um ambiente bastante estudado pelo Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias (LETC) já que apresenta frequentes florações de cianobactérias. Estes eventos vêm sendo observados no reservatório nos últimos 15 anos, sendo algumas florações formadas por espécies potencialmente produtoras de toxinas. Estudos demonstram que desde a década de 90 este reservatório já apresentava florações de cianobactérias potencialmente tóxicas (Ferrão-Filho et al., 2009).
Estudos realizados em 1978/1979 indicavam uma baixa densidade e grande diversidade de organismos fitoplanctônicos no reservatório, com predomínio de clorofíceas. A abundância relativa deste grupo era da ordem de 50%, enquanto as cianobactérias correspondiam a 17%. Estudos realizados em 1989 indicaram que as cianofíceas passaram a ser dominantes em quase todo o ciclo anual, podendo atingir abundância relativa superior a 90% no período de verão, quando foram registradas florações intensas de Microcystis aeruginosa. Microcystis, Oscillatoria e Anabaena foram os principais gêneros descritos neste período (FEEMA, 1991).
Já na década de 90, Bobeda (1993) relatou a produção de microcistinas em uma floração de Microcystis neste reservatório. Branco et al. (2002), em coletas entre abril e dezembro de 1995 registraram elevadas concentrações de clorofila a, associadas à floração de Microcytis aeruginosa nos meses de novembro e dezembro. Rocha (2002), em coletas mensais entre 2004 e 2006, relatou a dominância de Microcystis sp. durante todo ano, com maiores densidades celulares nos meses mais quentes. Ferrão-Filho et
al. (2009), no período de novembro de 2002 a outubro de 2003, registraram florações
de cianobactérias, com dominância dos gêneros Anabaena, Microcystis e Cylindrospermopsis. Os três gêneros estiveram presentes ao longo de todo o ano,
entretanto, houve uma tendência à dominância de Microcystis spp. nos meses quente-chuvosos e codominância de A. circinalis e C. raciborskii no restante do ano. Deblois et al. (2008) relataram a presença de microcistina no séston deste reservatório, além de
terem registrado a presença desta toxina em tecidos de peixes da espécies Oreochromis niloticus coletados na localidade.
Estudos mais recentes continuam relatando as constantes florações de cianobactérias, com destaque para os gêneros Anabaena, Cylindrospermopsis e Microcystis. Soares (2009), em coletas mensais, observou dominância de cianobactérias ao longo de todo ano, com biomassas mais elevadas nos meses de verão. Este estudo também relatou um padrão de substituição de espécies ao longo do ano, com períodos de floração de Microcystis aeruginosa sucedidos por florações de Anabaena circinalis e
Cylindrospermocis raciborskii. Rocha, 2012, observou elevadas densidades de
Sphaerocavum brasiliense, gênero até então não relatado neste ambiente, além da
dominância de Anabaena circinalis nos meses mais quentes.
A maioria desses estudos associou a dominância de cianobactérias às altas concentrações de nutrientes encontradas neste reservatório. De maneira geral, maiores densidades de cianobactérias foram observadas nos meses de outubro a fevereiro, correspondendo aos meses de temperaturas mais elevadas. A preferência das cianobactérias por temperaturas mais elevadas, mesmo nos trópicos, tem sido
extensivamente demonstrada (Huszar et al. 2000, Marinho & Huszar 2002, Reynolds 2006).
Além disso, verificou-se uma tendência ao aumento da densidade de cianobactérias ao longo dos últimos anos, com Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e Microcystis spp. como os principais táxons de cianobactérias presentes no Reservatório
do Funil. Apesar dos muitos estudos já realizados, ainda não estão completamente estabelecidos os fatores associados à dinâmica de coexistência e substituição de espécies e/ou linhagens dos três principais gêneros de cianobactérias presentes, além da dinâmica de produção de microcistina neste reservatório.
2. Objetivos
2.1 Objetivo Geral
- Analisar a diversidade de cianobactérias e sua dinâmica temporal durante um período de floração no Reservatório do Funil, assim como a produção de microcistinas, utilizando diferentes abordagens.
2.2 Objetivos específicos
- Analisar as variáveis limnológicas e sua relação com a dinâmica de espécies de cianobactérias e produção de microcistinas.
- Avaliar a diversidade de genótipos de cianobactérias e sua variação temporal e compará-la à diversidade de morfotipos de cianobactérias encontrados no mesmo período.
- Avaliar a proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina e relacioná-la à concentração de microcistina no ambiente.
3. Área de estudo
O Reservatório do Funil (22o30’S, 44o45’W) está localizado a 440 m de altitude, no município de Resende (RJ). É a primeira barragem do Rio Paraíba do Sul em área fluminense e possui uma área de 40 km2, volume de 8,90 x 106 m3, profundidade máxima e média de 70 e 22 m, respectivamente, com tempo de residência médio de 41,5 dias (Rocha, 2012) (Figura 6). Este reservatório foi construído no final da década de 1960, pelo barramento do rio Paraíba do Sul, com a finalidade de servir de fonte de abastecimento para a cidade de Resende e produzir energia elétrica, mas também é responsável pela regularização da vazão do Rio Paraíba do Sul, atenuando o impacto de cheias e possibilitando a transposição de volume de água para o conjunto de reservatórios do Sistema Light, que acabam por desaguar no Rio Guandu, a principal fonte de abastecimento de água do município do Rio de Janeiro (Ferrão-Filho et al, 2009). A Usina Hidrelétrica de Funil tem importância para o sistema elétrico por fornecer energia a grandes centros consumidores, como os estados do Rio de Janeiro e São Paulo (Furnas, 2008) (Figura 7).
Devido à sua posição estratégica, o reservatório do Funil serve como um decantador natural de sedimentos, sendo considerado uma verdadeira barragem à poluição recebida do Vale do Paraíba Paulista, melhorando a qualidade das águas do rio Paraíba do Sul a jusante do reservatório. Destaca-se ainda, como importante fator de impacto sobre o reservatório, a reduzida cobertura vegetal dos solos da sua bacia de drenagem (Figura 8).
Figura 6 - Localização do Reservatório do Funil. A direita o desenho esquemático do reservatório, indicando a localização da barragem (modificado de Soares et al, 2012).
Figura 8 - Floração de cianobactérias registrada próximo à barragem em fevereiro de 2010 no Reservatório do Funil (Rocha, 2012).
4. Materiais e Métodos
4.1 Amostragem
Foram realizadas coletas mensais de água, de outubro de 2011 a abril de 2012, em um ponto amostral, próximo à barragem do Reservatório do Funil (Figura 7). Foi realizada a amostragem integrada da zona eufótica. Para tanto, com o auxílio da garrafa de Van Dorn foram coletadas amostras a cada 0,5 m desde a subsuperfície até o fim da zona eufótica, estimada como 2,7 vezes a profundidade de extinção do disco de Secchi (Cole, 1994). Essas subamostras foram reunidas em um frasco e constituíram a amostra integrada. Temperatura da água, pH e condutividade elétrica foram determinados em campo com o emprego de uma sonda multiparamétrica Yellow Spring modelo 600 QS. A turbidez foi determinada por um turbidímetro Hatch. A transparência da água foi avaliada pela profundidade de extinção do disco de Secchi e a intensidade luminosa subaquática foi determinada com o uso de radiômetro LiCor.
4.2 Clorofila a e nutrientes
Parte da amostra de água coletada foi filtrada em filtros Whatman GF/F (0,7µm) que foram armazenados congelados até o momento da análise. A concentração de clorofila-a foi determinada após a extração com acetona 90%, segundo APHA (1995). Para a análise de nutrientes dissolvidos, alíquotas de água foram filtradas em filtros Whatman GF/F (0,7µm) o filtrado armazenado em frascos de polipropileno, mantidos congelados até o momento da análise. Os íons NO2-, NO3- e NH4+ foram analisados através de um cromatógrafo de íons Dionex ICS-1000. As condições cromatográficas
utilizadas na análise são descritas a seguir. Ânions: colunas AS-14A e AG-14A, eluente 8,0 mM de carbonato de cálcio e 1 mM de bicarbonato de cálcio, em condição isocrática, com supressão de condutividade por supressora ASRS-300, associada à supressora CRD-300, com fase móvel de hidróxido de sódio 200 mM. Cátions: colunas CS-12A e CG-12A, eluente 20 mM de ácido metanosulfônico e supressora CSRS-300. A análise de fósforo solúvel reativo foi feita por espectrofotometria, segundo Murphy e Riley, 1962 (espectrofotômetro Shimadzu UV-VIS mini 1240). Para a análise de fósforo total, alíquotas de água bruta foram tratadas com persulfato de potássio, seguido de incubação em autoclave por 45 min a 120ºC. O ortofosfato liberado foi analisado da mesma forma que o fósforo solúvel reativo (Murphy e Riley, 1962).
4.3 Fitoplâncton
Para análise quantitativa, alíquotas de água da amostra integrada foram armazenadas em frasco de vidro âmbar de 250 mL contendo Lugol. A abundância fitoplanctônica foi determinada pelo método de Utermöhl (1958) em um microscópio ótico invertido Olympus BX-51. Os indivíduos (células, colônias, cenóbios, filamentos) foram enumerados em campos aleatórios (Uhelinger, 1964), em número suficiente para alcançar 100 indivíduos da espécie mais frequente ou 400 indivíduos totais, sendo o erro inferior a 20%. A estimativa do biovolume (mm3.L-1) foi feita multiplicando-se, para cada espécie, a densidade pelo volume médio dos organismos. Para análise qualitativa, amostras coletadas em rede de 22 µm foram fixadas em Lugol para posterior análise por microscopia ótica.
4.4 Análise de microcistinas
Um volume de 1,0 L da amostra integrada de água foi armazenado em frasco de vidro, congelado e posteriormente liofilizado. O material liofilizado foi extraído com 10 mL de metanol:butanol:água (20:5:75) por 30 min em sonicador, seguido de mais 30 min sob agitação. Este procedimento foi repetido 2 vezes e o material extraído foi evaporado em nitrogênio até 50% do volume inicial. Esse então passou por purificação em coluna C-18 (Strat X 33 Polymeric Reverse Phase 500 mg/6mL), sendo eluído com 10 mL de metanol 100%. O eluato foi completamente seco em nitrogênio e ressuspenso em 1,0 mL de solução de reconstituição de microcistina: Fase B (5 mM de acetato de amônio em acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico): água (1:1). A identificação e a quantificação das microcistinas foram feitas no equipamento de LC-MS-MS API 3200 Q-trap (Applied Biosystems) nas seguintes condições: Coluna: Kinetex 2,6µ C18 100A (50 x 2,10 mm); Fase A: 5 mM de acetato de amônio em água + 0,1% de ácido fórmico / Fase B: 5 mM de acetato de amônio em acetonitrila + 0,1% de ácido fórmico, com gradiente. Foram analisadas as transições para microcistina LR, RR, YR, LA e LW. O limite de detecção foi de 0,5 µg/L e o limite de quantificação de 1µg/L.
4.5 Proporção de genótipos potencialmente produtores de microcistina
Para a determinação dos genótipos potencialmente produtores de microcistina foi utilizado PCR quantitativo (qPCR), com primers descritos por Martin et al, 2010.
As reações de qPCR foram realizadas no equipamento StepOnePlus Real Time PCR (Applied Biosystems). Todas as reações foram feitas em triplicata, em um volume final
de 15 µL, contendo 3 µL de DNA molde, 0,4µM de cada primer (0,2µM para MCYA-CD1F/CD1R) e 1 X Master Mix SYBR Green (Fermentas). Quatro pares de primers foram utilizados neste ensaio. O par de primers CYA 359F/781R foi utilizado para amplificar um fragmento de 422 pb do gene rDNA 16S comum a todas as cianobactérias. O par MICR 184F/431R foi utilizado para amplificar uma região de 248 pb do rDNA 16S, específica do gênero Microcystis. O par MCYA CD1F/CD1R é capaz de amplificar o gene mcyA dos gêneros Microcystis, Planktothrix e Anabaena e gera um fragmento de 297 pb. O par MCYB 2959F/3278R amplifica uma região de 320pb do gene mcyB, especificamente do gênero Microcystis. As sequências destes primers estão descritas na tabela 2. (Figura 9)
Tabela 3 - Primers utilizados em ensaios de PCR quantitativo
Alvo Primers Sequência (5’-3’)
Tamanho do produto (pb) Cianobacteria 16S rDNA Cya 359F GGGGAATYTTCCGCAATGGG 422 Cya 781R GACTACWGGGGTATCTAATCCCWTT Microcystis 16S rDNA Micr 184F GCCGCRAGGTGAAAMCTAA 248 Micr 431R AATCCAAARACCTTCCTCCC mcyA todos os gêneros mcyA CD1F AAAATTAAAAGCCGTATCAAA 297 mcyA CD1R AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT mcyB Microcystis mcyB 2959F TGGGAAGATGTTCTTCAGGTATCCAA 320 mcyB 3278R AGAGTGGAAACAATATGATAAGCTAC
Para a construção da curva padrão foi utilizada uma linhagem de M. aeruginosa (MIRF-01) isolada e mantida no banco de linhagens do LETC. A partir de uma cultura de células desta linhagem cuja densidade celular foi determinada por contagem direta ao
microscópio, o DNA cromossômico foi extraído e submetido a diluições seriadas. A curva padrão foi realizada com sete diluições e a partir disto, foi criada a relação entre a concentração conhecida de DNA (em equivalentes de células) e os valores de Ct(cycle threshold) das amostras diluídas. Assim, um volume de 20 mL de um cultivo a 2,47 x 106 células (determinada por contagem no microscópio) foi filtrado em filtros Whatman GF/F (0,7 µm) e o DNA extraído como já descrito anteriormente (Jungblut et al 2006). Foram utilizados como molde diluições de DNA variando de 1 a 1:106 (equivalente a 2,47x107 a 24,7 células respectivamente). As PCRs ocorreram conforme descrito na tabela 3. A determinação dos valores de Ct foi feita automaticamente pelo programa StepOne™ Software do equipamento StepOnePlus Real Time PCR.
Tabela 4 - Condições de amplificação para os primers utilizados nos ensaios de PCR quantitativo
Primers
Protocolo do PCR Desnaturação
inicial Desnaturação Anelamento Extensão
Número de ciclos CYA 359F/781R 5 min a 95 °C 15 s a 95 °C 15 s a 60 °C 30 s a 72 °C 50 Micr 184F/381R 5 min a 95 °C 15 s a 95 °C 30 s a 52 °C 30 s a 72 °C 40 mcyA CD1F/CD1R 5 min a 95 °C 15 s a 95 °C 30 s a 52 °C 30 s a 72 °C 40 mcyB 2959F/3278 R 5 min a 95 °C 15 s a 95 °C 30 s a 52 °C 30 s a72 °C 40
A curva de melting foi realizada imediatamente após a amplificação com uma taxa de transição de temperatura linear de 0,5 °C.s-1 de 55 a 95°C, com determinação contínua da aquisição da fluorescência. O cálculo da eficiência de amplificação utilizando cada par de primers foi feito segundo a fórmula abaixo.
Onde E é a eficiência de amplificação e slope é o valor de inclinação da reta obtida a partir da relação entre concentração de DNA e o valor de Ct.
Ensaios de PCR convencional foram realizados no intuito de detectar genótipos potencialmente produtores de microcistina, utilizando como alvo o gene mcyE (Vaitomaa et al.,2003). Para isso, foram utilizados 3 primers denominados mcyE F2 (5’-GAA ATT TGT GTA (5’-GAA GGT GC-3’)MicmcyE-R8 (5’-CAA TGG GAG CAT AAC GAG- 3’) AnamcyE-12R ( 5’-CAA TCT CGG TAT AGC GGC-3’). A combinação do primer mcyEF2 com MicmcyE-R8 amplifica o gene mcyE de cianobactérias do gênero Microcystis e a combinação do primer mcyEF2 com o primer AnamcyE-12R amplifica o
gene mcyE de cianobactérias do gênero Anabaena (Dolichospermum) (Figura 9). As reações foram realizadas em 20 µl, contendo 0,5 U de GoTaq Flexi DNA polimerase (Promega), tampão de reação (Promega), dNTPs 0,2mM (Fermentas), MgCl2 2,5mM (Promega), 0,5 pmol dos primers foward e reverse e 1 µL de DNA. Foi utilizado como controle positivo o DNA de uma linhagem de Microcistys aeruginosa produtora de microcistina. As PCRs foram realizadas no termociclador PTC-200 (MJ Research) com o programa a seguir: desnaturação inicial de 94ºC por 5 min, 25 ciclos de (94º 1 min, 47º 30s, 72º 1 min) e 72º por 5 min. Os produtos de reação foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1% em sistema de tampão TAE 1X, corados com brometo de etídeo (Sambrook et al. 2001).
