Após a marcação por imunohistoquímica para o eixo quimiotático CCR6/CCL20 no microambiente do enxerto renal foram fotografados 10 campos representativos de cada caso (lâmina) com o intuito de quantificar a presença dessas quimiocinas.
Na figura 10 é possível notar que as principais fontes produtoras do CCL20 foram principalmente as células epiteliais tubulares e mais raramente células intersticiais. A expressão do receptor CCR6 também ficou mais restrita a células epiteliais tubulares. Na figura também são exibidos os controles positivo (tonsila humana) e negativo (ausência do
P = 0,899
ρ = 0,038
A B P = 0,495
anticorpo primário). Assim como para IL-17A, devido ao uso do cromógeno 3,3- diaminobenzidina, os locais em que há presença das quimiocinas exibem uma coloração marrom-acastanhado, enquanto que nas regiões negativas a contra-coloração com hematoxilina de Harris (azul) é preservada.
Figura 10. Imunohistoquímica para CCR6/CCL20. (A e C) Controles negativos de rim com ausência do
anticorpo primário. (B) Controle positivo de tonsila humana, linfócitos T expressando CCR6. (D) Controle positivo de tonsila humana, linfócitos T produzindo CCL20. (E) Caso 184734 exibindo expressão do CCR6 em células tubulares. (F) Caso 185360 exibindo produção do CCL20 em células tubulares. Imagens obtidas no microscópio Leica DM4000B do Laboratório de Pesquisa em Imunopatologias da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Para determinar a influência do eixo quimiotático CCR6/CCL20 sobre o desfecho do rim transplantado, as lâminas marcadas por imunohistoquímica foram avaliadas de forma quantitativa por meio do programa Image-Pro Plus o qual fornecia informações a respeito da área marcada e da intensidade/densidade da marcação. A coloração padrão que indicava a presença das quimiocinas foi obtida a partir do observado no controle positivo (figura 11).
Figura 11. Quantificação da imunohistoquímica para CCR6. Em (A) controle positivo de tonsila humana
com as áreas marcadas e em (B) as regiões consideradas como positivas pelo programa. Em (C) marcação de CCR6 no caso 184734 e em (D) as áreas reconhecidas como positivas pelo programa (conforme marcação obtida no controle positivo). Para o ligante CCL20 foi realizado o mesmo procedimento (não exibido).
Inicialmente, com os resultados da quantificação imunohistoquímica (área e densidade) do CCR6 e seu ligante CCL20, foi feita comparação entre os subgrupos do desfecho renal (rejeição ou ausência de rejeição). Os resultados são exibidos na tabela 8 e demonstram não haver diferença estatisticamente significativa entre os grupos comparados. A reação de cada quimiocina foi realizada em uma lâmina diferente e em relação ao IL-17A houve presença mais significativa de marcação inespecífica (fundo) sem, contudo, prejuízo dos resultados obtidos.
Tabela 8.
Área e densidade de marcação para CCR6 e CCL20 conforme desfecho do transplante.
Ausência de rejeição Rejeição P valor
média ± DP* média ± DP* CCR6 Área marcada 801,4 ± 1160,2 1195,0 ± 1454,8 0,446 Densidade da marcação 83286,5 ± 123318,4 206193,6 ± 268426,9 0,288 CCL20 Área marcada 1202,8 ± 1453,3 635,6 ± 854,3 0,781 Densidade da marcação 150952,9 ± 196595,1 124207,3 ± 185468,6 0,446
A distribuição dos dados foi não paramétrica e, portanto utilizou-se o teste U de Mann-Whitney. Os valores foram expressos como média e DP (desvio padrão) apenas para melhor entendimento.
Uma vez que as células Th17 produtoras de IL-17A têm sua migração aos tecidos diretamente relacionada ao gradiente quimiotático promovido por CCR6 e seu ligante CCL20, investigou-se a correlação entre as marcações obtidas com a citocina e quimiocinas considerando o microambiente do enxerto renal. Na figura 12 é possível notar uma leve tendência à correlação positiva entre a expressão (densidade/intensidade) das quimiocinas, principalmente CCL20, e a presença de IL-17A, contudo sem haver significância estatística após teste de spearman.
Figura 12. Gráficos de dispersão de pontos entre as densidades de marcação da IL-17A e das quimiocinas.
Em (A) é exibido a densidade de marcação para IL-17A frente a densidade de marcação para o receptor CCR6 (eixo x). Em (B) densidade da marcação para IL-17A (eixo y) frente a densidade de marcação para CCL20 (eixo x). Os círculos não representam um caso específico, devido a sobreposição de valores (como em zero). O valor de ρ (rho) é referente a correlação de spearman entre as variáveis. E o valor de P representa o nível de significância da associação. A linha de ajuste indica a curva da equação do gráfico.
P = 0,194
ρ = 0,225
P = 0,059
ρ = 0,322
O parâmetro de área da marcação para quimiocinas e IL-17A também foi correlacionado. Os resultados obtidos, assim como para a densidade, também não foram significativos: CCL20 vs IL-17A P = 0,069 eρ (rho) = 0,311; CCR6 vs IL-17A P = 0,153 e ρ (rho) = 0,247. Por último, foi verificada a correlação entre o receptor CCR6 e seu ligante CCL20 (figura 13).
Figura 13. Gráficos de dispersão de pontos entre os parâmetros de marcação do eixo quimiotático CCR6/CCL20. Em (A) é exibido a área marcada de CCL20 (eixo y) frente a área marcada para o receptor
CCR6 (eixo x). Em (B) densidade da marcação CCL20 (eixo y) frente a densidade de marcação para CCR6 (eixo x). Os círculos não representam um caso específico, devido a sobreposição de valores (como em zero). O valor de ρ (rho) é referente a correlação de spearman entre as variáveis. E o valor de P representa o nível de significância da associação. A linha de ajuste indica a curva da equação do gráfico.
Os resultados demonstraram não haver correlação estatisticamente significativa entre a expressão do receptor CCR6 e a produção do ligante CCL20. Uma leve correlação negativa foi observada entre as quimiocinas, como é visto pela linha de ajuste no gráfico.
P = 0,207
ρ = - 0,219
A P = 0,327
ρ = - 0,171 B
6 DISCUSSÃO
O diagnóstico precoce de rejeição no aloenxerto renal aliado a padronização de novos biomarcadores específicos à rejeição é de alta prioridade nas pesquisas em nefrologia. Sabe-se que mecanismos mediados pelas imunidades inata e adaptativa desempenham papel fundamental na resposta imune contra o aloenxerto renal. Células T estão diretamente envolvidas nas reações inflamatórias ocasionadas ao enxerto, e os mediadores quimiotáticos são essenciais ao recrutamento dessas células para o microambiente renal. Em nosso estudo propusemos a investigação da resposta Th17 ao rim transplantado.
Inicialmente foram recrutados 323 indivíduos para determinação dos polimorfismos gênicos: 148 pacientes transplantados renais e 175 indivíduos controles saudáveis doadores de medula óssea. O grupo dos controles foi composto por uma população mais jovem, fato explicado pela maior procura dos indivíduos adultos jovens aos postos do REDOME.
Em relação ao estudo genético desses dois grupos observou-se concordância ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, demonstrando coerência na técnica usada para genotipagem dos indivíduos em ambos SNPs. Ainda, nos dois grupos avaliados, as frequências alélicas e genotípicas foram próximas àquelas encontradas para as médias da população mundial determinadas pelo projeto HapMap (média das frequências das 10 etnias estudadas), tanto para o rs2275913 como para o rs4819554. Por último, a comparação entre os polimorfismos de controles e transplantados demonstrou maior prevalência do genótipo rs2275913-AA em mulheres do grupo transplantado, contudo não se pode inferir que isso seja um fator de risco ao desenvolvimento de doença renal crônica em mulheres, visto que o desfecho estudado não foi a DRC.
De fato, é bem conhecida a influência exercida por características intrínsecas ao doador e ao receptor sobre a função do enxerto renal. Sabe-se que rim de doador cadavérico, duração da isquemia muito curto ou longo, infecção por citomegalovírus, bem como um painel de reatividade contra anticorpo elevado são fatores de risco ao desenvolvimento de rejeição (SCHWARZ e OBERBAUER., 2003; OJO et al. 1997; TERASAKI et al., 1995). Logo, dividimos o grupo dos pacientes transplantados em indivíduos que apresentaram rejeição e os que não apresentaram, e a seguir investigamos a influência de diversas variáveis sobre o transplante. Nossos resultados demonstraram que a rejeição esteve presente em receptores do transplante mais jovens, o que vai de encontro ao exposto por De Fijter (2005) que especula maior risco de rejeição em receptores mais velhos devido a habilidade reduzida
de se organizar um processo de reparo tecidual, assim como naqueles que receberam rim de doadores com idade acima de 50 anos.
Além das variáveis clínicas e demográficas relativas ao doador e receptor, investigamos a influência de variações genéticas sobre a rejeição. Para isso selecionamos polimorfismos gênicos nas regiões promotoras da IL-17A e do seu receptor IL-17RA, visto que a resposta mediada por essa citocina tem ganhado cada vez mais destaque na rejeição ao enxerto. Nossos resultados não demonstraram diferenças estatisticamente significativas nas frequências alélicas e genotípicas entre os subgrupos comparados para ambos SNPs. Controversamente aos nossos achados, Karimi et al. (2014) demonstraram maior prevalência do genótipo rs2275913-GG em mulheres iranianas que sofreram rejeição renal aguda, indicando um provável fator de risco. Já Kim et al. (2012) observaram maior frequência do alelo rs4819554-G ao desenvolvimento de doença renal crônica em indivíduos sul-coreanos. Diferenças no delineamento dos estudos como a população (brasileiros vs asiáticos) e o desfecho avaliados podem justificar tais resultados controversos.
Uma vez que não houve influência dos polimorfismos sobre o desfecho final, acompanhamos os valores da função renal dos indivíduos por pelo menos um ano, e então verificamos uma provável interferência das variações genéticas sobre o decréscimo da função do enxerto. Assim, foi possível observar menor TFG em portadores do alelo rs2275913-A no momento imediatamente anterior ao transplante renal independentemente da presença de rejeição. Em uma publicação recente, Coto et al. (2015) encontraram menor TFG (<60mL/min/1,73m2) em carreadores do genótipo rs4819554-AA independentemente da presença de diabetes tipo 2. Para esse mesmo SNP não houve diferenças nos parâmetros da função renal em nossos indivíduos estudados. A diferença nas fórmulas da TFG utilizadas pode ser uma provável explicação, enquanto Coto et al. (2015) utilizaram MDRD (Modification of Diet in Renal Disease) nós utilizamos CKD-EPI.
De fato, a interleucina 17 vem sendo há muito tempo associada a processos de rejeição renal, sendo até mesmo considerada um biomarcador preditor de rejeição aguda (MILLAN et al. 2014; CRISPIM et al., 2009). Em processos de rejeição aguda ao aloenxerto, no microambiente renal, a IL-17 estimula células epiteliais a produzirem altos níveis de IL-6, IL- 8, MCP-1 e proteína C3 do complemento (VAN KOOTEN et al., 1998). Ainda, estudos relatam que transcritos de RNA mensageiro para essa citocina no sedimento urinário de pacientes estão associados com rejeição subclínica (LOONG et al., 2002). Assim, buscando
entender a atividade da IL-17A sobre o enxerto renal, investigamos a presença dessa interleucina em espécimes de biópsia renal por imunohistoquímica.
Em nossos resultados as principais fontes da IL-17 foram as células do infiltrado intersticial, as células epiteliais tubulares, células do glomérulo renal e os polimorfonucleares também exibiram marcação. De forma semelhante, um trabalho explorando dezoito biópsias de pacientes com rejeição aguda do aloenxerto renal mostrou a presença da expressão proteica de IL-17, TGF-β, TNF e FOXP3 por imunohistoquímica, nele as células intersticiais e endoteliais foram responsáveis pela produção de IL-17 (DE MENEZES NEVES et al., 2013). Outro trabalho explorando biópsia de pacientes com rejeição aguda do aloenxerto renal mostrou a presença da expressão proteica de IL-17 por imunohistoquímica associada principalmente aos mastócitos e aos neutrófilos (YAPICI et al., 2011).
A expressão proteica da IL-17 no microambiente do enxerto renal não exerceu influência sobre o desfecho do transplante renal em nossos pacientes. Embora alguns autores demonstrarem haver associação entre a presença da IL-17 no microambiente renal e o desenvolvimento de rejeição, principalmente aguda (LOVERRE et al., 2011; DE MENEZES NEVES et al., 2013; CHUNG et al., 2011), em nosso trabalho a marcação da IL-17 foi avaliada de forma quantitativa com o intuito de aumentar a confiança da associação. Além do mais, tivemos a precaução de selecionar apenas os pacientes em uso do mesmo esquema imunossupressor de manutenção, visto que alguns fármacos agem interferindo diretamente a resposta Th17 (CHUNG et al., 2012; KIM et al., 2015). Ainda, no grupo dos pacientes sem rejeição havia a presença de achados inflamatórios como tubulite, glomerulite, necrose tubular aguda entre outros, os quais poderiam ser também mediados por IL-17, levando assim a alta expressão nesse grupo de indivíduos, não se diferenciando, portanto, da expressão obtida no grupo rejeição. Por último, pode se especular que nossos indivíduos apresentaram um fenótipo menos agressivo da célula Th17 ou até mesmo um controle exacerbado da resposta imune por células T regulatórias Foxp3+ (GHORESCHI et al., 2010; SALCIDO-OCHOA et al., 2012).
Em condições patológicas como infecções ou reações autoimunes, a IL-17 atua promovendo principalmente um infiltrado neutrofílico (FONTAO et al., 2012; TAYLOR et al., 2014). Nesse sentido correlacionamos os resultados das quantificações da IL-17 com o número de neutrófilos presentes no microambiente do aloenxerto. De um modo geral não houve correlação entre as variáveis, assim especulamos que devido ao decréscimo de neutrófilos e ascensão de células Th1 no infiltrado após 2 semanas de injúria (início da
rejeição), provavelmente alguns tecidos foram biopsiados após essa fase de decréscimo neutrofílico (KURTS et al., 2013).
Variantes genéticas em IL17A podem influenciar diretamente na expressão proteica da interleucina. O SNP rs2275913 da região promotora do IL17A localiza-se em um motivo de ligação para o fator de transcrição NFAT. Espinoza et al. (2011) determinaram por meio de ensaios com luciferase e retardo da mobilidade eletroforética que há maior força de ligação do NFAT à região promotora do IL17A quando o alelo rs2275913-A está presente. Sistemicamente, o resultado dessa associação foi visto em receptores de medula óssea, nos quais houve níveis séricos mais elevados da IL-17 nos portadores do alelo A e principalmente do genótipo AA. Por outro lado, em pacientes transplantados renais, Karimi et al. (2014) demonstraram não haver relação entre os níveis séricos da IL-17A e o SNP rs2275913. Visto isso, propusemos a determinação da relação entre a marcação imunohistoquímica da IL-17 e o polimorfismo rs2275913. Nossos resultados também demonstraram não haver relação entre a presença do polimorfismo e elevação ou redução na expressão in situ da interleucina. Conforme dito anteriormente, a presença de um fenótipo menos agressivo da célula Th17 ou até mesmo um controle exacerbado da resposta imune por Tregs+ podem ter inferido na avalição.
Até o momento, em relação ao papel do perfil Th17 em transplante renal, sabe-se que, o aumento da expressão de células Th17 tem importante associação no desenvolvimento da rejeição no microambiente renal (CHUNG, OH, et al., 2012; CHUNG et al., 2011; LIU et al., 2013), no entanto o provável mecanismo ainda não está bem compreendido. Sabe-se que os linfócitos Th17 e as células dendríticas que infiltram o enxerto desempenham papel crítico na rejeição ao aloenxerto renal. Contudo, os mecanismos envolvidos no recrutamento dessas células ao microambiente renal ainda não foram bem elucidados.
Em nosso estudo avaliamos a expressão do eixo quimiotático CCR6/CCL20 em espécimes renais dos indivíduos transplantados e verificamos sua relação com o status do transplante, bem como com a expressão da IL-17. Inicialmente, observamos que as células tubulares foram as principais produtoras do CCR6 e CCL20 e que estas não apresentaram relação com o desfecho do rim transplantado. Ainda, uma vez que essas quimiocinas estão envolvidas com a migração das células Th17, verificou-se a correlação delas com a expressão da IL-17. Nossos resultados demonstraram uma leve correlação linear positiva, próxima à significância estatística.
De fato, trabalho prévio em cultura de células de pacientes transplantados renais, demonstrou que as células tubulares renais eram responsáveis pela produção de IL-6, IL-8 e RANTES via estímulo de IL-17 e CD40L (WOLTMAN et al., 2000). Recentemente, em modelos experimentais de glomerulonefrite, a expressão do CCR6 e seu ligante CCL20 parecem desempenhar um papel fundamental no recrutamento direto de outras células Th17 CCR6+ (PAUST et al., 2012; TURNER, PAUST, STEINMETZ, PETERS, et al., 2010). A ausência do receptor CCR6 em células Th17 resulta na inibição do seu recrutamento dentro do microambiente inflamatório em doença autoimune experimental (YAMAZAKI et al., 2008). Na presença de IL-17A, tais linfócitos estimulam células mesangiais do rim a produzirem CCR6/CCL20 (PAUST et al., 2009). Ainda, em doenças inflamatórias renais, o CCR6 e seu correspondente ligante CCL20 podem estar envolvido no recrutamento de células T e B para organizar nódulos linfáticos em doença inflamatória crônica (WELSH-BACIC et al., 2011).
Em nosso estudo, a ausência da associação entre as quimiocinas e o desfecho do transplante renal tem fundamento na expressão do eixo CCR6/CCL20 em Tregs. Logo, pode- se especular que em nossos espécimes avaliados a expressão de quimiocinas resultou em um infiltrado de células pró-inflamatórias (Th17 e T ) nos indivíduos que apresentaram pior desfecho e em um infiltrado de células regulatórias (Tregs) nos sujeitos com desfecho mais favorável (LEE et al., 2015).
Por último, determinamos a correlação entre a expressão proteica do receptor CCR6 e seu ligante CCL20 a partir dos resultados obtidos com a imunohistoquímica. Nossos resultados não foram estatisticamente significativos. Além disso, houve uma leve correlação (spearman) negativa entre os marcadores. Trabalhos prévios já sinalizam para tal achado, estudos com células B e até mesmo células T CD4+ demonstraram que expressão de CCR6 não reflete os níveis de CCL20 (LIAO et al., 2002). Acredita-se que outros mediadores estejam envolvidos na ativação do receptor CCR6 e, portanto, o CCL20 não é o seu único ligante (YANG et al., 1999b). A caracterização de outras vias de sinalização para o CCR6 é fundamental para compreender melhor sua ação nos processos de rejeição.
Por fim, acreditamos que, aliado aos nossos resultados, estudos posteriores com aumento do “n” amostral, maior controle sobre as variáveis que envolvem a obtenção do espécime renal e a inclusão das células Tregs e T, podem determinar com maior clareza a influência exercida pelos SNPs em genes de citocinas e pelo eixo quimiotático CCR6/CCL20, sobre o controle da resposta Th17 nos processos de rejeição ao aloenxerto renal.
7 CONCLUSÕES
No presente estudo foi possível concluir que houve semelhança entre as frequências alélicas e genotípicas dos SNPs estudados em relação ao previsto para a população mundial com os dados do HapMap.
Os SNPs estudados não constituíram fatores de risco ao desenvolvimento de rejeição ou ao decréscimo da função renal. Estudos posteriores com investigação de outras citocinas do perfil Th17, bem como com blocos haplotípicos para os genes estudados podem esclarecer melhor essa questão.
A expressão proteica da IL-17 no microambiente do enxerto renal não foi afetada pelo SNP rs2275913.
A IL-17 teve expressão mais disseminada do que CCR6 e CCL20, sem, contudo, apresentar relação com o número de neutrófilos presentes no infiltrado.
O status do transplante renal não teve relação com a expressão quantitativa dos marcadores estudados. A presença de um fenótipo menos agressivo da célula Th17, assim como a presença de células T regulatórias podem ter relação com esse fato.
Houve uma leve correlação positiva entre a expressão da IL-17 e a do eixo quimiotático CCR6/CCL20, indicando uma provável resposta Th17 no enxerto renal.
A ausência de correlação entre a expressão de CCR6 e CCL20 pode indicar outras vias de sinalização para o CCR6.
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