Induzindo a ovulação

O conhecimento e a precisão do momento das ovulações é um evento determinante sobre os resultados de fertilidade em programas de IATF (PURSLEY et al., 1995; CIPRIANO et al., 2011). Diversos estudos têm demonstrado que o tempo para realização das inseminações artificiais devem estar em consonância com a previsão das ovulações (ROELOFS et al., 2006; AYRES et al., 2008), desta maneira, pensando em sincronizar os eventos envolvidos com os mecanismos ovulatórios, são empregados indutores hormonais.

Segundo Driancourt (2001), a utilização do GnRH e estrógenos são uma das possibilidades disponíveis para se induzir as ovulações, estes hormônios passam a estimular a secreção e liberação do LH, fazendo ovular os folículos LH-dependentes. Hafez & Hafez (2004) afirmaram que substâncias que atuam diretamente sobre o processo ovulatório como o LH, ou hormônios cuja estrutura permitam interagir com seus receptores (gonadotrofinas), também são alternativas para estimular as ovulações.

Ferreira (2010) resumiu a utilização dos hormônios que estimulam a liberação do LH baseado em seus respectivos mecanismo de ação: O fato do GnRH estimular diretamente o pico de LH faz com que sua aplicação seja realizada mais tardiamente nos protocolos (dois dias após o término da fase progesterônica). Os estrógenos por sua vez, precisam estimular a liberação de GnRH a nível hipotalâmico, para então induzir o pico de LH, o que certamente exige maior tempo e por isso sua aplicação deve ser antecipada em um dia.

Diante do exposto, quando o GnRH foi aplicado 48h após a administração da prostaglandina no protocolo denominado Ovsynch, Pursley et al. (1995) observaram que as ovulações ocorriam em média 32h depois. Posteriormente, seus resultados foram confirmados por Bodensteiner et al. (1996) (32,0±0,0), Barros et al. (2000) (31,7±1,8) e Fernandes et al. (2001) (32,8±1,6h). Baruselli et al. (2003) encontraram valores semelhantes aos autores acima (28,5±9,6h), entretanto, o grupo que não recebeu GnRH como indutor, apresentou ovulações mais dispersas (24,6±21,8h), salientando a necessidade de agentes que sincronizem as ovulações em programas onde se planeja a IATF.

Contudo, a utilização deste protocolo nem sempre resulta em folículos capazes de responderem ao indutor da ovulação e, portanto, são encontrados resultados variáveis na literatura (PURSLEY et al., 1997; BARROS et al., 2000; FERNANDES et al., 2001; RIBEIRO et al., 2001). Como observado por Martinez et al. (1999), a emergência de uma nova onda somente é induzida quando ocorre ovulação em resposta ao tratamento, desta forma, animais com alguma limitação em desenvolver o folículo até o estádio

plateau de crescimento, apresentariam menores chances de ovularem e estabelecerem

uma fase lútea responsável pelo desenvolvimento folicular subsequente, até o estádio ovulatório. Macmillan et al. (2003) salientaram que folículos responsivos ao LH podem

ter associado ao seu menor diâmetro, uma menor quantidade de receptores de LH e um menor número de células da granulosa, e nesta situação, a ovulação induzida promove o desenvolvimento de um corpo lúteo menos funcional, com baixa capacidade de secretar progesterona, influenciando também o desenvolvimento da nova onda folicular. Para Bragança (2007), como consequência da assincronia da nova onda ou aporte ao desenvolvimento adequado do folículo ovulatório, falhas na ovulação ao se utilizar este protocolo estariam associadas à falta de capacidade do folículo em responder ao LH.

De acordo com Ferreira (2010), a maior limitação do GnRH é que este fármaco apenas sincroniza a onda folicular, mas não é capaz de produzir um padrão de liberação do LH necessário para o desenvolvimento folicular até o estádio ovulatório. Corroborando com esta afirmação, Baruselli et al. (2006) consideram essencial a supressão prematura do LH até os estádios em que o folículo possa responder a indução da ovulação.

Ainda segundo Baruselli et al. (2006), afim de se obter uma fase lútea mais definida e que propicie um desenvolvimento adequado do folículo até o estádio ovulatório, tem se lançado mão da suplementação de progesterona nos protocolos hormonais, em vista aos protocolos que simplesmente sincronizam a fase lútea, como é o caso dos protocolos

Ovsynch e seus variantes. Nestes termos, quando o GnRH foi aplicado como indutor da

ovulação, 48h após a remoção da progesterona, Peeler et al. (2004) puderam confirmar a eficiência do tratamento ao obterem ovulações sincronizadas em cerca de 23,6±2,3h após a administração do GnRH. Resultados semelhantes foram encontrados por Souza (2008), ao observar que as ovulações ocorriam, em média, 73,6±1,8h após o término da fase lútea, no entanto, quando o GnRH era administrado 54h após a remoção da progesterona, as ovulações ocorriam mais atrasadas e menos sincronizadas (80,2±4,5h).

Para Murphy (1990) e Yavas (1999), mesmo com a utilização da progesterona, folículos dominantes no período pós parto são menores que os folículos ovulatórios que precedem os ciclos normais, o que significa que os folículos dominantes não ovulatórios no pós-parto sofrem atresia antes de atingirem o tamanho necessário para responder a ovulação. Uma alternativa para contornar este problema, tem sido a utilização de 300 a 400UI da eCG (gonadotrofina coriônica equina) no momento da retirada do implante, com o objetivo de complementar o crescimento final dos folículos (ROSSA, 2002).

Vale salientar as observações de Cavalieri et al. (1997) e Moreira (2002), os quais consideraram que a gonadotrofina coriônica equina atua como um sincronizador das ovulações, por mecanismos que não incluem uma ação direta sobre os folículos, como as apresentadas pelos indutores da ovulação. Ainda assim, a eCG assume um importante papel na pecuária nacional, sendo um hormônio aplamente empregado, junto aos indutores, nos protocolos de sincronização das ovulações (BARUSELLI et al., 2006).

Monniaux et al. (1984) levantaram alguns aspectos a serem considerados e que justificam a inclusão deste hormônio nos atuais protocolos de IATF. Os autores observaram que a eCG era capaz de aumentar o número e a taxa de crescimento de folículos pré-antrais e da mesma forma, incrementar o diâmetro de folículos antrais com a capacidade de prevenir, e algumas vezes, recuperar folículos em estados iniciais de atresia. Foi sugerido ainda, que os folículos antrais prevenidos ou recuperados dos estágios iniciais de atresia poderiam ser hábeis a ovular e luteinizar após o pico de LH (MONNIAUX et al., 1984). De acordo com o estudo de Cavalieri et al. (1997), a inclusão deste hormônio nos protocolos pode ser adotada objetivando favorecer o crescimento folicular, de modo a promover uma maior liberação de estradiol-17β; como consequência, os mecanismos envolvidos com a ovulação são desencadeados pelo surgimento mais sincrônico da onda pré-ovulatória do LH.

Pesquisas da década de 70 já associavam a utilização da eCG a uma elevada taxa de prenhez, relacionando estes achados a uma possível maior sincronia das ovulações (CHUPIN & PELOT, 1978). Cavalieri et al. (1997) proporcionaram uma melhor compreensão destes achados, ao avaliarem a dinâmica folicular de animais submetidos a um protocolo de sincronização, utilizando dispositivos de progesterona. Estes autores compararam a aplicação de 400UI da eCG, aplicada no momento da retirada da progesterona, com um grupo controle, sem a utilização da eCG, podendo observar uma redução significativa na variação do tempo entre o tratamento até o pico de LH (eCG: 36,8-53,0h; controle: 35,7-95,6h) e do tratamento até as ovulações (eCG: 60,8-82,5h; controle: 65,8-114,0h).

Rossa (2002) não observou diferenças na taxa de prenhez de animais tratados com 500UI da eCG no momento da retirada da progesterona, ou o emprego de um indutor da ovulação, administrado 24h depois (eCG: 41,9%; indutor da ovulação: 44,4%). No

entanto, naqueles animais que apresentavam menos de 45 dias pós-parto, a eCG foi mais eficiente em promover a ovulação, resultando em maiores taxas de prenhez (eCG: 47,2%; indutor da ovulação: 15,4%). Sá Filho et al. (2008) afirmaram que a dupla ação da eCG (LH e FSH) e sua longa ação minimizam o comprometimento da liberação do LH, criando condições do folículo crescer e ovular, assim, em animais com alguma limitação de liberação do LH, o tratamento com eCG se torna essencial para elevar a taxa de ovulação e promover uma melhoria dos índices reprodutivos.

Desta forma, baseado nas características da eCG, sua utilização mostrou-se compensatória em rebanhos com baixa taxa de ciclicidade (BARUSELLI et al., 2004b), em animais recém paridos - com menos de 60 dias pós parto (RODRIGUES et al., 2004), com baixa condição corporal (BARUSELLI et al., 2004a; ROCHA et al., 2007) e em novilhas não cíclicas (SÁ FILHO et al., 2005), no entanto, não foi verificado incremento em animais que não se incluam nestas situações (BÓ et al., 2003; BARUSELLI et al., 2006).

Em novilhas, particularmente, a progesterona exerce um maior feedback sobre a pulsatilidade do LH, a ponto de comprometer o crescimento folicular (CARVALHO et al., 2008) e as ovulações (CIPRIANO et al., 2011). Nesse sentido, a eCG poderia apresentar um efeito compensatório sobre o maior bloqueio do LH.

Sendo assim, Marques et al. (2005) conduziram um experimento para avaliar a importância do eCG em novilhas expostas a diferentes níveis de progesterona. Para tanto, os animais tiveram a onda induzida pelo emprego de implante intravaginal de progesterona e 2mg de benzoato de estradiol (considerado dia 0). No dia 8 os implantes foram removidos e aplicados prostaglandina como agente luteolítico. No dia posterior utilizaram como indutor da ovulação o benzoato de estradiol e os grupos experimentais estavam assim definidos: grupo controle - não recebeu nenhum tratamento adicional; grupo PGF - recebeu uma dose de PGF2α no Dia 0; Grupo eCG - recebeu 400 UI de eCG no Dia 8 e o Grupo PGF/eCG recebeu ambos os tratamentos. A idéia inicial de que maiores quantidades de progesterona poderiam ser compensada pelo eCG não foi confirmada, pois uso da PGF no D0 não apresentou efeito na resposta ao tratamento de sincronização, ainda assim, foi possível observar que os animais que receberam a eCG apresentaram maiores taxas de prenhez (Com eCG: 34,9%; Sem eCG: 15,7%).

Diante do exposto, considera-se que a inclusão da eCG nos protocolos de indução da ovulação está relacionada a um aumento da taxa de concepção por: 1) tornar mais presente e preciso o pico pré-ovulatório do LH (CAVALIERI et al., 1997), 2) incrementar o crescimento dos folículos, tornando-os mais responsivo aos indutores da ovulação e, 3) aumentar a taxa de ovulação, principalmente dos animais em anestro (BARUSELLI et al., 2006).

Utilização dos ésteres de estradiol na indução da ovulação.

Os estrógenos são esteróides naturais constituídos por 18 átomos de carbono e têm como principais compostos o 17β-estradiol, a estrona e o estriol. Em bovinos e outras espécies, o estradiol é sintetizado principalmente nos folículos dominantes por uma série de enzimas responsáveis em converter o colesterol em pregnenolona, depois em andrógenos e finalmente em estradiol. Além dos ovários, existem muitos outros tecidos que podem produzir estrógenos como a placenta, o córtex adrenal, os testículos, o cérebro, ossos, etc; adicionalmente, o tecido adiposo pode contribuir significativamente para o aumento do pool de estrógenos disponíveis (NELSON & BULUN, 2001).

Quando administrado na ausência da progesterona estes hormônios são capazes de estimular a liberação de GnRH/LH e promover a ovulação do folículo dominante (HAFEZ & HAFEZ, 2004). Para Crepaldi (2009), esta característica fez com que uma variedade de compostos sintéticos com atividade similar aos esteróides naturais fossem sintetizados, e atualmente seu uso têm sido frequentemente associado a programas reprodutivos. Nesse sentido, os estrógenos mais utilizados como indutores da ovulação são o 17β-estradiol, o benzoato de estradiol, o valerato de estradiol e o cipionato de estradiol (SOUZA et al., 2005).

Souza (2008) salientou que diferenças relacionadas com a estrutura e polaridade molecular entre os ésteres de estradiol resultam em diferentes padrões de liberação da molécula biologicamente ativa, o estradiol-17β. Ainda segundo este autor, a quantidade de estradiol-17β disponível nestes ésteres podem determinar a ação farmacológica

destes compostos sobre o desenvolvimento folicular e o surgimento do pico pré- ovulatório de LH.

Esta afirmação pode ser melhor compreendida a partir do trabalho de Vynckier et al. (1990), os quais objetivaram determinar o perfil de liberação do estradiol-17β após a administração de 10mg dos ésteres, benzoato de estradiol e cipionato de estradiol, aplicados durante a fase lútea em bovinos. Os autores verificaram que 16 a 66 horas antes da ovulação as concentrações plasmáticas de estradiol-17β variaram entre 11 e 28pg/mL. As principais diferenças observadas foram que a utilização do cipionato de estradiol resultou em um menor pico de estradiol-17β (cipionato de estradiol: 56- 128pg/mL e benzoato de estradiol: 222-320pg/mL), surgindo mais tardiamente (cipionato de estradiol: 13-31h e benzoato de estradiol: 1-23h), mas que persistia por um maior intervalo até retornar aos níveis basais (cipionato de estradiol: 170±10h e benzoato de estradiol: 114±10h). Um perfil de disponibilidade semelhante foi constatado por Souza et al. (2005) ao trabalharem com 1mg do estradiol-17β ou 1mg dos ésteres benzoato de estradiol e cipionato de estradiol. Os autores observaram que os maiores picos de concentração ocorreram com a aplicação do estradiol-17β, seguido do benzoato de estradiol e cipionato de estradiol (respectivamente: 12,8±4,0pg/mL; 9,6±3,5pg/mL; 3,4±0,2pg/mL). O tempo decorrido entre a aplicação até retornar aos valores iniciais seguiu um grau de grandeza inverso, sendo menores para o estradiol-17β (22,7±4,8h), seguido do benzoato de estradiol (30,7±7,1h) e do cipionato de estradiol (50,7±4,8h).

Posteriormente, Bo et al. (1994) puderam verificar que a aplicação de 5mg do estradiol- 17β aplicado intramuscularmente resultava em um pico de concentração 6 horas após o tratamento, retornado aos níveis basais 36h depois. Avaliando a biodisponibilidade do estradiol após administração do valerato de estradiol, Bo et al. (1995a) notaram concentrações elevadas de estradiol-17β 12 a 24 horas após o tratamento, e estes níveis permaneceram elevados acima dos valores basais, por aproximadamente 120h.

Lammoglia et al. (1998), cientes que os ésteres de estradiol não apenas induziam o estro e as ovulações, mas também resultavam em uma maior sincronização destes eventos, conduziram um estudo para avaliar os efeitos de diferentes doses do benzoato de estradiol sobre o perfil de liberação do estradiol-17β e do surgimento do LH pré-

ovulatório. Em seu estudo foram utilizadas vacas e novilhas submetidas a um protocolo com suplementação de progesterona por sete dias e o indutor da ovulação foi aplicado entre 24 e 30h após a remoção do dispositivo. Os autores concluíram que a eficiência da sincronização em protocolos podem ser aumentada pela inclusão do benzoato de estradiol como indutor da ovulação. A dose recomendada foi de 1mg de benzoato de estradiol para vacas e 0,4mg para novilhas. Em seus resultados, puderam observar que as concentrações do estradiol-17β foram elevadas entre 4 a 28 horas pós tratamento, sendo que menores doses resultavam em maior tempo para as concentrações se elevarem. Da mesma forma, o aumento nas concentrações do LH foram afetadas de maneira dose-dependente. Uma dose mínima 0,2mg para novilhas e 0,25mg para vacas foram eficientes em promover o surgimento do pico pré-ovulatório do LH. Estes autores puderam verificar ainda que o pico de LH ocorreu, em média, 21,5 horas após a administração do benzoato de estradiol.

Para avaliar o perfil de liberação do LH induzida pela administração do cipionato de estradiol, Sales et al. (2007) realizaram a aplicação do indutor junto com a remoção do dispositivo de progesterona, no dia oito do protocolo. Foi observado por estes autores que o pico de LH surgiu cerca de 47,5h após o tratamento, e que a duração do pico foi de aproximadamente 17,5h.

Marques et al. (2003) buscaram avaliar o efeito da administração do benzoato de estradiol aplicado 24 horas após a retirada dos dispositivos de progesterona na sincronização e na taxa de ovulação de novilhas primíparas Bos taurus indicus x Bos

taurus taurus. Os autores puderam verificar que o tratamento sincronizou e antecipou a

ovulação de 86,3±4,8h para 69,4±2,0h após a remoção do dispositivo de progesterona, e aumentou a taxa de ovulação de 54,2 % para 80,8%, em relação a fêmeas que não receberam o indutor da ovulação.

Posteriormente, Reis et al. (2004) compararam a administração de 1,0mg benzoato de estradiol e 0,5mg de cipionato de estradiol aplicados como indutores de ovulação em dois momentos distintos (dia oito do protocolo, junto com a remoção do dispositivo de progesterona, e dia nove). Os autores chegaram a conclusão que ambos tratamentos proporcionaram elevadas taxas de ovulação, independentemente do momento da aplicação dos indutores, no entanto, o cipionato de estradiol não sincronizou a ovulação

no protocolo utilizado. Os resultados encontrados por estes autores para o momento da ovulação utilizando o cipionato no dia oito e no dia nove foram de, respectivamente, 80,0±4,8 e 85,1±4,4 horas após a remoção dos dispositivos. No mesmo ano, Marques et al. (2004) avaliaram os efeitos deste protocolo sobre a fertilidade dos animais e não encontraram diferenças na taxa de concepção entre os grupos experimentais, todavia, quando o experimento foi repetido por Martins et al. (2005), a utilização do cipionato de estradiol resultou em atraso e menor sincronia das ovulações (cipionato de estradiol: 76,8±2,82h e benzoato de estradiol: 67,4±1,69h).

Diante destes resultados, Penteado et al. (2005) buscaram ajustar a dose do cipionato de estradiol aplicados em um protocolo com suplementação de progesterona por oito dias. Foram avaliadas as dosagens de 0,5mg e 1,0mg de cipionato de estradiol, aplicadas junto com a remoção da progesterona, ou 1,0mg de benzoato de estradiol administrado no dia posterior. Os autores observaram que a administração de 1,0mg de cipionato de estradiol promoveu maior taxa de concepção (55,0%) em relação a administração de 0,5mg de cipionato de estradiol (41,0%) ou 1,0mg de benzoato de estradiol (38,4%). No ano seguinte, contudo, Penteado et al. (2006) verificaram que a concepção foi comprometida quando utilizaram 0,5mg de cipionato de estradiol no protocolo, enquanto Ayres et al. (2006), embora não tenham verificado diferenças entre estes tratamentos, relataram que os animais que tiveram as ovulações induzidas com 0,5mg de cipionato, tenderam a ter menores índices de concepção.

Crepaldi et al. (2008) passaram a avaliar a dinâmica folicular e a taxa de prenhez em animais submetidos a protocolos utilizando as dosagens de 1,0mg de cipionato de estradiol ou 1,0mg de benzoato de estradiol aplicados concomitante a remoção da progesterona ou 24h depois, respectivamente. O intervalo entre a retirada do dispositivo de progesterona e a ovulação foi semelhante entre os animais que receberam cipionato de estradiol (72,0±2,0h) e benzoato de estradiol (72,0±0,0h), não diferindo também os índices de prenhez (47,3% e 53,3% para os respectivos tratamentos). Estes resultados foram confirmados por Sales et al. (2008), os quais observaram que o intervalo entre a retirada do dispositivo de progesterona e a ovulação nos animais tratados com cipionato de estradiol foi de 76,0±2,7h e nos animais tratados com benzoato de estradiol, de 76,0±4,1h, sem diferença entre os tratamentos. Baseado no fato do tempo das ovulações não diferirem quando os indutores da ovulação são aplicados em momentos distintos, o

intervalo para realização das inseminações poderiam permanecer inalterados independente do protocolo utilizado.

Relativo ao momento das inseminações, Roelofs et al. (2006) citaram que o intervalo para sua realização depende, principalmente, do tempo de viabilidade do óvulo e dos espermatozóides no trato genital feminino. Roelofs et al. (2005) relataram que a ovulação ocorre aproximadamente 30 horas após o início do cio e que o melhor momento para se realizar a IATF encontra-se entre 16 e 26 horas antes da ovulação. Posteriormente, Roelofs et al. (2006) puderam constatar melhores taxas de fertilização e embriões de melhores qualidades quando as inseminações eram realizadas entre 12 e 24h antes da ovulação; em contramão, quando as inseminações se aproximavam deste evento, os resultados para ambos parâmetros diminuíam gradativamente. Considerando que as ovulações acontecem em cerca de 72h após a remoção da progesterona com a utilização do benzoato de estradiol ou do cipionato de estradiol (CREPALDI et al., 2008; SALES et al., 2008), o intervalo para a realização das inseminações quando ocorre em consonância com os achados de Roelofs et al. (2006), não deveriam repercutir em diferenças sobre os índices de gestação.

E de fato alguns estudos apontaram não haver diferença na taxa de concepção de animais inseminados 48h (SALES et al., 2008), entre 52 a 56h (AYRES et al., 2006) e 54 a 58h (PENTEADO et al., 2006) após a remoção da progesterona, quando foi comparada a eficiência de 1mg de cipionato de estradiol ou 1,0mg de benzoato de estradiol aplicados como indutores da ovulação, respectivamente, junto com a remoção da progesterona ou no dia posterior a remoção da progesterona.

No entanto, Castro Júnior et al. (2008) ao realizarem um experimento com implantes previamente utilizados para avaliar dois momentos distintos para a realização das inseminações, verificaram que animais que receberam o cipionato de estradiol apresentaram uma reduzida taxa de prenhez quando foram submetidos a inseminação pelo turno da tarde (manhã: 49,5% e tarde: 38,5%), sendo o mesmo não observado nos animais tratados com benzoato de estradiol (manhã: 54,4% e tarde: 60,4%).

Estes resultados levaram Crepaldi (2009) a realização de um delineamento semelhante, comparando o efeito da reutilização de implantes de progesterona sobre a taxa de

concepção de fêmeas Nelore inseminadas em turnos diferentes. O autor observou que a taxa de concepção não diferiu quanto a escolha do indutor ou o momento das inseminações com a utilização de implantes novos, todavia, o emprego de implantes previamente utilizados resultou em menores índices de concepção nos animais inseminados à tarde (48,3%) em relação àqueles inseminados no turno da manhã (60,7%). O autor pôde ainda constatar que a redução da taxa de concepção dos animais inseminados à tarde ocorreu devido à utilização do cipionato de estradiol (35,5%) e que nos demais grupos experimentais as taxas de concepção não diferiram entre si.

3 ARTIGO CIENTÍFICO

Introdução

A inseminação artificial (IA) é uma técnica mundialmente difundida e cumpre um importante papel no aproveitamento de indivíduos de maior mérito genético, contudo, dificuldades relacionadas com a observação do cio e momento das inseminações passam