UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM ENGENHARIA AMBIENTAL
Mariana Moreira
IDENTIFICAÇÃO DE CONSÓRCIO BACTERIANO COM POTENCIAL
PARA BIORREMEDIAÇÃO DE ARSÊNIO E SULFATO.
Autora: Mariana Moreira
Orientadora: Prof
a. Dr
a. Mônica Cristina Teixeira
Co-orientadora: Prof
a. Dr
a.Silvana de Queiroz Silva
i UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO ENGENHARIA EM ENGENHARIA AMBIENTAL
IDENTIFICAÇÃO DE CONSÓRCIO BACTERIANO COM POTENCIAL
PARA BIORREMEDIAÇÃO DE ARSÊNIO E SULFATO.
Ouro Preto, MG
Abril de 2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte dos requisitos
necessários para a obtenção do título: “Mestre em
Engenharia Ambiental – Área de Concentração:
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
M838i Moreira, Mariana.
Identificação de consórcio bacteriano com potencial biotecnológico para biorremediação de arsênio e sulfato [manuscrito] / Mariana Moreira – 2013. x, 70 f. : il., color.; tab.; mapas.
Orientadora: Profª Drª Mônica Cristina Teixeira.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas e Pós-Graduação em Recursos Hídricos. Programa de Pós-graduação em Engenharia Ambiental. Área de concentração: Tecnologias Ambientais.
1. Biorremediação - Teses. 2. Arsênio - Teses. 3. Sulfatos - Teses. 4. Bactérias - Teses. I. Teixeira, Mônica Cristina. II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Título.
CDU: 628:579.846.2
ii
“Enquanto estivermos tentando, estaremos felizes, lutando pela
definição do indefinido, pela conquista do impossível, pelo limite do ilimitado, pela ilusão de viver. Quando o impossível torna-se um desafio, a satisfação está no esforço, e não apenas na
realização final”
iii
A Deus e a tudo o que Ele representa em minha vida.
Aos meus queridos pais, Elenita e Adelson,
ao meu irmão Júnior e ao meu esposo Carlos meus maiores
tesouros, exemplos de simplicidade, força de
vontade e luta. A vocês todo meu trabalho,
iv
Agradecimentos
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus por proporcionar inúmeras oportunidades, por iluminar meus passos e facilitar minha trajetória dentro da universidade, sempre apresentado solução nos momentos difíceis.
A professora orientadora Mônica Cristina Teixeira por ter me acolhido em seu laboratório, por toda confiança depositada em mim nestes anos de trabalho. Obrigada pela orientação, pelas excelentes discussões científicas e profissionais, pelos conselhos, pelo apoio intelectual e profissional. Obrigada por acreditar em mim e no meu trabalho.
A professora co-orientadora Silvana de Queiroz Silva por me receber em seu Laboratório. Obrigada pelas excelentes discussões, e por ter me ensinado a fazer alguns experimentos.
Agradeço as minhas colegas de trabalho do laboratório de Biotecnologia Ambiental, Patrícia Freitas e Letícia Paiva pela amizade construída e pela ajuda incondicional. Obrigada por terem me ajudado nos primeiros experimentos, pelas constates discussões a cerca dos resultados.
A toda equipe do Laboratório de Biologia e Tecnologia de Micro-organismos - DECBI/UFOP: professores, alunos e técnicos. Em especial a aluna Júlia por ter dedicado parte do seu tempo para me ajuda nos experimentos, na produção dos reagentes, pelo companheirismo, enfim, obrigada por tudo.
Agradeço também a Keice, Natália e a Izabel pela amizade construída, e por ter de alguma forma me ajudado, seja com os ensinamentos repassados, ou com os reagentes emprestados.
A toda minha família, que sempre me apoiaram e em particular aos meus pais Adelson e Elenita e ao meu irmão Júnior pelo apoio e carinho em todos os momentos. Agradeço também o meu marido Carlos César pelo incentivo, atenção, e pela ajuda constante nas horas difíceis.
Agradeço também ao Programa de Pós Graduação em Engenharia Ambiental, PROAMB, e a todos os professores pelo suporte e por complementar minha formação.
v
Sumário
AGRADECIMENTO iv
SUMÁRIO v
LISTA DE FIGURAS vii
LISTA DE TABELAS viii
RESUMO ix
ABSTRACT x
1. Introdução 1
2. Objetivos 3
2.1 Objetivos Gerais 3
2.2 Objetivos Específicos 3
3.0 Revisão Bibliográfica 4
3.1 Arsênio 4
3.2 Tratamento de águas contaminadas por arsênio 7
3.3 Remoção do sulfato de águas contaminadas 9
3.4 Bactérias redutoras de sulfato 17
3.5 Biorremediação de áreas contaminadas por metais 20
3.6 Identificação molecular de micro-organismos 21
4. Materiais e Métodos 25
4.1 Área de coleta 25
4.2 Cultivo das amostras 26
4.3 Avaliação da resistência da composição microbiológica do sedimento coletado ao arsênio
27
4.4 Identificação microbiana pelo método PCR-DGGE 30
4.4.1Preparação das amostras 30
4.4.2 Extração de DNA das amostras 30
4.4.3 Amplificação do DNA por PCR 31
4.4.4 Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE) 32
4.4.5 Análise das sequências genômicas 34
4.5 Caracterização e identificação dos precipitados formados 34
5. Resultados e Discussão 37
5.1 Enriquecimento e adaptação das amostras 37
vi 5.3 Variação do Potencial de redução e pH inicial do meio 41
5.4 Identificação microbiana 42
5.4.1. Eletroforese de gel de agarose (DGGE) 43
5.5 Caracterização do precipitado formado 51
6. Conclusões 55
7. Perspectivas futuras 57
8. Referências Bibliográficas 58
vii
Lista de Figuras
Figura 3.1 Representação esquemática do ciclo do enxofre. 10
Figura 3.2 Representação esquemática da redução assimilativa do sulfato. 15
Figura 3.3 Representação esquemática da transferência de elétrons na redução dissimilativa do sulfato, com compostos carbônicos como fonte de energia e sulfato como aceptor de elétrons.
16
Figura 4.1. Vista da lagoa do Gambá, cidade de Ouro Preto – MG. 25
Figura 4.2. Esquema envolvendo os processos de enriquecimento, adaptação e fase dos ensaios de remoção de sulfato e arsênio, realizados neste trabalho.
28
Figura 5.1. Ensaio de adaptação do consórcio bacteriano ao cultivo. (a) Início do cultivo e (b) meio de cultura enegrecido devido à formação de sulfeto ferroso, resultado do crescimento da cultura.
38
Figura 5.2. Enriquecimento do consórcio bacteriano nas amostras em meio líquido Postgate C“modificado”. (a) Enriquecimento e cultivo das amostras e (b) crescimento das culturas de BRS.
39
Figura 5.3. Variação do potencial de redução do meio no cultivo em presença
de arsênio. 42
Figura 5.4. Gel de DGGE, com gradiente desnaturante de 40%-60%, corado em brometo de etídio contendo fragmentos de DNA ribossomal 16S amplificados com primer universal 968FCG/1392R domínio Bacteria.
44
Figura 5.5 Árvore filogenética contendo sequências do gene DNAr 16S (1376 pb) construída pelo método Neighbor-Joining e modelo Maximum Composite Likelihood no programa Mega 4.1. Análise de Bootstrap com 1000 réplicas.
48
Figura 5.6 Imagem no MEV do precipitado presente nas amostras. A) Amostra 1 com 0,0 g/L-1 de arsênio. B) Amostra 3 com 1,0 g/L-1 de arsênio. C) Amostra 4 com 2,0 g/L1 de arsênio. D) Amostra 5 com 4,0 g/L-1 de arsênio, E) Amostra 6 com 8,0 g/L-1 de arsênio. F) Amostra 7 com 16,0 g/L-1 de arsênio.
viii Lista de Tabelas
Tabela 4.1. Composição do meio de cultura Postgate C modificado por Cheung
e Gu (2003). 26
Tabela 4.2. Concentração de As3+ em diferentes amostras 28
Tabela 4.3. Componentes utilizados na reação de PCR 32
Tabela 5.1. Tempo de escurecimento do meio em relação à concentração de
As(III) 40
Tabela 5.2. Distribuição das bandas de material genômico em diferentes condições experimentais.
45
Tabela 5.3. Alinhamento das bandas com as sequências depositadas no GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov) para os fragmentos amplificados pelos primers bacterianos universais (968F-GC 1392R).
46
ix
Resumo
x
ABSTRACT
1
1. Introdução
Diversas indústrias, como as de processamento de metais, geram efluentes contendo metais e outros poluentes inorgânicos como o sulfato. Estes efluentes são altamente prejudiciais para o ambiente e para o homem, dado que os metais podem acumular ao longo das cadeias alimentares. Sendo assim, devem ser tratados antes de serem lançados no ambiente (HIGGINS et al., 2003). Os processos de remoção de metais pesados geralmente utilizados, como a precipitação química, a troca iônica ou a separação por membranas apresentam por vezes restrições de ordem técnica (não sendo eficazes para a diminuição do sulfato) ou econômica pelo elevado custo. Desta forma, os processos biotecnológicos representam uma alternativa de tratamento com custos mais reduzidos e mais eficientes na remoção destes compostos (CARLOS et al., 2007).
Nas últimas décadas, houve uma crescente conscientização, a nível global, sobre o uso racional dos recursos naturais e o desenvolvimento de tecnologias menos impactantes ao meio ambiente. O modelo atual de “desenvolvimento sustentável” tem gerado uma série de discussões multidisciplinares entre pesquisadores, acadêmicos e sociedade devido à dificuldade em se estabelecer um equilíbrio entre o crescimento econômico e populacional sem comprometer o ambiente natural (BARBOSA, 2009). A contaminação ambiental por metais e sulfato tem sido objeto de diversas discussões e iniciativas. As águas residuais das indústrias de mineração e metalurgia são consideradas como as principais fontes de contaminação ambiental por metais como o arsênio (SMEDLEY & KINNIBURGH, 2002). Níveis de arsênio relativamente altos são também encontrados ocasionalmente em fontes de água de abastecimento municipais superficiais e subterrâneas, possivelmente devido à lixiviação de minerais associados aos depósitos minerais. O íon sulfato ocorre na natureza em decorrência de processos biogeoquímicos e também pelo lançamento de efluentes de diversos processos industriais, uma vez que vários processos produtivos são responsáveis por altas cargas de sulfato em seus efluentes (LENS, 1998).
2 que contenham estes grupamentos em seus sítios ativos, bloqueando a respiração celular (TSALEV & ZAPRIANOV, 1985). Segundo Hughes (HUGHES 2002) a contaminação por arsênio pode provocar problemas gastrointestinais como naúseas. Além disso, o arsenato compete com fosfato pelos sítios ativos das enzimas fosforilativas, comuns a todos os seres vivos e essenciais ao metabolismo da glicose.
Com relação ao sulfato, sua presença na água pode causar gosto amargo, provocar diarreia e desidratação, tanto no homem quanto nos animais e ainda causar problemas de corrosão em tubulações (LENS, 1998).
Em vista disso, torna-se necessário o desenvolvimento de metodologias eficientes e economicamente viáveis para o tratamento e remoção desses elementos. Garantir a qualidade da água de consumo, no que diz respeito aos teores de arsênio e demais metais tóxicos é, portanto, condição necessária à manutenção da saúde das populações.
A utilização de técnicas de biologia molecular na identificação de micro-organismos para estudos de biotecnologia e biorremediação vem se destacando na última década. Os micro-organismos representam o maior reservatório de diversidade genética e bioquímica do planeta. Apesar de sua grande importância na manutenção da biosfera, estima-se que menos de 10% dos micro-organismos existentes no planeta tenham sido caracterizados e descritos (STALEY, 1998).
O grupo das bactérias redutoras de sulfato é bastante difundido na natureza podendo ser encontrado tanto no ambiente aquático quanto no ambiente terrestre, mas ocorre principalmente em sedimentos, onde as condições redutoras são mais favoráveis. Estas oxidam compostos orgânicos simples (CH2O), acetato e lactato e reduzem
compostos oxidados de enxofre produzindo sulfeto de hidrogênio e íons bicarbonato causando, em geral, a precipitação dos metais e a neutralização do pH do meio aquoso (LENS, 1998).
3
2. Objetivos
2.1 Gerais
Cultivo e identificação de um consórcio bacteriano tolerante ao arsênio e capaz de reduzir sulfato.
2.2 Específicos
Avaliar a capacidade de crescimento do consórcio bacteriano em diferentes concentrações de arsênio utilizando meio Postgate C modificado, e como fonte de carbono o lactato de sódio.
Verificar a influência da adição de um meio suporte sólido no (pó de penas de galinhas) no crescimento microbiano
Comparar e identificar as bactérias nos diferentes ensaios pela técnica PCR-DGGE.
Caracterizar o perfil filogenético dos fragmentos amplificados 16s DNA do consórcio bacteriano obtido.
Avaliar a dinâmica bacteriana em ensaios com adições crescentes de arsênio pela técnica PCR-DGGE
4
3. Revisão bibliográfica
3.1 Arsênio
A despeito das fontes naturais de contaminação por arsênio, como, os fenômenos geotermais e vulcânicos, a poluição por metais é causada principalmente pelas atividades industriais e da agricultura (BORBA et al., 2004), e pela própria atividade de mineração. No Brasil, o arsênio é amplamente encontrado no meio industrial, como resíduo, especialmente das indústrias de processamento metalúrgico de ouro, cobre, prata, zinco e cobalto. Este elemento é empregado ainda como matéria-prima na manufatura de vidros, esmaltes, tintas, tecidos e couros e na produção de insumos agrícolas tais como inseticidas, formicidas, herbicidas e preservativos de madeira. O consumo de arsênio pela indústria é, entretanto, insignificante diante das enormes quantidades desse elemento produzidas como resíduos industriais (TEIXEIRA, 2005).
O arsênio ocorre no meio ambiente nos estados de oxidação -3, 0,+3 e +5, sendo a forma trivalente dez vezes mais tóxica que sua forma pentavalente, e ainda apresenta uma mobilidade no meio ambiente significativamente maior (RAWLINS et al., 1997).
O arsênio é altamente tóxico, mesmo em baixas concentrações para plantas e mamíferos (MCBRIDE, 1989). A exposição humana a arsênio pode resultar em desenvolvimento de câncer de pele, de pulmão, de fígado, de bexiga e rins (BASU et al., 2001).
A inalação de arsênio pode causar principalmente carcinomas de pulmão. Uma vez ingerido, produz sintomas de irritação gastrointestinal e náuseas. Em longo prazo, a ingestão continuada, ainda que de pequenas quantidades deste elemento, leva a manifestações crônicas cutâneas, doenças do aparelho respiratório, diabetes, distúrbios vasculares, neurológicos e câncer (TEIXEIRA, 2005).
5 (PO4³-) e assim, sua principal toxicidade resulta da interferência com o metabolismo
desse maior bioelemento, que é o fósforo. O arsenato compete com fosfato pelos sítios ativos das enzimas fosforilativas, comuns a todos os seres vivos e essenciais ao metabolismo da glicose, causando bloqueio ou perda de produtividade em diversas rotas
metabólicas, através da formação de compostos de carboidrato “arsenilados” ao invés
dos intermediários fosfatados esperados. Do ponto de vista funcional, o efeito tóxico do arsenato, equivale à supressão do aporte nutricional de fosfato (KAUR & ROSEN, 1992).
Com base em todas as evidências que relacionam a ocorrência de efeitos toxicológicos crônicos e a ingestão de água contaminada por arsênio, vários órgãos governamentais de controle ambiental recomendam a redução nos limites máximos admissíveis para arsênio em água potável. A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomendou, em 1993, que o limite de 50 μg.L-1 fosse reduzido para 10μg.L-1. No caso da Comunidade Européia e do Japão, estes novos valores foram adotados. No Canadá o limite é de 25μg.L-1 e nos Estados Unidos, após uma resistência inicial em adotar as recomendações da OMS em função dos custos financeiros envolvidos (SMEDLEY et al., 2002), a legislação foi alterada. A legislação ambiental brasileira também adotou a recomendação da OMS e os novos limites passaram a vigorar a partir de dezembro de 2003, (Portaria MS 2.914/2011). O contato direto com água potável contendo concentrações de arsênio inferior a 50 μg.L-1 foram associados a percussores de câncer de pele, enquanto que concentrações superiores a este valor têm sido associadas ao aumento do risco de câncer na bexiga e pulmão. (IPCS, 2001). A dose de Arsênio letal para humanos é da ordem de 0,6 mg/kg/dia (http: http://rais.ornl.gov/tox/profiles/arsenic.html) ou de 1-3 mg/kg, em se tratando exclusivamente de As inorgânico (HUGHES, 2002)
No solo, o arsênio pode ser originário de fontes naturais ou antropogênicas (pesticidas, herbicidas, fertilizantes), pode ser liberado durante a mineração e fundição do ouro, chumbo, cobre e níquel, produção de ferro e aço, combustão de carvão (SMITH et al., 1998); (BAIRD, 2002) e irrigação com água contaminada (ROYCHOWDHURY et al., 2002).
6 Preto e Mariana, apresentaram concentrações de arsênio variando entre 2 a 2.980 µg.L-1, sendo que, na maioria das amostras, os valores são superiores ao valor máximo permitido para consumo humano que é de 10 µg.L-1 (BRASIL, 2005) de arsênio (PIMENTEL et al., 2003). É, portanto, necessária uma avaliação em longo prazo dos efeitos resultantes dessa contaminação sobre as populações dessas regiões que utilizam, direta ou indiretamente, água contaminada por arsênio e que estão constantemente submetidas à absorção, por meio da aspiração, de partículas finas dispersas na poeira. Do ponto de vista da saúde das populações, em trabalho recente e pioneiro, um grupo de pesquisadores, brasileiros e alemães, (MATSCHULLAT et al., 2000) realizou um levantamento epidemiológico sobre os índices de contaminação arsenical em material biológico, principalmente, urina, de crianças residentes dos municípios de Santa Bárbara e Nova Lima. Os resultados obtidos indicavam que aproximadamente 45% das crianças examinadas, com idades ente 7-14 anos, apresentavam níveis de arsênio na urina de 15-40 μL.L-1, sendo que 20% delas apresentavam índices maiores que 40 μL.L - 1 podendo, portanto, serem classificadas, respectivamente, dentro dos grupos considerados de médio e alto risco, embora ainda não tenham sido observados os efeitos fisiopatológicos da intoxicação por esse elemento.
No que concerne à bioquímica do arsênio, sabe-se que o arsênio inorgânico ingerido é rapidamente absorvido pelo trato gastrointestinal. O As absorvido é transportado através do sangue, ligado a grupamentos SH das proteínas ou compostos de baixo peso molecular como a glutationa e a cisteína até os órgãos do corpo, principalmente o fígado, onde sofre reações de metilação que diminuem sua toxicidade. A metilação envolve a adição de grupamentos metila, doados pela S-adenosilmetionina, ao arsênio, apenas em seu estado trivalente.
Os metais representam um fator de estresse à comunidade microbiana presente no ambiente impactado, podendo, inibir completamente as atividades metabólicas dos organismos. O arsênio ocorre em diversos estados de oxidação -3, 0, +3 e +5. Em águas naturais, o arsênio está presente principalmente na forma de compostos inorgânicos, com valências 3+ e 5+ (LIÈVREMONT et al., 2009). Em meio aquoso, o As pode ser encontrado sob a forma de arsenito (AsO33-) e arsenato (AsO43-), referindo-se,
7 interior das células podem interferir em atividades metabólicas essenciais para os organismos.
Bactérias resistentes ao arsênio possuem um complexo genético de resistência, o gene arsC, que codifica a enzima As5+ redutase, responsável pela biotransformação de As5+ em As3+,que por sua vez é transportado para o meio extracelular pela ação das proteínas transportadoras ArsA e ArsB, codificada pelos seus respectivos genes de resistência. Como exemplo de micro-organismos que apresentam tais genes, podemos citar, as espécies Desulfotomaculum auripigmentum que reduz o As5+ em As3+ (NEWMAN et al., 1997), as espécies Staphylococcus aureus e Escherichia coli que apresentam o gene que confere resistência ao arsênio e capacidade de reduzir o As5+, (JI et al., 1992). Algumas bactérias têm seus mecanismos de oxidação do As3+ ou redução do As5+ conhecidos, bem como a geração de energia envolvida nesses processos (LIAO et al., 2011).
As bactérias que utilizam os íons arsenato no processo de respiração anaeróbia, (bactérias redutoras de arsenato) apresentam o gene arr que codifica a enzima As5+ redutase que reduz o As5+ a As3+. As bactérias oxidantes de arsenito possuem o gene aox que codifica a enzima As3+ oxidase, responsável pela oxidação do As3+ a As5+ (LIÈVREMONT, 2009). Recentemente, outro gene que codifica uma As3+ oxidase foi identificado no micro-organismo Alkalilimnicola ehrlichii, um quimiolitoautótrofo que oxida arsenito e reduz nitrato simultaneamente (ZARGAR et al., 2010). Muitos estudos mostraram o sucesso no uso de marcadores genéticos para o estudo dos mecanismos de transformação do arsênio, como: os genes arsB e arsC contidos no operon que garante a resistência ao metalóide (ACHOUR et al., 2007), o gene arrA na respiração dissimilatória do As 5+ e o gene aoxB para oxidação do As 3+ (HAMAMURA et al., 2009).
Dessa maneira pode-se perceber que na natureza, os micro-organismos podem lidar com toxicidade do arsênio de várias maneiras diferentes, dentre as quais podemos citar: precipitação, quelação, transformação bioquímica, (TSAI et al., 2009).
3.2 Tratamento de águas contaminadas por Arsênio
8 1999); (KAPPOR & VIRARAGHAVAN, 1995), osmose reversa (KAPPOR & VIRARAGHAVAN, 1995), oxidação e redução, filtração, tratamento eletroquímico, evaporação ou, extração por solventes. No entanto, o custo destes processos é muito elevado (VEGLIO & BEOLCHINI, 1997). Métodos como, precipitação química e extrações por solventes, empregam uma grande quantidade de reagentes químicos que, se por um lado solucionam um problema, por outro criam outro relativo aos rejeitos gerados. Os processos de precipitação química são amplamente utilizados industrialmente e desempenhados à temperatura e pressão ambientes. Os íons metálicos em solução são convertidos a hidróxidos insolúveis após a adição de agentes precipitantes como, os hidróxidos de cálcio ou sódio. Eficiências elevadas de remoção de metais, na faixa de 94 a 99%, são obtidas no tratamento de despejos contendo íons cádmio, cobre, cromo trivalente, ferro, manganês, níquel, chumbo e zinco (PALMER, 1988), porém este processo não apresenta capacidade satisfatória de remoção de íons sulfato.
Outros processos empregados na remoção de metais são a floculação e a coagulação, nos quais ocorre a adição de um composto químico a fim de facilitar a sedimentação das partículas sólidas presentes em suspensão. O sucesso do processo está intimamente relacionado às características de floculação e sedimentação das partículas. Este processo é amplamente empregado, apresentando eficiências na faixa de 50 a 98% para remoção de chumbo, zinco, cádmio, manganês, cobre e níquel (PALMER, 1988).
Os processos físicos químicos citados anteriormente na remoção do arsênio, além de apresentarem alto custo, na maioria das vezes geram outros resíduos sólidos e por isso há um grande interesse nos processos biotecnológicos que utilizam as bactérias redutoras de sulfato (BRS) visto que o sulfeto produzido pelo metabolismo desses microrganismos é capaz de se ligar à cátions metálicos, bi e trivalentes produzindo os sulfetos metálicos correspondentes.
Dentre as bactérias capazes de sobreviver em ambientes com alta concentração de arsênio, podemos citar as que pertencem ao gênero Desulfosporosinus, (BATTAGLIA-BRUNET et al., 2012). Pseudomonas mendocina, Pseudomonas
9 A utilização dos micro-organismos apresentam vantagens em relação às propriedades químicas dos hidróxidos metálicos (LENS et al., 2007), pois os sulfetos metálicos, em geral, tem solubilidade muito limitada e podem ser recuperados e reutilizados. Algumas indústrias já vêm aplicando a imobilização de metais através da formação de sulfetos metálicos após a redução de sulfato.
A precipitação do arsênio na forma de sulfetos pelas BRS vem sendo estudada com o objetivo de retirar este elemento perigoso de efluentes. (TECLU et al., 2008), em seu trabalho de biorremediação de águas contaminadas por arsênio, obteve crescimento de BRS utilizando o melaço como fonte de matéria orgânica necessária para o seu crescimento. A tolerância ao arsênio pelas BRS foi testada utilizando-se soluções de arsenito e arsenato.
Outras alternativas para remoção de arsênio em águas contaminadas são discutidas pro Lizama (LIZAMA et al., 2011) e Neculita (NECULITA et al.,2007), O
primeiro discutea construção de “Wetlands” (alagados artificiais) que apresentam um
grande potencial para remoção de metais, em geral, e arsênio. A remoção pode ocorrer por precipitação e adsorção sendo influenciada por fatores ambientais tais como pH, presença de outros constituintes químicas e a presença de micro-organismos redutores, responsáveis por manter um valor de potencial redox do meio menor que – 200mV levando à precipitação do arsênio sob a forma de sulfetos arsenicais insolúveis. O segundo autor discute a remoção do arsênio de drenagens ácidas de minas (DAM) utilizando biorreatores e suas limitações devido ao fato de ainda não ter sido devidamente elucidado o mecanismo de remoção poderia se dar tanto por adsorção quanto por co-precipitação com outros metais, ou ainda pela remoção na forma de sulfetos de arsênio que pode ocorrer em ambientes redutores.
3.3 Remoção do sulfato de águas contaminadas.
10 & CYPIONKA, 1995), um esquema resumindo o ciclo do enxofre e a participação dessas bactérias está representado na figura 3.1.
Figura 3.1. Representação esquemática do ciclo do enxofre.
Fonte: Extraído e adaptado de Tang et al. (2009).
Os compostos orgânicos, podem tanto ser utilizados como fontes de elétrons, ou seja, fonte de energia, quanto como fonte de carbono para a biossíntese celular pelos micro-organismos heterotróficos, aqueles que necessitam de fontes orgânicas de carbono e energia. A grande maioria das Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS) é heterotrófica entretanto, algumas espécies utilizam H2 como fonte de energia e podem
ainda utilizar o CO2 dissolvido no meio como fonte de carbono, sendo consideradas,
portanto, autótrofas (MADIGAN et al., 2004).
11 de sódio, um substrato amplamente utilizado pelas BRS, pode seguir duas vias de oxidação representadas pelas reações 3.5 e 3.6, (GIBSON, 1990). Algumas espécies podem oxidá-lo completamente até CO2, mineralizando-o, ou parcialmente,
convertendo-o a acetato. Essas distinções se referem a grupos fisiológicos e não sistemáticos (MARTIN et al., 2009).
2CH3CHOHCOO- + SO42- 2CH3CHOO- + 2HCO3 + HS- + H+ (Reações. 3.5) ΔG0´= - 160kJ/mol sulfato 2CH3CHOHCOO- + 3SO42- 6HCO3 + 3HS- + H+ (Reações. 3.6)
ΔG0´= - 85kJ/mol sulfato
O íon sulfato ocorre na natureza em decorrência de processos biogeoquímicos que fazem parte do ciclo do enxofre e também em efluentes resultantes de diversos processos industriais, uma vez que vários processos produtivos como, galvanoplastia, indústria de papel e celulose, pigmentos industriais, borracha, explosivos, fertilizantes e a mineração/metalurgia são responsáveis por altas cargas de sulfato em seus efluentes. (LENS, 1998); (SARTI et al., 2008).
A resolução CONAMA 357/2005 (BRASIL, 2005) não determina padrões de lançamento de sulfato em corpos hídricos, dispõem apenas sobre o os teores deste íon nos corpos receptores, os quais não devem apresentar concentração de sulfato maior que 250mg.L-1. Lembrando que o lançamento de efluentes não deve descaracterizar o corpo receptor, portanto, um efluente contendo sulfato quando lançado em um corpo hídrico não deve torná-lo com uma concentração maior que 250mg.L-1. Os processos físico-químicos utilizados para remoção de sulfato incluem desde alternativas de baixo custo, como a precipitação com sais de cálcio, a processos mais caros como osmose reversa, eletrodiálise e nanofiltração (SARTI et al., 2008). Os processos de precipitação podem ser executados com compostos de cálcio, chumbo, bário, alumínio, entre outros. Entretanto, estas opções podem apresentar sérios problemas. A utilização de chumbo e bário, dois metais pesados, para remover sulfato é claramente desaconselhada. A precipitação com cálcio forma gesso (CaSO4.2H2O), que é relativamente solúvel em
12 processos têm o custo proporcional à concentração de sulfato, de forma que altas concentrações chegam a inviabilizá-los. Em vista disto, os processos biológicos de remoção de sulfato têm se tornado bastante atrativos (KAKSONEN et al., 2003).
A principal rota de remoção de enxofre em ambientes aquáticos ou alagados é por meio da redução biológica do sulfato a sulfeto, processo realizado pelas Bactérias Redutoras de Sulfato (BRS) (GIBSON, 1990), dentre elas a espécie Geobacter metallireducens (NEVIN et al., 2000). Além dessa espécie alguns dos membros da família Enterobacteriaceae, já foram identificados como sendo capazes de realizar o metabolismo de redução de sulfato (QIU et al., 2008) e (SAHRANI et al., 2008) . Cabrera et al. (2006) descreveram uma cepa de D. vulgaris com potencial de 40% de redução de sulfato. A família Thermodesulfobiacea apresenta um único gênero, Thermodesulfobium, capaz de crescer quimioautotroficamente com H2/CO2 com sulfato como aceptor de elétrons (Mori et al., 2003). As Archaeas termófilas constituem dois grupos de microrganismos redutores de sulfato, classificados como filos Euryarchaeota e Crenarchaeota. Porém as famílias Desulfovibrionaceae e Desulfobacteriaceae agrupam a maioria das espécies que fazem a redução do sulfato e o gênero mais estudado deste grupo é o Desulfovibrio, devido principalmente a sua ampla distribuição geográfica e facilidade de cultivo em condições laboratoriais (Scheid e Stubner, 2001).
O metabolismo das BRS é dependente da redução de sulfato, e este processo inicia-se após a entrada do sulfato endógeno no interior da célula. Uma vez dentro da célula a redução do sulfato se dá pela ação da ATP sulfurilase que se liga ao sulfato e ao ATP produzindo adenosina fosfossulfato (APS), bem como pirofosfato, que pode ser clivado posteriormente a fosfato inorgânico. O APS é então rapidamente convertido em sulfito (SO3-) pela enzima citoplasmática APS redutase (CYPIONKA, 1995).
O sulfito pode ser reduzido a sulfeto por diferentes sulfito redutases. Dentre as enzimas mais conhecidas estão bissulfito redutase, desulfoviridina e desulforubina (LEE et al., 2008). A redução assimilativa do sulfato, na qual ocorre o transporte do sulfato pela membrana para o interior da célula, apresenta as seguintes etapas descritos abaixo e ilustrados na figura 3.2.
13
Este transporte de sulfato intracelular é facilitado por um sistema de transporte tipo ABC, que requer gasto energético, envolvendo a utilização de 1 mol de ATP por mol de sulfato transportado. O sulfato é fosforilado a adenosina-5`-fosfosulfato (APS) pela ATP sulfurilase, consumindo energia (ATP) e produzindo pirofosfato (PPi) (KRAMER & CYPIONKA, 1995).
A APS formada pode ser reduzida a sulfeto por duas vias, dependendo das características bioquímicas do organismo (GILMORE et al., 1989): uma via de
redução direta de APS (via APS) e uma via de fosforização a 3’-fosfoadenosina -5´-fosfosulfato (via PAPS) . A via para síntese de cisteína a partir da APS pelos procariotas, fungos e organismos fotossintetizante é peculiar a cada grupo, em algumas espécies podem ser empregadas ambas as vias (KOPRIVA & KOPRIVOVA, 2005). Contudo, a via PAPS é comumente utilizada pelos procariotas para a assimilação de sulfato (BICK et al., 2000).
A redução direta de APS a sulfito é realizada a partir da doação de elétrons de um grupo tiolato. Neste mecanismo, um ânion tiolato (glutationina ou tireodoxina) se liga ao grupo sulfonato da APS, para produzir tiossulfonato orgânico e AMP (RABUS, 2006). O tiosulfonato orgânico é reduzido a sulfito e posteriormente a sulfeto por uma sulfito redutase (KOPRIVA & KOPRIVOVA, 2005).
Na via de formação de PAPS um grupo fosforila é envolvido em uma reação catalisada por uma APS quinase, produzindo PAPS e ADP . A PAPS é reduzida a sulfito pela PAPS redutase, produzindo adenosina-3’-5’-difosfato (PAP como subproduto) (SEKOWSKA et al., 2000).
Subsequentemente, o sulfito é reduzido a sulfeto por um sulfito redutase dependente de NADPH. O sulfeto gerado é imediatamente incorporado a síntese do aminoácido cisteína pela Oacetilserina sulfidrilase, sem perda de sulfeto para o meio extracelular (SHEN & BUICK, 2004). A cisteína formada será precursora do aminoácido metionina e de alguns cofatores enzimáticos (como coenzima A), de acordo com as características metabólicas do organismo.
Já a redução dissimilativa do sulfato, apresenta as seguintes etapas:
14 das BRS (CYPIONKA, 1995). Neste processo não há gasto energético, contudo quando em baixas concentrações de sulfato no meio, ATP pode ser consumido para produzir um gradiente iônico favorável para o transporte de sulfato (KREKELER & CYPIONKA, 1995).
A ativação do sulfato ocorre da mesma forma como ocorreu na redução assimilativa. Havendo produção de adenosina-5’-fosfosulfato (APS), e produção de pirofostato, que será hidrolisado por uma pirofosfatase. Essa enzima interfere na atividade da ATP sulfurilase, favorecendo a formação de APS (CYPIONKA, 1995). Enquanto que APS formado é o aceptor de elétrons imediato, sendo convertido a sulfito e AMP. Esta reação é catalisada por uma redutase (APS redutase), encontrada em várias espécies de BRS (KRAMER & CYPIONKA, 1995). O AMP formado é convertido em duas moléculas de ADP por uma adenil quinase dependente de ATP.
15 Figura 3.2 – Representação esquemática da redução assimilativa do sulfato.
16 Figura 3.3 – Representação esquemática da transferência de elétrons na redução dissimilativa do sulfato, com compostos carbônicos como fonte de energia e sulfato como aceptor de elétrons.
17
3.4 Bactérias redutoras de sulfato
As bactérias redutoras de sulfato (BRS) constituem um grupo morfologicamente e filogeneticamente heterogêneo que inclui bactérias e arqueobactérias. São bactérias anaeróbias, mas conseguem sobreviver na presença de oxigênio, maioritariamente gram negativas, mesofílicas e algumas termofílicas, geralmente não formadoras de esporos. Segundo (RABUS et al., 2006) existem cinco importantes atributos referentes ao metabolismo das BRS que são explorados na maioria dos estudos realizados atualmente: 1. O metabolismo de sulfato a sulfeto que é bioquimicamente mais complexo do que a redução do oxigênio pelas bactérias aeróbias;
2. A ampla variedade de compostos orgânicos que podem ser utilizados pelas BRS como fontes de carbono e energia;
3. O fluxo que ocorre entre doadores e aceptores de elétrons associado à cadeia respiratória e que envolve uma grande quantidade de carreadores;
4. A capacidade de alguns grupos de síntese celular utilizando CO₂ durante seu crescimento na presença de H₂ e sulfato;
5. A regulação do metabolismo, que é o aspecto menos explorado entre os grupos de BRS.
Bactérias Redutoras de Sulfato é uma designação usual para alguns grupos bacterianos de vida livre. São organismos que utilizam formas oxidadas de enxofre, ao invés do oxigênio, como aceptor final de elétrons, produzindo com esta reação o sulfeto,
tal processo é denominado de “respiração do sulfato” ou também de redução
dissimilativa do enxofre (MADIGAN et al., 2009). Essas bactérias fazem parte de um grupo distinto de micro-organismos presentes em uma grande variedade de ambientes anaeróbios (KRUMHOLZ et al., 2002).
18 tolueno, benzeno e hidrocarbonetos poliaromáticos e (d) apresentarem alguma tolerância ao oxigênio, apesar de serem anaeróbias (LENS, 1998).
A participação das BRS é indispensável nos processos de alteração dos compostos orgânicos no ciclo geoquímico do carbono (BAUMGARTNER, 2006). As BRS são as principais responsáveis pela mineralização da matéria orgânica em sedimentos marinhos, respondendo por aproximadamente 80% da oxidação do carbono (CANFIELD & THAMDRUP, 1996). A oxidação desses compostos está vinculada a redução do sulfato nos processos bacterianos de respiração anaeróbia. A presença de BRS com alta atividade metabólica é facilmente reconhecida pelo enegrecimento da água ou dos sedimentos devido a precipitação do sulfeto de ferro (FeS), e pelo odor característico de sulfeto de hidrogênio (H2S).
O crescimento dessas bactérias em cultivos laboratoriais em regime de batelada é frequentemente não exponencial, raramente referencia-se na literatura seu tempo de duplicação. No entanto, existem alguns trabalhos, que relatam que micro-organismos produtores de acetato, como é o caso da maioria das espécies de Desulfovibrio e Desulfotomaculum, parecem ser capazes de apresentar tempos de duplicação em torno de 3 a 6 horas ou até menos a 30oC, enquanto aqueles consumidores de acetato, como as espécies de Desulfobacter, crescem mais lentamente, com tempos de duplicação em torno de 20 horas (POSTGATE, 1984).
As BRS em condições anaeróbias reduzem o sulfato, presente nos efluentes a sulfeto que reage com os metais precipitando-os em sulfetos metálicos insolúveis. Este processo favorece a remoção dos metais pesados numa forma mais estável, juntamente com a diminuição do sulfato e dos compostos orgânicos dos efluentes, sendo um processo com baixo consumo energético (HIGGINS et al., 2003; CARLOS et al., 2007). As BRS contribuem para manutenção da baixa pressão de hidrogênio, pois podem utilizá-lo como fonte de elétrons podendo favorecer a atividade das bactérias fermentativas e acetogênicas.
19 As BRS apresentam ubiquidade. Essas bactérias são facilmente encontradas em ambientes marinhos, estuários, sedimentos e lagos salinos ou hipersalinos, por conterem altas concentrações de sulfato. Porém, já foram encontradas BRS ativas em ambientes não salinos e em água doce. Também é relatada a presença de BRS em ambientes poluídos como, plantas de purificação anaeróbia, alimentos deteriorados, plantas de lodo, águas de campos de exploração de óleo, ambientes contaminados com hidrocarbonetos e com compostos halogenados, etc, (POSTGATE, 1984; BARTON, 1995). É possível encontrar BRS em ambientes considerados inóspitos como, fontes hidrotermais e domo de lama vulcânica, onde as temperaturas são bem elevadas (ELSGAARD et al., 1994); em locais com alta pressão como as fendas oceânicas e sedimentos marinhos (JEANTHON et al., 2002); em ambientes ácidos como as drenagens ácidas de mina (JOHNSON, 1995) ou em locais extremamente alcalinos, como em lagos de soda (PIKUTA et al., 1997). Além de estarem presentes nos ambientes marinhos, as BRS foram também encontradas em outros ambientes, tais como, sedimentos de lagos de água doce, apesar de normalmente limitados em sulfato (SASS et al..,1996; Li et al., 1998). Também têm sido detectadas em ambientes industriais (JAN-ROBLERO et al., 2004), tratamentos de águas (ITO et al., 2002; ICGEN et al., 2006; BEN-DOV et al., 2007), em sistemas de aquecimento (KJELLERUP et al., 2005) e arrefecimento de água de reatores nucleares Estão presentes também na boca e no intestino de animais (LOUBINOUX et al., 2003). Dada a sua natureza anaeróbia, normalmente as BRS estão associados a biofilmes anaeróbios (DAVEY et al., 2000; BEECH, 2003), no entanto foram também detectadas em ambientes aeróbios, tais como em zonas oxigenadas em comunidades de cianobactérias (DAR et al., 2008) e em biofilmes que crescem em condições oxigenadas, nos dutos de tratamento de água (ITO et al., 2002). Esta "tolerância” ao oxigênio é possível devido a
20
3.5 Biorremediação de áreas contaminadas por metais.
A biorremediação se baseia num processo tecnológico de remoção da poluição e restauração da qualidade ambiental por meio da degradação dos poluentes utilizando micro-organismos de ocorrência natural, como bactérias e fungos (Espósito, 2004). Várias técnicas de biorremediação têm sido desenvolvidas, e estas técnicas podem ser classificadas segundo o tratamento e a fase utilizada.
De acordo com o tipo de tratamento, as técnicas de biorremediação são denominadas in situ, o processo de biodegradação ocorre no local contaminado, e ex situ o solo ou outro material é retirado e transferido até a unidade de tratamento. Essas técnicas devem levar em conta os poluentes, o custo dos processos e, principalmente, a concentração final do contaminante, no término do tratamento, como aceitável para o tipo de resíduo e para o uso futuro da área (MANCERA-LÓPEZ et al., 2007),
Dentre as várias técnicas de biorremediação desenvolvidas, a bioestimulação é a mais frequente. Esta técnica consiste na ativação dos micro-organismos nativos por meio da adição de nutrientes (MANCERA-LÓPEZ et al., 2007), aumentando sua população, promovendo o crescimento e, consequentemente, o aumento da atividade metabólica na degradação de contaminantes. Esta técnica tem por objetivo aumentar o número ou estimular a atividade dos micro-organismos degradadores da comunidade indígena de uma determinada região contaminada, via adição de receptores de elétrons, nutrientes ou doadores de elétrons (MANCERA-LÓPEZ et al., 2007).
Paredes celulares de procariontes e de Eucariontes contêm diferentes polissacarídeos e estruturas aniônicas devido à presença de grupos ionizáveis tais como carboxilas, hidroxilas e fosfatos. Desta forma a parede celular apresenta grande potencial para captação de metais pesados. (BEVERIDGE & MURRAY, 1980) examinaram a captação de uma variedade de metais pela parede celular de Bacillus subtilis, modificada quimicamente pela adição de grupos ionizáveis, sendo constatada a complexação, a troca iônica e a precipitação de hidróxidos ou sais na parede celular.
21 outros compostos além do O2 para o processo de respiração, as bactérias influenciam o
comportamento de elementos químicos; como moléculas orgânicas e os metais. Assim, elas podem ser consideradas como agentes primários das mudanças geoquímicas, devido ao seu alto potencial metabólico e grande capacidade de adaptação que lhe confere uma larga e abundante distribuição (WARREN & HAAK, 2001).
O uso de processos biológicos como uma alternativa para o tratamento de águas residuárias vem ganhando interesse crescente principalmente devido à qualidade do efluente final tanto para ser descartado no ambiente como para o reuso. Dessa forma as BRS, quando utilizadas de maneira adequada, podem se tornar grandes aliadas para tratamento de águas residuárias ricas em sulfato e metais ou águas subterrâneas contaminadas com metais, dentre eles o arsênio trivalente.
Com o objetivo de avaliar o tratamento de efluentes moderadamente ácidos contaminados por arsênio, utilizando micro-organismos capazes de reduzir o sulfato (BATTAGLIA-BRUNET et al., 2012) avaliou um reator de fluxo contínuo, com valor de pH do meio variando entre 2,5 a 5 que utilizava como doadores de elétrons o glicerol e o hidrogênio. Foi observada durante o experimento, a precipitação de arsênio trivalente na forma de sulfetos arsenicais gerados a partir da reação com o sulfeto produzido pela redução do sulfato pelos micro-organismos presentes no meio de cultura.
3.6 Identificação molecular de micro-organismos
Nos últimos anos foram feitos esforços consideráveis para o desenvolvimento de métodos rápidos para a detecção e enumeração de bactérias em ambientes naturais e industriais. Geralmente esses métodos são divididos em duas categorias: métodos clássicos e métodos moleculares (BEN-DOV et al., 2007).
22 refletir exatamente as condições dos locais onde estas bactérias crescem (ZHU et al., 2003; ICGEN et al., 2006) iii) além disso, a caracterização fenotípica, não fornece informações sobre as relações evolutivas entre os organismos. Os métodos moleculares, em oposição aos métodos clássicos, utilizam a caracterização de certos genes do genoma bacteriano, permitindo a identificação mais eficaz dos microrganismos responsáveis por determinado processo. Em síntese, os métodos moleculares apresentam algumas vantagens sobre os clássicos:
a) São as únicas tecnologias que permitem estudar os micro-organismos não cultiváveis presentes numa comunidade microbiana, sendo mais sensíveis (KNIGHT, 2000).
b) Em termos moleculares, a diversidade é caracterizada pelo número de diferentes tipos de sequências de DNA encontradas no ambiente. c) Os métodos moleculares fornecem informações sobre as relações
evolutivas entre os microrganismos (CASTRO et al., 2000).
O desenvolvimento de novas ferramentas moleculares revolucionou a taxonomia dos micro-organismos. Segundo (AMMAN et al., 1992), o estudo do gene RNA 16S ribossomal, apresenta algumas vantagens consideráveis, por exemplo: (i) estar presentes em todos os organismos, pois são genes essenciais para a síntese de proteínas; (ii) ser conservados estrutural e funcionalmente; (iii) apresentar tanto regiões conservadas, como variáveis e altamente variáveis; (iv) apresentar aparente ausência de transferência gênica horizontal e (v) possuir tamanho satisfatório com cerca de 1.500 nucleotídeos, suficientes para fazer inferências filogenéticas. Mais recentemente, estudos têm sido conduzidos utilizando genes funcionais, como o gene dsr que codifica para a enzima sulfito redutase dissimilatória das BRS (TALBOT et al., 2008), no sentido de resolver possíveis falhas nas análises filogenéticas oriundas da alta conservação do gene 16S rRNA entre as classes de micro-organismos.
23 forma, as técnicas moleculares têm contribuído para a construção do conhecimento sobre a estrutura e a funcionalidade das comunidades microbianas propiciando importantes informações sobre um número muito maior de espécies, sua distribuição geográfica, as relações ecológicas, a atividade celular e a proporção numérica entre diferentes populações em seus ambientes naturais e em biorreatores (DOMINGUES, 2007).
O método molecular utilizado neste estudo para identificação do consórcio bacteriano capaz de reduzir o sulfato e crescer em diferentes concentrações de arsênio foi à eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE). É uma das técnicas moleculares mais utilizadas e adequadas para avaliar as comunidades microbianas da área ambiental (TESKE et al., 1996); pois é confiável, reprodutível, rápida e de custo relativamente baixo. Além disso, permite analisar várias amostras ao mesmo tempo, inclusive de micro-organismos não cultiváveis (MUYZER et al., 1993) obtendo uma representação qualitativa da presença e abundância de diferentes filotipos na amostra Em consequência, oferece oportunidade de se efetuar estimativas mais reais da diversidade microbiana existente (MUYER & SMALLA, 1998). Esta técnica se baseia na separação eletroforética diferencial de amplicons, obtidos por reação de amplificação em cadeia da DNA polimerase (PCR), quanto à susceptibilidade da molécula de DNA à desnaturação parcial promovida por agentes desnaturantes, e discrimina amplicons de tamanhos similares, de acordo com suas sequências de pares de bases (MUYZER et al.,1993). O comportamento de migração dos fragmentos no gel é governado pelas variações nas composições dos nucleotídeos (conteúdo CG), como também pelas interações destes dentro da molécula (MUYZER, 1999), resultando no posicionamento de bandas em diferentes pontos da matriz de poliacrilamida, (LECKIE, 2005).
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4. Materiais e Métodos
4.1 Área de coleta
A Lagoa do Gambá está localizada no centro de um loteamento na cidade de
Ouro Preto, em Minas Gerais, a 20°43’51.11’’ de latitude S e 43°30’0.63’’ de longitude
O (figura 4.1). Esta lagoa recebe grande quantidade de esgoto residencial e do escoamento superficial de áreas periféricas. A borda da lagoa apresenta cobertura vegetal marginal de espécies botânicas exóticas. A coleta foi feita por meio de metodologia padrão, na qual frascos de vidro estéreis foram levados até o local onde as amostras foram recolhidas. Uma porção de sedimento foi coletada em dois pontos diferentes no interior da lagoa á uma distância de aproximadamente 200 metros. Após este procedimento o material foi levado ao Laboratório de Biotecnologia Ambiental da Escola de Farmácia/UFOP.
Figura 4.1 Ponto de coleta - Lagoa do Gambá, cidade de Ouro Preto – MG -
20°43’51.11’’ de latitude S e 43°30’0.63’’ de longitude O.
26
4.2 Cultivo das amostras
As amostras foram cultivadas em batelada em frascos de 500 ml utilizando meio de cultura líquido seletivo Postgate C modificado por (CHEUNG E GU, 2003) cuja composição é apresentada na Tabela 4.1. O pH foi ajustado para 7,0 ± 0,2, utilizando NaOH em seguida, a solução foi esterilizada em autoclave a 120° C, 1,5 atm, por 20 minutos. A solução de sulfato ferroso foi autoclavada separadamente e depois adicionada à solução de sais na proporção 1:10. A concentração de sulfato no meio foi fixada em 2g.L-1 para todos os experimentos e a fonte de carbono utilizada foi lactato de sódio 6g.L-1. Com o objetivo de diminuir a disponibilidade de oxigênio no meio foi adicionado 0,5g.L-1 de tioglicolato de sódio como agente redutor.
27 Tabela 4.1-Composição do meio de cultura Postgate C modificado por (CHEUNG E GU, 2003).
Composição Quantidade (g.L-1)
Lactato de sódio 6,0
Citrato de sódio 0,3
KH2PO4 0,5
NH4Cl 1,0
Na2SO4 3,0
CaCl2 2H2O 0,006
MgSO4.7H2O 1,28
Extrato de levedura 1,0
EDTA 0,3
Tioglicolato de sódio 0,5
FeSO4. 7H2O 0,17
Ágar 0,5
4.3 Avaliação da resistência dos enriquecimentos microbianos ao arsênio
Inicialmente, alíquotas de 100ml de sedimento coletadas na lagoa do Gambá em Ouro Preto-MG foram enriquecidas utilizando-se 300 ml de meio Postgate C modificado. As amostras foram incubadas por 10 dias a 35°C (Amostra 1). Após este período, 5ml de cada amostra foram transferidos para frascos contendo 50 ml de meio Postgate C modificado suplementado de 0,5g.L-1 de arsênio, acrescidos ou não de PP 4% (p/v) (Amostra 2). As amostras foram incubadas a 35°C por cinco dias. Alíquotas de 5 ml das amostras crescidas foram novamente repicadas nas mesmas condições visando adaptar o consórcio bacteriano às condições de cultivo. Para avaliar a resistência do consórcio bacteriano ao arsênio trivalente (AsIII) foram utilizados seis diferentes concentrações do elemento (Tabela 4.2), obtida de uma solução estoque, na qual foi preparada utilizando NaAsO2, a concentração de As3+nessa solução era de 1000mg.L-1.
28 Tabela 4.2– Concentração de As (III) em diferentes amostras.
Amostras Concentração de As (III) (mg.L-1)
1 0,0
2 0,5
3 1,0
4 2,0
5 4,0
6 8,0
7 16,0
No final do processo de adaptação, aproximadamente 15 dias, a amostra adaptada foi inoculada na proporção de 5% (v/v) em frascos contendo 300 ml de meio Postgate C modificado sem o sulfato ferroso para que este não interferisse nas análises posteriores, com 0,5 ml de arsênio retirado da solução estoque de arsênio de 1g.L-¹, acrescido ou não de PP, 4% (p/v). Os frascos foram mantidos a 35°C por 10 dias. A partir da amostra 2 repetiu-se todo o processo para ambas as amostras, variando apenas a quantidade de arsênio que aumentava a cada amostra.
29 Figura 4.2 – Esquema envolvendo os processos de enriquecimento, adaptação e fase dos ensaios de remoção de sulfato e arsênio, realizados neste trabalho. (Estes mesmos processos foram realizados para as demais concentrações de arsênio: 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 e 16,0 mg.L-1 , e um controle de 0,0 mg.L-1 de arsênio.
Com sulfato ferroso Sem sulfato ferroso As =0,5 mg.L-1
Fonte: próprio autor.
5ml 5ml
5ml 5ml
300 ml de meio
50 ml de meio + Sem pó de
penas
Processo de adaptação
300 ml de meio (Sem sulfato
ferroso) + Sem pó de
penas
300 ml de meio (Sem sulfato
ferroso) + Com pó de penas
Análise de biologia molecular 50 ml de meio
+ Sem pó de
penas
50 ml de meio + Sem pó de
penas
50 ml de meio + Com pó de
penas
50 ml de meio + Com pó de
penas 50 ml de meio
+ Com pó de
penas
5ml
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4.4. Identificação microbiana pelo método PCR-DGGE
4.4.1 Preparação das amostras
Alíquotas de 100 ml de cada amostra (1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7) representando seis concentrações diferentes de arsênio (0,5,1,0,2,0,4,0,8,0 e 16,0mg.L-1) foram inicialmente centrifugadas a 5.000 rotações.min-¹ utilizando uma Microcentrífuga (Microcen 16 nº rotor 12154) por 15 minutos para separação da biomassa. A fração líquida foi descartada e o material sedimentado (pellet) foi “lavado” em tampão fosfato
salino (PBS1X) para remoção de ácidos nucléicos extracelulares. Após a agitação a amostra foi novamente centrifugada, conforme etapa anterior. Descartou-se o sobrenadante novamente, e o pellet resultante (biomassa) foi armazenado a -20° C para posterior extração de DNA.
4.4.2 Extração de DNA genômico
Para análise da diversidade bacteriana através da técnica PCR-DGGE, as amostras foram inicialmente submetidas à extração de DNA pelo método fenol/clorofórmio modificado por (GRIFFTITHS et al., 2000). Para cada amostra crescida foram feitas as extrações em duplicata a fim de se obter uma quantidade suficiente de DNA para a etapa de amplificação.
31 sobrenadantes foram misturados. Ao sobrenadante adicionou-se igual volume de solução de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) e agitou-se manualmente por 10 minutos. Uma nova centrifugação foi realizada por 5 minutos a 14.000 rotações.min-¹. Para cada volume de sobrenadante, adicionou-se 2,5 volumes de etanol 100% gelado e 0,1 volume de acetado de sódio (3M, pH 5,2). Essa solução foi incubada por 1 hora a –
20°C, e em seguida, submetida à nova centrifugação por 10 minutos a 14.000 rotações. min-¹. O sobrenadante foi descartado cuidadosamente. Adicionaram-se 200 µl de etanol 70% (v/v) para ressuspensão do pellet e novamente a solução foi centrifugada a 14.000 rotações.min-¹ por 3 minutos. Descartou-se o sobrenadante e deixou-se o pellet secar a temperatura ambiente por aproximadamente 12 horas. O pellet contendo ácidos nucleicos foi ressuspendido em 50µl de Tris (10mM e pH8). Para a avaliação da qualidade da extração, cerca de 5μL de DNA genômico extraído foi analisado em gel de
agarose a 1%, corado com brometo de etídio e visualizado com auxílio de um transiluminador (Vilber Lourmat em UV). O DNA foi estocado à -20°C para posterior amplificação do gene DNA ribossomal 16S.
4.4.3 Amplificação do DNA por PCR
Para verificar a comunidade total de bactérias inicialmente foi realizado amplificação dos fragmentos de DNA ribossomal 16S utilizando-se primers universais
968F (5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’) com cauda GC (5’-CGCCCGGGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGGGGG-3’) e 1392 R (5’-ACGGGC GGTGTG TAC-3’) para o Domínio Bacteria (NIELSEN et al., 1999).
32 Tabela 4.3 - Componentes utilizados na reação de PCR (volume final igual a 25μL)
Componentes Volume (μL)
Água 17,5
Tampão da reação (10x) 2,5
MgCl2 (25mM) 1,5
dNTP (10mM) 0,5
Iniciador 1 (10μM) 0,5 Iniciador 2 (10μM) 0,5 Taq DNA polimerase (5U/uL) 0,125
DNA 2,0
Volume Total 25
As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador MJ96G (Biocycler). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 45 segundos de desnaturação a 94ºC, 1 minuto de anelamento a 63ºC e 2 minutos de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 10 minutos a 72ºC. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão tris-acetato-EDTA (TAE) 1X, durante aproximadamente 30 minutos a 100V. Para a
avaliação da qualidade de amplicons, cerca de 5μL da amostra foram analisados em gel
de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizados com auxílio de um transiluminador (Vilber Lourmat) em UV.
É importante ressaltar que para todas as reações de PCR foi realizado, em paralelo, um teste controle negativo que contava com a adição de todos os reagentes, exceto DNA, para descartar qualquer tipo de contaminação externa.
4.4.4 Eletroforese em Gel de Gradiente Desnaturante (DGGE)
33 formação de 12 mL de gel, utilizaram-se duas soluções denominadas de low (com baixa porcentagem de desnaturante) e High (com alta porcentagem de desnaturante). Para a formação de cada solução, as soluções desnaturantes 80% e 0% eram misturadas em proporções pré-estabelecidas. A polimerização de cada solução foi obtida com a adição de persulfato de amônio (APS) a 10% e catalisação da reação com tetrametiletilenodiamina (TEMED).
No presente trabalho, a faixa de gradiente desnaturante escolhida para a confecção dos géis para a DGGE foi de 40% a 60%, para o Domínio Bacteria. Para o estabelecimento destes gradientes desnaturantes as soluções Low e High foram misturadas em um dispositivo formador de gradientes de duas câmaras, com agitação magnética na câmara de saída e distribuição por bomba peristáltica em placas de vidro, operado de acordo com o manual do equipamento (Dcode Mutation System, Biorad).
Foram empregados 10 µL de produto de PCR e 5 µL de tampão em cada poço do gel polimerizado. As condições da corrida foram: 60 ou 100V, tampão de corrida TAE 0,5X, aproximadamente por 16 horas.
Ao final da eletroforese, os géis foram imersos em tampão e corados com a adição de 10 µl de solução de brometo de etídio, por 60 min. A seguir foram lavados em água destilada e observados com auxílio de um transiluminador com luz ultravioleta e fotodocumentados. As bandas de interesse foram excisadas dos géis com auxilio de uma lamina de bisturi estéril e transferidas para microtubos contendo 200 µL de Tris (10mM e pH 8) e 0,3g de pérolas de vidro estéreis. Para a eluição do DNA das bandas do gel para a solução, promoveu-se uma agitação de 30 segundos em agitador e, em seguida, os microtubos foram armazenados a 4°C por no mínimo 48 horas. Após este período, os microtubos foram centrifugados a 13.000 rpm e o sobrenadante, contendo os fragmentos de DNA, foi transferido para novo microtubo e armazenado a -20°C para posterior reamplificação.
34 O sequenciamento do DNA referente às bandas excisadas e purificadas do gel de DGGE foi realizado a partir dos produtos das amplificações (PCR), pela empresa Genomic Engenharia Molecular (São Paulo) bem como a purificação e quantificação de DNA presente nas amostras.
4.4.5. Análise das sequências genômicas.
Após a reação de sequenciamento, as sequências obtidas foram analisadas nos programas BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e RDP X (Ribossomal Database Project Release 10) (COLE et al., 2009) para o alinhamento das mesmas com sequências do DNAr 16S depositadas no banco de dados utilizando o modelo de Jukes-Cantor. A árvore filogenética contendo sequências do gene 16S DNAr alinhadas foi construída pelo método Neighbor-Joining modificado disponível no RDP (BRUNO et al., 2000), com auxilio do software mega 4.1.
4.5 Caracterização e identificação dos precipitados formados
Para avaliar o efeito da atividade microbiana na formação do precipitado, e consequente remoção do As (III), foi preparada uma amostra apresentando todos os constituintes do meio descritas anteriormente, sem adição de inóculo.
E para caracterização do precipitado utilizou-se 30 ml de todas as amostras crescidas em diferentes concentrações de arsênio e na ausência do meio suporte. Foram centrifugadas 5.000 rotações.min-¹ utilizando uma Microcentrífuga (Microcen 16 n,º rotor 12154) por 10 minutos para separação da biomassa. A fração líquida foi descartada e o material sedimentado (pellet) foi seco em uma estufa, em temperatura de 35°C, por 3 dias.
O material seco foi analisado por meio das seguintes técnicas:
35 espectroscopia de Raman baseia-se na análise da luz dispersa a partir da incidência de um feixe de luz monocromática (laser) sobre um dado material. Uma pequena porção da luz é dispersa inelasticamente, com mudanças sutis que são características do material analisado e independente da frequência da luz incidente. É uma técnica de análise que é efetuada diretamente sobre o material a ser analisado, seja ele sólido ou líquido, sem exigir preparação especial e sem implicar em alteração da superfície sobre a qual a análise é realizada, isto é, trata-se de análise não-destrutiva. As análises foram realizadas no Departamento de química da UFOP utilizando-se equipamento Labran HR 800 (Jobin Yvon/Horiba) com feixe de laser de He-Ne, com 632.8 nm de comprimento de onda e potência de 20 mW. O sinal Raman foi coletado com objetivas Olympus (50 X 0.75 e 100 X 0.90) usando a configuração “back scattering”. O detector utilizado foi
do tipo CCD resfriado por nitrogênio.
b) Difração de Raios-X: A análise por difração de raios X é um método utilizado para a determinação da estrutura atômica e molecular de materiais, preferencialmente cristalinos. Os átomos em uma estrutura cristalina difratam o feixe de Raios-X que incidem sobre eles em diferentes direções. Ao medir os ângulos e intensidades destes feixes difratados é possível determinar a estrutura do composto e identificá-lo com base em comparações entre os espectros obtidos e os depositados em bancos de dados. As análises de Difração de Raios-X foram realizadas no laboratório de Química dos materiais o Departamento de Química da UFOP. Para caracterização dos possíveis sulfetos formados as amostras foram analisadas no difratômetro (Shimadzu-XRD 6000), acoplado com tubo de ferro e monocromador de grafite.
c) Microscopia eletrônica de varredura (MEV) e Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS)
36 espectrofotométrica que pode ser executada junto com a microscopia eletrônica de varredura. É realizada uma microanálise da superfície do material permitindo a obtenção de informações químicas em áreas da ordem de micrometros. As informações, qualitativas e quantitativas, sobre os elementos presentes são obtidas pela captação dos raios-X característicos resultantes da interação do feixe primário com a amostra.
Essa técnica foi utilizada para se ter uma melhor resolução da formados precipitados. As lâminas foram preparadas a fresco secadas ao ar. Em seguida, foi feita a metalização das lâminas com grafite, para observação no MEV (20.0 kv, magnificação de 5000 X e detector Pioneer). Estes experimentos foram realizados em colaboração com o Laboratório de Microscopia Eletrônica do Departamento de Geologia da UFOP.
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5. Resultados e Discussão
5.1 Enriquecimento e adaptação das amostras
O desenvolvimento de micro-organismos, bem como a redução de sulfato a sulfeto foi evidenciada em todas as amostras com o emprego do meio líquido Postgate C modificado (figura 5.1). Tais resultados estão de acordo com aqueles obtidos previamente em nosso grupo de pesquisa, quando comparados àqueles obtido empregando-se o meio líquido Postgate B (BARBOSA, 2009).
O meio de cultivo Postgate C “modificado” apresenta uma coloração inicial avermelhada, devido à presença de sulfato ferroso (FeSO4.7H2O). Durante o
metabolismo das BRS, o íon sulfato é reduzido a sulfeto que, em presença de ferro ferroso (Fe2+) reage levando à formação de um precipitado negro de sulfeto de ferro (FeS). O escurecimento do meio de cultivo pela formação de FeS é um indicativo da atividade metabólica das BRS. Tal escurecimento não foi observado nos frascos controle com ausência de inóculos. Nos frascos aos quais foi adicionado o PP, a coloração enegrecida foi observada cerca de 42 horas após o inóculo. Já os frascos que não apresentavam adição de PP demandaram cerca de 120 horas até que o crescimento microbiano pudesse ser observado. Além disso, a fonte de carbono selecionada para os experimentos permitiu um eficiente aporte nutricional para o crescimento dos micro-organismos, o que corrobora com os estudos realizados por Barbosa (BARBOSA, 2009), que relata ser o lactato uma fonte de carbono e energia mais eficiente do que o etanol, para uma mesma amostra de micro-organismo. Ademais, a degradação do lactato no meio de cultivo produz vários intermediários, entre eles hidrogênio, acetato, etanol e propionato, que podem favorecer o desenvolvimento de BRS, metanogênicas e acetogênicas (WIDDEL& PFENNING, 1982).
