Identificação microbiana

As extrações de DNA, das treze amostras (1, 2, 2*, 3, 3*, 4, 4*,5, 5*,6, 6*,7 e 7*) crescidas em meio Postgate C modificado acrescido ou não de PP e As foram

-400 -350 -300 -250 -200 -150 -100 -50 0 50 100 2* 2 3* 3 4* 4 5* 5 6* 6* 7* 7

V

al

o

res

d

o

Eh

(mV).

Variações do Eh

43 eficientemente realizadas. Para todas as amostras obtiveram-se quantidades de DNA suficientes para realização de PCR.

A reação de amplificação foi realizada com todos os extratos genômicos das amostras de bactérias adaptadas em diferentes concentrações de arsênio. A amplificação do material genômico utilizando o primer 968FGC/1392 para o Domínio Bacteria foi obtida para todas as 13 amostras. A observação dos géis de agarose a 1,0%, após coloração com Brometo de Etídio indicou o resultado positivo da reação de amplificação de fragmentos do RNA ribossomal 16S.

5.4.1. Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE)

A análise eletroforética (DGGE) foi realizada utilizando-se os produtos amplificados dos fragmentos de DNA ribossomal 16S que revelou o padrão de bandas representada na Figura 5.4, o número de bandas corresponde ao número dos membros predominantes na comunidade bacteriana o que permite inferir sobre a diversidade global de bactérias dentro de cada amostra. Para obter estes resultados diversos experimentos de DGGE foram realizados em diferentes gradientes de desnaturação a fim de obter-se um perfil representativo da diversidade microbiana do Domínio Bacteria das amostras. O melhor perfil de bandas foi obtido no gradiente desnaturante de uréia formamida de 40-60% como representado na figura 5.4. Um total de 7 bandas foram selecionadas, excisadas e sequenciadas a fim de identificar as espécies bacterianas presentes no ambiente.

44 Figura 5.4 - Gel de DGGE, com gradiente desnaturante de 40%-60%, corado em brometo de etídio contendo fragmentos de DNA ribossomal 16S amplificados com

primer universal 968FCG/1392R domínio Bacteria. O número 1 representa a amostra sem arsênio, (2 e 2*), 0,5, (3 e 3*), 1,0; (4 e 4*), 2,0; (5 e 5*), 4,0; (6 e 6*) , 8,0 e (7 e 7*) 16,0mg.L-1 de arsênio. O sinal * representa a presença de pó de penas de galinha (PP) no meio.

45 Os perfis de bandas presentes no gel obtido durante a análise por DGGE em função da concentração de arsênio e à presença de biomassa PP nos cultivos estão representados na tabela 5.2 abaixo.

Tabela 5.2. Distribuição das bandas de material genômico em diferentes condições experimentais. Amostras 1 2* 2 3* 3 4* 4 5* 5 6* 6 7* 7 Concentração de As (III) (mg.L-1₎ Espécies Bandas 0 0,5 0,5 1,0 1,0 2,0 2,0 4,0 4,0 8,0 8,0 16,0 16,0 Cupriavidus metallidurans B1 + + + + + + + + + + + + + Clostridium sp B2 + + + + + Pantoea agglomerans B3 + + + + Citrobacter sp B4 + + + + + + + + + + + + + Enterobacter sp B5 + + + + + + + Burkholderia cepacia B6 + + + + + Bacillus sp B7 +

*Indica adição de biomassa PP ao cultivo

Todas as sete bandas foram excisadas do gel DGGE e reamplificadas novamente utilizando primers para o domínio Bacteria, purificadas e levadas para o sequenciamento. As sequências obtidas foram analisadas nos programas BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e RDP X (Ribossomal Database Project Release 10) (COLE et al., 2009) utilizadas para busca de homologia, similaridade e identidade. O sequenciamento revelou a presença de membros dos filos Proteobacteria e Firmicutes. O primeiro é constituído por organismos que apresentam grande diversidade metabólica e correspondem á maioria das bactérias gram-negativas conhecidas, tendo importância médica, industrial e agrícola. O filo Firmicutes é representado por bactérias na qual a

46 maioria é gram-positiva, Bacillus e Clostridium são os dois gêneros mais estudados, TORTORA, 2005). Os resultados de similaridade das bandas obtidas estão apresentados na tabela 5.3.

Tabela 5.3: Alinhamento das bandas com as sequências depositadas no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) para os fragmentos amplificados pelos primers bacterianos universais (968F-GC 1392R).

Bandas Similaridade Espécie Número de

Acesso

B1 _{99% Cupriavidus metallidurans CP000352}

B2 _{100% Clostridium sp X80841}

B3 _{100% Pantoea agglomerans AM184212}

B4 _{100% Citrobacter sp DQ133536}

B5 _{100% Enterobacter sp EF138627}

B6 _{99% Burkholderia cepacia AY741335}

B7 _{100% Bacillus sp EU584532}

Para construção da árvore (Figura 5.5), foram consideradas as espécies que apresentavam maior porcentagem de similaridade com as sequências obtidas. De maneira geral, os indivíduos sequenciados foram posicionados considerando seus parentes filogenéticos.

47 As propriedades de todos os micro-organismos identificados estão presentes na tabela 5.4.

Tabela 5.4. Propriedades das espécies identificadas.

Sequências Espécies Características Referência

B1

Cupriavidus metallidurans

CP000352

Beta Proteobacteria, gram-negativas, elevado número de genes de resistência a metais pesados. É um organismo modelo interessante para estudar as respostas microbianas a metais pesados.

(MONSIEUS

et al, .2011).

B2 Clostridium

spX80841

Bactérias Firmicutes, Gram-positivas, forma de bastonete, anaeróbios estritos e aerotolerantes. Produzem endósporos, são ubiquitários,

(ANDERSON et al., 2003). B3 Pantoea agglomerans AM184212

Família Enterobacteriaceae, Gram- negativas, anaeróbias facultativas capazes de realizar o metabolismo de redução de sulfato. (QIU et al., 2008). B4 Citrobacter sp DQ133536 Gram-negativas, fermentadoras da família Enterobacteriaceae. Observáveis nos solos, águas, alimentos e esgotos.

(AICKIN & DEAN, 1977)

B5 Enterobacter sp

EF138627

Família Enterobacteriaceae, Gram- negativas, anaeróbias facultativas. Utilizam lactato de sódio como fonte de carbono, ou mesmo o citrato.

(GRIMONT & GRIMONT, 2006). B6 Burkholderia cepacia AY741335

Beta Proteobacterias, gram-negativas, forma de bastonetes. Possuem um extraordinário espectro nutricional, capazes de degradar mais de 100 moléculas orgânicas diferentes.

(YABUUCHI

et al.,1992).

B7 Bacillus sp

EU584532

Bactérias Firmicutes, Gram-positivas, aeróbias ou anaeróbias facultativas. Alta taxa de crescimento, capacidade de secretar enzimas para o meio extracelular.

(SCHALLMY, 2004).

48 Figura 5.5. Árvores filogenéticas contendo sequências do gene DNAr 16S, construídas pelo método Neighbor-Joining e modelo Maximum Composite Likelihood no programa Mega 4.1. Análise de Bootstrap com 1000 réplicas.

Fonte: próprio autor

As espécies Cupriavidus metallidurans e Citrobacter sp. estão presentes em todas as amostras, independentemente da concentração de arsênio empregada, apresentando portanto, resistência considerável a este elemento. Estes organismos são capazes de produzir sulfeto de hidrogênio (BARBOSA, 2009), principal produto no processo de redução dissimilativa de sulfato, corroborando, portanto, para a atividade sulfato redutora das amostras estudadas. Como o sulfeto de hidrogênio é um composto tóxico para muitos micro-organismos, até mesmo para várias espécies de BRS como, as espécies do gênero Desulfotomaculum, que são sensíveis a concentrações de 4 a 7 mM de H2S.L-1 (WIDDEL & PFENNIG,1977; KLEMPS et al., 1985) a presença de H2S no meio pode funcionar como uma estratégia para eliminar outros grupos microbianos,

B1

Cupriavidus metallidurans CP000352 B6

Burkholderia cepacia| AY741335 Bacillus sp EU584532 B7 B2 Clostridium sp. X80841 Desulfovibrio Mlhm; AF193026 70 69 98 98 100 100 0.02 B5 Enterobacter sp EF139627 B4 Citrobacter sp DQ133536 B7

Pantoea agglomerans AM184212 Desulfovibrio AF193026 0 0 0 100 0.02

49 sendo portanto responsável pela seletividade de grupos microbianos, resistentes a este composto (MARTIN et al., 2009), diminuindo assim a competição pelos nutrientes.

A espécie Cupriavidus metallidurans é uma beta proteobacteria capaz de manter em homeostase com os metais sob uma variedade de condições ambientais adversas (MONCHY et al., 2007). Este organismo pode ser encontrado em ambientes com temperatura moderada, contaminados com metais pesados, tais como desertos de zinco da Bélgica (DIELS & MERGEAY, 1990). A espécie Citrobacter sp. pode ser observada nos solos, águas, alimentos e esgotos. Em 1977, Aickin e Dean (AICKIN & DEAN, 1977) descreveram o sistema fosfatase das bactérias do gênero Citrobacter utilizadas em processos biológicos de precipitação dos metais. As espécies Clostridium sp e Burkholderia cepacia, embora não estejam presentes em todas as amostras analisadas, cresceram em alguns frascos contendo baixas, médias e altas concentrações de arsênio no meio. O gênero Burkholderia foi descrito em 1992 por Yabuuchi como parte do Filo Proteobacteria. O gênero ainda precisa ser mais bem caracterizado, pois sua taxonomia vem sendo modificada de tal forma que novos componentes estão sendo frequentemente propostos, especialmente pela identificação de novos nichos ecológicos e sua ação no ambiente.

Estes micro-organismos fazem parte do grupo das Beta Proteobacterias, sendo a espécie Burkholderia cepacia (anteriormente conhecida como Pseudomonas cepacia) a mais conhecida. As bactérias do gênero Burkholderia tornam-se interessantes por possuírem amplo potencial de uso em atividades agrícolas e biotecnológicas. Possuem capacidade de atuarem como promotoras de crescimento em plantas dadas as suas atividades de fixação biológica do nitrogênio e produção de fitormônios; além disso, participam de processos de biorremediação de hidrocarbonetos de petróleo, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, componentes nitroaromáticos solventes industriais, pesticidas e metais (DUA et al., 2002).

As espécies de Clostridium podem ser anaeróbias estritas ou aerotolerantes. São ubiquitários, vivendo no solo, água, flora do trato gastrointestinal do homem e diversos animais, são produtores de amilases para degradação de polissacarídeos a açúcares menores (ANDERSON et al., 2003). A alta resistência destas espécies às condições ambientais extremas pode justificar sua ocorrência na condição de cultivo na qual as maiores concentrações de As (III) foram empregadas. Esta espécie preferencialmente oxida o lactato formando o acetato juntamente com o propionato (BERTOLINI, 2012).

50 O gênero Bacillus sp. foi encontrado somente na amostra com maior concentração de arsênio, 16mg.L-1. Por possuírem muitas características vantajosas, como sua alta taxa de crescimento, menor tempo da fermentação, e principalmente capacidade de secretar enzimas para o meio extracelular, esse gênero vem se tornando bastante importante e atrativo para o setor industrial. Sendo assim, estes micro- organismos constituem uma fonte importante de enzimas extracelulares, dentre elas proteases, amilase e lípases (SCHALLMEY, 2004).

A presença de micro-organismos das espécies Enterobacter sp. e Pantoea

agglomerans foi confirmada nas amostras com baixa, média e alta concentração de arsênio no meio. Embora não haja muitos estudos em relação à redução de sulfato por membros da família Enterobacteriaceae, sabe-se que representantes desta família já foram identificados como capazes de realizar o metabolismo de redução de sulfato (QIU

et al., 2008) e como, o grupo das BRS é polifilético, fazendo parte do mesmo representantes de diferentes famílias do domínio Bacteria; além de algumas do domínio

Archaea é possível que representantes ainda não catalogados de grupos distintos também possuam a capacidade metabólica de reduzir o sulfato à sulfeto.

É valido acrescentar que, devido ao metabolismo de grande parte dos representantes da família Enterobacteriaceae ser anaeróbio facultativo, os enriquecimentos utilizados neste trabalho não seriam capazes de excluí-los. Portanto esses micro-organismos poderiam estar fazendo parte do processo de redução de sulfato. Além disso, representantes do gênero Enterobacter, já foram relatados como capazes de utilizar o lactato de sódio como fonte de carbono, ou mesmo o citrato (GRIMONT & GRIMONT, 2006) presentes no meio de cultivo utilizado. Outra questão importante é a taxonomia deste gênero que é considerada como altamente heterogênea ao se considerar outros representantes da família Enterobacteriaceae (GRIMONT & GRIMONT, 2006). Pode-se citar como exemplo as espécies do gênero Pantoea, que possui várias espécies endofíticas, até pouco tempo identificadas como pertencentes ao gênero Enterobacter, (JANDA, 2006).

Fundamentado nas características metabólicas e enzimáticas dos micro- organismos identificados, é possível inferir que as espécies Pantoea agglomerans,

Enterobacter sp. e Citrobacter sp, pertencentes a família Enterobacteriaceae, participaram da oxidação incompleta do lactato, composto orgânico adicionado ao meio de cultura, produzindo ácidos orgânicos voláteis (AGV), possivelmente o ácido acético.

51 A produção desses ácidos causou o decréscimo do pH do meio logo nos primeiros dias de inoculação dos micro-organismos. A partir daí entram em ação os micro-organimos acidogênicos, neste trabalho representado pelo gênero Clostridium, que utilizam os produtos anteriormente citados produzindo o acetato.

Os micro-organismos pertencentes ao gênero Bacillus e a espécie Burkholderia

cepacia crescem em meios contendo diferentes fontes de carbono, uma vez que apresentam a capacidade de produzirem enzimas hidrolíticas extracelulares, apresentando extrema versatilidade nutricional, podendo participar em mais de uma etapa da oxidação do lactato.

É importante acrescentar que as espécies que se esperava identificar, são as clássicas bactérias redutoras de sulfato que pertencem ao grupo delta proteobactéria, visto que o meio utilizado assim como as condições de cultivo são propícios para o crescimento destas. Porém os resultados da análise da biologia molecular demostrou a presença de outros micro-organismos como citado anteriormente, mas que apresentam características de redução de sulfato e resistência ao arsênio.