Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador-Bahia 2012
COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES INDUTORES DA OVULAÇÃO E DO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL SOBRE A TAXA DE CONCEPÇÃO DE
VACAS INSEMINADAS EM TEMPO FIXO
Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Mestrado em Medicina Veterinária Tropical
Salvador-Bahia 2012
COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES INDUTORES DA OVULAÇÃO E DO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL SOBRE A TAXA DE CONCEPÇÃO DE
VACAS INSEMINADAS EM TEMPO FIXO
BRUNO HENRIQUE DE ARAÚJO ANDRADE
COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES INDUTORES DA OVULAÇÃO E DO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL SOBRE A TAXA
DE CONCEPÇÃO DE VACAS INSEMINADAS EM TEMPO FIXO.
Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária Tropical, na área de Reprodução Animal.
Orientador: Antonio de Lisboa Ribeiro Filho
Salvador - Bahia 2012
COMPARAÇÃO ENTRE DIFERENTES INDUTORES DA OVULAÇÃO E DO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL SOBRE A TAXA DE CONCEPÇÃO DE VACAS INSEMINADAS EM
TEMPO FIXO.
BRUNO HENRIQUE DE ARAÚJO ANDRADE
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária Tropical.
Salvador, 29 de fevereiro de 2012.
Comissão Examinadora:
__________________________
Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho - UFBA Orientador
__________________________ Prof. Dr. Alberto Lopes Gusmão - UFBA
___________________________ Prof. Dr. Rodrigo Freitas Bittencourt - UNIME
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Andrade, Bruno Henrique de Araújo.
Comparação entre diferentes indutores da ovulação e do momento da inseminação artificial sobre a taxa de concepção de vacas inseminadas em tempo fixo / Bruno Henrique de Araújo Andrade. - 2012.
70 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Salvador, 2012.
1. Bovino - Inseminação artificial. 2. Ovulação - Indução. 3. Folículo. 4. Corpo lúteo.
5. Cipionato. 6. Benzoato. I. Ribeiro Filho, Antonio de Lisboa. II. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia. III. Título.
CDD - 636.20824 CDU - 636.082.454
AGRADECIMENTOS
Aos meus queridos Pais, João Lúcio Albuquerque Andrade, um exemplo vivo de cidadania, retidão e dedicação ao trabalho e Edna Muniz Andrade, pelos ensinamentos, confiança e apoio.
A meus irmãos, Ludovico Neto e Yonara Andrade, pelos momentos de felicidade e sentimento de infância bem vivida. Apesar da distância sempre serão meu elo para os sentimentos mais puros.
Ao agregado familiar, Flávio Andrade, que há tantos anos divide as dificuldades, momentos de alegria e tristeza com tanta perseverança e, na maioria das vezes, com mais otimismo que o necessário.
Aos colegas de curso sem os quais muito deste trabalho não poderia ter sido realizado, em especial Alexandra Soares, Marcos Loiola, Priscila Ferraz e Tess Coutinho.
Aos meus familiares e ao meu tão querido tio Enemerson Muniz pelos conselhos, pela sinceridade, compreensão e estímulo.
Aos professores Lisboa, Chalhoub e Gusmão, pelos ensinamentos, exemplo de simplicidade e integridade e por sempre que preciso, ter podido contar com vossas ajudas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro em forma de bolsa de estudo.
Aos amigos que sempre me apoiaram e compreenderam minha ausência: Mascus, Arley, Juscelino, Júnior (Piaba), Messias, Jaboatã, Neto (Portela), Andiara, Fábio, Cel, Valdivino...
E a todas as demais pessoas aqui não citadas, mas, que de alguma forma contribuíram na realização de mais essa etapa da minha vida profissional.
"Todos os animais são iguais mas alguns são mais iguais que os outros" (George Orwell)
"A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original"
ÍNDICE
página
LISTA DE TABELAS... vii
LISTA DE FIGURAS... viii
LISTA DE ABREVIATURAS... ix RESUMO... x SUMMARY... xii 1 INTRODUÇÃO GERAL... 1 2 REVISÃO DE LITERATURA... 5 2.1Dinâmica folicular... 5 2.2 Ovulação... 10 2.3 Dinâmica lútea... 13
2.4 Controle farmacológico do ciclo estral... 17
2.4.1 Sincronizando a emergência da onda folicular... 17
2.4.2 Terminando a fase luteínica de forma sincronizada... 23
2.4.3 Induzindo a ovulação... 26
3 ARTIGO CIENTÍFICO... 37
LISTA DE TABELAS
página TABELA 3.1 - Média e desvio padrão (SD) das variáveis: diâmetro do
folículo 48h após a remoção do dispositivo de progesterona (FOL-48), diâmetro do folículo ovulatório (FOL-OV), taxa de crescimento folicular (TXCRE), momento das ovulações (OV) e taxa de ovulação (TXOV)...
45
TABELA 3.2 - Taxa de concepção dos animais submetidos aos protocolos de sincronização da ovulação com cipionato de estradiol ou benzoato de estradiol e inseminados em diferentes turnos (Manhã e Tarde)...
LISTA DE FIGURAS
página FIGURA 3.1 - Representação esquemática dos protocolos de sincronização da
ovulação para acompanhamento da dinâmica ovariana...
41
FIGURA 3.2 - Representação esquemática dos protocolos de sincronização da ovulação e do momento das inseminações...
43
GRÁFICO 3.3 - Acompanhamento do diâmetro folicular a partir das 48 horas após a remoção do dispositivo de progesterona para os animais tratados com cipionato de estradiol (CE) ou com benzoato de estradiol (BE)...
LISTA DE ABREVIATURAS
3β-HSD - 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/5-ene-4-ene isomerase AMPc - Adenosina monofosfato cíclico
BPM - Proteína morfogenética óssea cm - Centímetro
cm2 - Centímetro quadrado COX-2 - Cyclooxygenase-2 d - Dia
eCG - Gonadotrofina coriônica equina EGF - Fator de crescimento epidérmico FGF - Fator de crescimento fibroblástico FSH - Hormônio folículo estimulante
GnRH - Hormônio liberador de gonadotrofina h - Hora
IA - Inseminação artificial
IATF - Inseminação artificial em tempo fixo IGF - Fator de crescimento semelhante a insulina LH - Hormônio luteinizante mg - Miligrama mL - Mililitro mm- Milímetro ng - Nanograma pg - Picograma PGE2 - Prostaglandina-E2 PGF2α - Prostaglandina-F2α PKA - Proteína quinase A PKC - Proteína quinase C
StAR - Proteína reguladora aguda estereidogênica TGF - Fatores de crescimento transformantes UI - Unidades internacionais
ANDRADE, BHA. Comparação entre diferentes indutores da ovulação e do momento da inseminação artificial sobre a taxa de concepção de vacas inseminadas em tempo fixo. Salvador, Bahia, 2012. 70p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária Tropical) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2012.
RESUMO
Objetivou-se avaliar a dinâmica ovariana e a taxa de concepção de fêmeas Nelore submetidas a inseminação artificial em tempo fixo utilizando o benzoato de estradiol ou o cipionato de estradiol como indutores da ovulação e inseminadas nos turnos da manhã ou da tarde. Para tanto, 298 animais receberam um dispositivo intravaginal de progesterona e a aplicação de 2,0mg benzoato de estradiol em um dia aleatório do ciclo estral, denominado D0. Os implantes foram removidos oito dias após, concomitante a administração de 500µg de Cloprostenol e 300UI de gonadotrofina coriônica equina. Neste momento, metade dos animais recebeu 1,0mg de cipionato de estradiol, e à outra metade, foi administrado 1,0mg de benzoato de estradiol no dia posterior (D9), constituindo os tratamentos CE e BE, respectivamente. No experimento 1, foram selecionados casualmente 38 animais (19 em cada tratamento) para acompanhamento da dinâmica ovariana, iniciada no D10, realizada a cada 8h até as 20:00h do D12. O diâmetro do corpo lúteo foi mensurado 8 dias após. No experimento 2, foram utilizados 260 animais aleatoriamente distribuídos de acordo com os tratamentos (CE e BE) para que as inseminações ocorressem pelo turno da manhã (M) ou da tarde (T) do D10, constituindo os grupos CE-M (n=65), BE-M (n=65), CE-T (n=65) e BE-T (n=65). O Diagnóstico de gestação foi realizado 55 dias após as inseminações. Não foi encontrada diferença entre os tratamentos para as variáveis: Diâmetro do folículo ovulatório (CE:13,3±2,3mm; BE:12,7±1,9mm), momento das ovulações (CE:74±6,01h; BE:74,88±7,41h), taxa de ovulação (CE:100%; BE: 89,5%) e diâmetro do CL (CE:17,1±3,8mm; BE: 17,4±2,9mm), no entanto, os animais tratados com cipionato de estradiol apresentaram maior taxa de crescimento folicular (CE:0,48mm/dia; BE: 0,29mm/dia). No experimento 2, não houve diferença na taxa de concepção entre os grupos CE-M (52,3%), BE-M (41,5%), CE-T (41,3%) e BE-T (49,2%). O emprego do
cipionato em substituição ao benzoato proporciona uma redução no número de manejos sem comprometer os índices de concepção. Adicionalmente, a extensão no intervalo para realização das inseminações (manhã e tarde), revela-se como uma alternativa aos modelos de gestão no uso desta biotecnologia.
Palavras-chave: Dinâmica ovariana, IATF, Cipionato de estradiol, Benzoato de estradiol.
ANDRADE, BHA. Comparison of cypionate and estradiol benzoate in ovulation inducer protocols on ovarian dynamics and conception rate of Nelore females inseminated at different times. Salvador, Bahia, 2012. 70p. Dissertation (Master of Science in Tropical Veterinary Medicine) - School of Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, 2012.
SUMMARY
We aim to evaluate the ovarian dynamics and conception rates of Nelore females subjected to fixed time artificial insemination using estradiol benzoate or estradiol cypionate as ovulation inducers and inseminated that morning or afternoon. Therefore, 298 animals received an intravaginal progesterone device and 2,0mg of estradiol benzoate applied on a random stage of the oestrous cycle, named D0. The devices were removed after eight days and at the same time 500µg of Cloprostenol and 300IU of equine chorionic gonadotropin were administered. At that time, half of the animals received 1,0mg of estradiol cypionate, and the other half received 1,0mg of estradiol benzoate on the following day (D9), establishing the EC and EB treatments respectively. On experiment 1, 38 animals were randomly selected (19 for each treatment) for the ovarian dynamics follow up which started on the D10, and at every 8h until 8pm of the D12. The diameter of the corpus luteum (CL) was taken after 8 days. On experiment 2, 260 animals were randomly distributed according to treatments (EC and EB) in order for the inseminations to occur in the morning (M) or in the afternoon (T) of D10, establishing thus groups EC-M (n=65) and EB-T (n=65). The gestational diagnosis was done 55 days after inseminations. No difference was found between the treatments for the variables: diameter of ovulatory follicle (EC:13,3±2,3mm; EB:12,7±1,9mm), time of ovulation (EC:74±6,01h; EB:74,88±7,41h), ovulation rate (EC:100%; EB: 89,5%) and diameter of CL (EC:17,1±3,8mm; EB: 17,4±2,9mm), however, the animals treated with estradiol cypionate presented a greater follicular growth rate (EC:0,48mm/day; EB: 0,29mm/day). On experiment 2, there was no difference in the conception rate between the groups EC-M (52,3%), EB-M (41,5%), EC-T (41,3%) e EB-T (49,2%).The employment of the estradiol cypionate in substitution to the estradiol benzoate provided a reduction in animal manipulation without compromising the conception rates. Additionally, the extension of the
insemination interval (morning and afternoon) seems to be an alternative for the management models using this technology.
1 INTRODUÇÃO GERAL
A bovinocultura brasileira passa por uma fase de reconhecimento da importância das tecnologias aplicadas no setor produtivo. Para se ter uma idéia, entre os anos de 1996 e 2007 a produção brasileira passou de um quantum correspondente a 6.045 mil toneladas de equivalente-carcaça para 9.115 mil toneladas (FAMATO, 2008) e espera-se que termine 2011 com 9.365 mil toneladas (GIRA, 2010). Comparativamente, a produção nacional apresenta crescimento maior que o aumento do consumo doméstico, assim, o Brasil dispõe de um excedente que vem sendo absorvido pelas exportações, o que permitiu à bovinocultura nacional representar a maior fatia do agronegócio brasileiro (MAPA, 2011), oferecendo cerca de 7,5 milhões de empregos e gerando um faturamento de mais de R$ 50 bilhões/ano (ABIEC, s.d).
De acordo com Torres-Júnior (2009), a perspectiva de retorno financeiro nas propriedades rurais aumenta por meio da eficiência nos sistemas de produção e este retorno pode ser intensificado pelo uso eficiente das técnicas de manejo e biotecnologias aplicadas à reprodução animal. Neste sentido, a adoção de estações de monta e o emprego de indivíduos com maior mérito genético tornam-se fundamentais para elevar os índices de produção, permitir a antecipação dos partos e a eficiência reprodutiva, além de incrementar o ganho genético dos animais de reposição e o valor comercial das crias.
A inseminação artificial insere-se neste contexto como uma importante ferramenta pela possibilidade da utilização em massa de indivíduos melhoradores e permitir um aumento da produção de carne por hectare, aspectos estes, que levaram Sá Filho et al. (2008) a considerarem esta biotecnologia a geradora de maior impacto econômico na produção de bovinos. Contudo, problemas relacionados à detecção de cios, baixo número de animais inseminados e, principalmente, a necessidade de mão de obra em tempo integral, conduziram a busca por alternativas que contornassem estes problemas, sem que houvesse comprometimento nos índices reprodutivos (BARUSELLI et al., 2004b).
A inseminação artificial em tempo fixo (IATF) consiste em uma tecnologia capaz de sincronizar as ovulações, possibilitando a inseminação de um grande número de animais em um momento mais apropriado a técnicos e produtores dispensando assim, a necessidade da observação de cios (TORRES-JÚNIOR et al., 2009). Além disso, Baruselli et al. (2006) citaram que o emprego de protocolos de sincronização utilizando a progesterona assume um importante papel na retomada da ciclicidade estral dos animais no pós-parto, situação comum nas condições de criação extensiva do rebanho brasileiro.
O tratamento padrão segundo estes autores, consiste na inserção de um dispositivo/implante de progesterona e a aplicação concomitante de 2mg de benzoato de estradiol em um dia aleatório do ciclo estral; no momento da retirada da progesterona, cerca de sete a oito dias após sua inserção, são utilizados análogos da prostaglandina com a finalidade de promover a regressão de um possível corpo lúteo presente, seguido da administração de agentes responsáveis por induzirem a ovulação do folículo dominante. Neste ponto, o custo dos hormônios derivados do estradiol, tornam os chamados ésteres de estradiol, a alternativa mais viável dentre os indutores da ovulação atualmente disponíveis no mercado (LOGUERCIO, 2005), ainda assim, particularidades quanto a estrutura química e a polaridade molecular destes hormônios levaram alguns pesquisadores a investigarem os efeitos de suas utilizações sobre o padrão de liberação do estradiol-17β, molécula com efetiva atividade biológica, e os consequentes eventos relacionados com a ovulação (SOUZA, 2008).
Diante do exposto, foi constatado que a utilização do benzoato de estradiol resultava em maiores níveis séricos do estradiol-17β e que este persistia por um menor intervalo de tempo em relação à utilização do seu análogo, o cipionato de estradiol (VYNCKIER et al., 1990; SOUZA et al., 2005). Diferenças também foram relatadas quanto ao surgimento do pico pré-ovulatório do hormônio luteinizante (LH), os quais foram observados em cerca de 21,5h posterior a administração do benzoato de estradiol, aplicado entre 24 a 30h após a remoção da progesterona (LAMMOGLIA et al., 1998); o mesmo evento foi observado ocorrendo em média 47,5h com a utilização do cipionato de estradiol aplicado no momento da retirada da progesterona (SALES et al., 2007).
Estudos sobre a dinâmica folicular mostraram que estas diferenças poderiam ser tomadas como benefícios ao se elaborar protocolos de sincronização, a exemplo os trabalhos de Reis et al. (2004) e Martins et al. (2005), os quais observaram que a administração de cipionato de estradiol aplicado concomitante a retirada do dispositivo de progesterona, promovia ovulação dos folículos cerca de 72 horas após seu uso, resultando em um momento semelhante à administração do benzoato de estradiol, aplicado 24h depois da remoção dos dispositivos. Todavia, Reis et al. (2004) salientaram que o cipionato de estradiol não era capaz de sincronizar a ovulação dos animais tratados com progesterona. Martins et al. (2005), ao encontrarem uma maior dispersão para o momento das ovulações usando este éster, classificou-o como menos eficiente do que o benzoato de estradiol em sincronizar as ovulações. Estes resultados opõem-se aos achados de Crepaldi et al. (2008), os quais observaram que as ovulações ocorriam de forma sincronizada, em média, 70h±2,0h e 70h±0,0h após a remoção da progesterona, com a utilização do cipionato de estradiol e do benzoato de estradiol, respectivamente.
O fato do momento das ovulações não diferirem com a utilização do cipionato ou do benzoato são complementados aos achados de alguns pesquisadores que ao compararem a inclusão destes hormônios nos protocolos de sincronização da ovulação não verificaram diferenças nas taxas de concepção quando as inseminações foram realizadas 48h (SALES et al., 2008), entre 52 e 56h (AYRES et al., 2006) e entre 54 e 58h (PENTEADO et al., 2006) após a remoção da progesterona. Portanto, apesar das divergências de informações quanto a capacidade de sincronia das ovulações pelo cipionato de estradiol, há indícios que este hormônio possa ser utilizado sem que haja alterações na taxa de concepção dos animais inseminados em tempo fixo. Adicionalmente, a utilização do cipionato de estradiol quando realizada no dia da remoção da progesterona, tem como vantagem uma redução no número de intervenções aos quais os animais são submetidos e uma redução no custo operacional, aumentando desta forma, a simplicidade e a eficiência dos protocolos de sincronização do estro.
Seguindo esta linha de raciocínio, a inclusão de um maior número de animais a serem inseminados no mesmo dia e submetidos a um único protocolo poderia maximizar a eficiência desta biotecnologia. A alternativa passa ser então, explorar ao máximo o intervalo para realização das inseminações. Diversos estudos têm demonstrado que o
tempo para realização das inseminações artificiais deve estar em consonância com a previsão das ovulações (PURSLEY et al., 1997; ROELOFS et al., 2006; AYRES et al., 2008). Roelofs et al. (2005) relataram que o melhor momento para se realizar a IATF encontra-se entre 16 e 26 horas antes da ovulação. Posteriormente, Roelofs et al. (2006) constataram melhores taxas de fertilização quando as inseminações ocorreram entre 36 a 12h antes das ovulações e embriões de qualidade superior nas inseminações realizadas 24 a 12h pré-ovulação.
Respeitando estes intervalos para realização das inseminações, a utilização dos ésteres de estradiol em questão não refletiram diferenças nos índices de fertilidade, quando as inseminações foram efetuadas 48h (turno da manhã) ou 54h (turno da tarde) após a remoção do dispositivo de progesterona, ao se empregar o cipionato de estradiol (ANDRADE et al., 2010) ou o benzoato de estradiol (AYRES et al., 2008). Contrariando estes achados, alguns pesquisadores relataram uma redução na taxa de concepção quando o cipionato de estradiol foi utilizado nos protocolos de indução da ovulação e as inseminações foram realizadas no período da tarde (CASTRO JÚNIOR et al., 2008; CREPALDI, 2009).
Portanto, tendo em vista estes aspectos, o presente trabalho objetivou avaliar a dinâmica ovariana (Experimento 1) e a taxa de concepção (Experimento 2) de fêmeas Nelore submetidas a inseminação artificial em tempo fixo, utilizando o benzoato de estradiol ou o cipionato de estradiol como indutores da ovulação, e inseminadas nos turnos da manhã ou da tarde.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Dinâmica folicular
Os folículos surgem no ovário do feto bovino entre 220 e 240 dias de gestação e ao nascer a bezerra possui de 75.000 a 300.000 ovócitos (SNEL-OLIVEIRA et al., 2003). A cada onda folicular é recrutado um determinado número de folículos e devido esta população inicial não ter seu estoque renovável, a senescência animal leva consigo uma redução progressiva no número de folículos primordiais. Ao final da vida reprodutiva do bovino (10 a 15 anos) o número de ovócitos é reduzido a cerca de 3.000 (ERICKSON, 1966).
A dinâmica ovariana segundo a definição de Binelli et al. (2009), refere-se ao gerenciamento do conjunto de gametas presentes nos ovários, o que inclui a formação do conjunto inicial de folículos e a saída irreversível desse conjunto devido à atresia folicular ou, ativação e desenvolvimento seguido da luteinização.
Neste contexto, o estudo de Rajakoski (1960) foi o primeiro a propor a existência de ondas foliculares durante os ciclos estrais em bovinos, no entanto, esta afirmação permaneceu controversa até a utilização da ultrassonografia nos modelos de experimentação animal. Com advento desta tecnologia, pôde-se comprovar que o crescimento folicular de fêmeas zebuínas e taurinas ocorrem em padrão de ondas (SAVIO et al., 1988; SIROIS & FORTUNE, 1988).
Sendo assim, a dinâmica de raças européia foi caracterizada pela presença de duas a três ondas de crescimento folicular (SIROIS & FORTUNE, 1988; ROCHE et al., 1998) e esporadicamente quatro ondas (SAVIO et al., 1988; SIROIS & FORTUNE, 1988). Em fêmeas Bos taurus indicus são necessárias de duas a quatro ondas foliculares para que o folículo alcance a capacidade ovulatória (FIGUEIREDO et al., 1997). O predomínio de duas ondas, por sua vez, foi observado em vacas Nelore, ao passo que em novilhas foi verificado um predomínio de três ondas foliculares (BARROS et al., 1995; FIGUEIREDO et al., 1997). Todavia, o número de ondas por ciclo estral não está totalmente estabelecido, Borges et al. (2004), por exemplo, observaram uma maior
proporção de vacas Nelore (66,7%) apresentando 3 ondas, sendo o mesmo padrão constatado em animais mestiços Bos taurus taurus x Bos taurus indicus (58,3%), por Borges et al. (2001).
Peter et al. (2009) afirmaram que cada onda folicular é iniciada quando um grupo de pequenos folículos primordiais anteriormente recrutados continua sob uma taxa de crescimento comum e independente da ação das gonadotrofinas. A aquisição de dependência por esta classe hormonal leva a um processo de seleção até que um deles começa a diferenciar-se. Neste ponto, um folículo selecionado passa exercer dominância sobre os demais, suprimindo seu crescimento e inibindo o recrutamento de novos folículos (SIROIS & FORTUNE, 1988; ROCHE et al., 1998). Gimenes et al. (2008) observaram que os folículos subordinados cessam seu ritmo de crescimento entrando em atresia, enquanto o folículo dominante segue a uma taxa de crescimento constante, até alcançar a capacidade ovulatória, caso contrário, perde a dominância e torna-se atrésico. Peter et al. (2009) complementaram que ao final do processo de atresia do folículo selecionado uma nova onda de crescimento folicular emerge. Desta forma, a dinâmica ovariana folicular revela-se como um processo cíclico, podendo ser caracterizado a partir do processo de ativação, em quatro fases distintas: recrutamento (emergência), desvio (divergência), dominância e atresia, sendo cada uma delas controlada por mecanismos específicos (SAVIO et al., 1988; LUCY et al., 1992; SENGER, 2003).
A ativação de folículos ocorre de forma continua e a taxa de ativação está negativamente relacionada ao número de folículos quiescentes remanescentes no ovário. Os mecanismos envolvidos na ativação são pouco compreendidos, no entanto, sabe-se que não dependem de estímulo do hormônio folículo estimulante - FSH (WANDJI et al., 1996). Contudo, fatores ativadores produzidos tanto nas células da granulosa quanto do próprio ovócito atuam por mecanismos autócrinos e parácrinos (WEBB et al., 2004; BURATINI JÚNIOR, 2006; BINELLI et al., 2009; LEITÃO et al., 2009).
Desta forma, embora o antro e receptores de FSH sejam detectados em folículos com cerca de 128µm de diâmetro (LUNDY et al., 1999), os folículos apenas adquirem dependência do FSH quando atingem cerca de 3 a 4 mm (WEBB & ARMSTRONG, 1998), o que coincide com o diâmetro possível de serem visualizados em imagem
ecográfica e com o início da emergência folicular (PETER et al. 2009). Fatores relacionados com a responsividade dos folículos ao FSH incluem: as inibinas, ativinas, fator de crescimento epidérmico (EGF), membros da família dos fatores de crescimento transformantes-β (TGF-ß), TGF-α, fator de crescimento semelhante a insulina (IGF), fator de crescimento fibroblástico (FGF), a proteína morfogenética óssea (BPM), dentre outros (LEITÃO et al., 2009). Segundo Webb et al. (2004), estes fatores são incumbidos de promover uma pré-seleção de folículos com mais de 1mm e o crescimento diferenciado de um reduzido número de folículos até as etapas posteriores.
O momento da emergência folicular foi estudado por Jaiswal et al. (2004), tomando como referência a visualização de folículos com mais de 4mm. Foram utilizadas novilhas e vacas, nas quais os autores determinaram o momento da ovulação como dia zero, para acompanhamento do desenvolvimento das ondas foliculares subsequentes. Animais que apresentavam duas ondas foliculares a emergência da onda ocorria nos dias zero e 10, enquanto que animais com três ondas foliculares, a emergência foi verificada nos dias zero, nove e 16. Usando um delineamento semelhante e tomando como referência a visualização de folículos apresentando entre 4 e 5mm, Borges et al. (2004) observaram que a emergência em fêmeas Nelore ocorria nos dias 0,8 e 9,8, para animais que apresentavam duas ondas foliculares, e nos dias 0,5; 8,1 e 14,6 para animais com três ondas.
Adams et al. (1992) comentaram que antecedendo a emergência folicular ocorre um aumento das concentrações plasmáticas de FSH. Segundo Lucy et al. (1992), este hormônio é responsável por sustentar o crescimento de um número de folículos por um período em que são produzidas quantidades crescentes de inibina e estradiol. Ao final deste processo, um pequeno número de folículos são selecionados; os demais folículos, tornam-se atrésicos e sofrem regressão, sendo este processo denominado de divergência ou desvio folicular. Ginther et al. (1996, 2001) definiram este processo, como o momento em que se observam diferenças entre as taxas de crescimento de dois maiores folículos e declínio no crescimento dos folículos remanescentes.
Neste contexto, estudos com a dinâmica ovulatória de novilhas Nelore constataram que o desvio folicular ocorria 2,5 dias após a primeira ovulação (GIMENES et al., 2008) e que neste momento os animais apresentavam um diâmetro médio do folículo dominante
de 6,2±0,2mm, enquanto o diâmetro dos folículos subordinados foi de 5,8±0,2mm (GIMENES et al., 2005). Sartorelli et al. (2005) avaliaram a influência da categoria animal na dinâmica folicular de fêmeas Bos taurus indicus e concluíram que novilhas apresentavam o desvio folicular ocorrendo em média, 2,8 dias após a ovulação e o folículo dominante apresentavam 5,7mm de diâmetro, enquanto que em vacas, o desvio foi observado mais precocemente, 2,4 dias depois, e possuíam o folículo dominante com diâmetro superior de 6,1mm.
Buratini Júnior (2007) afirmou que um dos mecanismos de atuação do FSH para o desenvolvimento folicular resulta no aumento da expressão de receptores de fatores de crescimento fibroblásticos nas células da granulosa, os quais contribuem para a manutenção do crescimento folicular após a divergência. Para Fortune et al. (2004), o sistema IGF também desempenha um papel crítico entre a emergência e a divergência folicular por apresentar ações sinérgicas ao FSH na promoção do crescimento folicular e produção de estradiol. Beg et al. (2002) relataram que as concentrações de IGF livre do maior folículo foram expressadas mesmo antes de se observarem diferenças na concentração de estradiol ou no diâmetro dos folículos selecionados e portanto, é provável que a dominância seja determinada em um período anterior à divergência.
Para Sartori et al. (2001), o crescimento folicular até a divergência está relacionado a eventos endócrinos e celulares marcados por um decréscimo dos níveis de FSH, aumento das concentrações circulantes do estradiol e IGF-1 (fator de crescimento semelhante à insulina - 1) e uma maior expressão de receptores do hormônio luteinizante (LH). Estes elementos são complementados por Ginther et al. (2001), ao afirmarem que o começo do desvio folicular é marcado pelo aumento das concentrações do estradiol; o estradiol por sua vez, promove nas células da granulosa um aumento na atividade da enzima aromatase, proporciona maior número de receptores de LH e consequente troca de dependência do FSH para o LH. Neste contexto, para que o crescimento folicular não cesse, o folículo deve ser previamente preparado para ser responsivo ao LH. Folículos que mais precocemente desenvolvem estes receptores terão maior chance de prosseguir até o momento da dominância (FORTUNE et al., 2004).
O papel do LH em determinar a dominância folicular ainda não está definido, todavia, receptores nas células da teca são essenciais para estimular a produção de andrógenos,
que são precursores da síntese de estradiol nas células da granulosa. O estradiol em sinergismo com a inibina suprime o crescimento dos folículos subordinados e desempenha funções fundamentais ao desenvolvimento folicular (FORTUNE et al., 2004).
Lucy et al. (1992) e Adams et al. (2008) relataram que a dominância folicular é estabelecida quando o folículo dominante inibe o crescimento dos demais folículos (subordinados) e o recrutamento de uma nova onda folicular. A partir da dominância estabelecida, o folículo pode seguir dois caminhos: 1) atinge diâmetro e capacidade ovulatória e responde ao aumento da pulsatilidade do LH, resultando em ovulação ou, 2) na ausência do pico de LH começa a entrar em atresia (FORTUNE, 1994). É interessante notar que o processo de ovulação está condicionado a ambos parâmetros, o fato do folículo alcançar diâmetro ovulatório não implica que ele seja responsivo ao LH, como ficou estabelecido nos trabalhos de Gimenes et al. (2008) e Sartori et al. (2001). Da mesma forma, o folículo pode atingir capacidade ovulatória, mas o pico de LH estando comprometido pela falta de regressão luteal, também acarreta em falhas na ovulação (ADAMS et al., 1992; BROWNING et al., 1994).
O ajuste entre estes eventos, por sua vez, determinam o número de ondas durante o ciclo estral (BORGES et al., 2003). Sendo assim, Figueiredo et al. (1997) demonstraram que o folículo dominante em animais Bos taurus indicus apresentando duas ondas de crescimento folicular, alcançavam diâmetros máximos de 11,3±0,4 e 12,1±0,3mm, para as respectivas primeira e segunda onda; animais com três ondas foliculares tinham os diâmetros máximos de 10,4±0,3; 9,4±0,3 e 11,6±0,3mm, para a primeira, segunda e terceira onda, respectivamente. Diâmetros semelhantes foram relatados por Borges et al. (2004), ao avaliarem a dinâmica folicular em animais Nelore, entretanto, os autores se atentaram ao fato do folículo dominante da segunda onda geralmente apresentar menor diâmetro em relação aos folículos da primeira e terceira onda. Este menor diâmetro foi atribuído à menor duração da onda e consequente, menor tempo disponível para o crescimento folicular, desta forma, os autores puderam concluir que a capacidade ovulatória está associada também, ao tempo de exposição ao LH (BORGES et al., 2004).
De acordo com Sartori & Barros (2011), próximo a fase do estro o folículo pré-ovulatório cresce atingindo seu maior tamanho e maior produção de estradiol. Neste momento, as elevadas concentrações de estradiol permanecem por um período de tempo suficiente para induzir o comportamento de cio e o surgimento do pico pré-ovulatório de LH, o qual desencadeia a ovulação cerca de 24 a 32h depois.
2.2 Ovulação
Ovulação é um processo iniciado com o surgimento do pico pré-ovulatório de LH, e uma vez iniciada a cascata de eventos, ocorre expansão e liberação do complexo cumulus, ovulação e luteinização folicular. Nesta complexa rede de eventos, estão associadas células ovarianas atuando especificamente, diversos mecanismos de sinalização celular e a expressão temporária de genes (RICHARDS et al., 1998; RICHARDS & PANGAS, 2010).
A ovulação, segundo o estudo de Sartori et al. (2001), está dependente da aquisição de receptores de LH nas células da granulosa e consequentemente, da capacidade ovulatória dos folículos. Sendo assim, em um estudo realizado para avaliar se a capacidade ovulatória estava relacionada com o aumento da expressão de receptores de LH, estes autores aplicaram altas doses de LH em animais apresentando folículos nas fases, pré e pós divergência folicular. Para tanto, os folículos foram classificados segundo o diâmetro, entre aqueles que apresentavam 7,0mm; 8,5mm e 10mm. Foram observados que apenas folículos com mais de 10mm de diâmetro foram responsivos à aplicação de 40mg de LH - dos quais 80% ovularam; folículos que não tinham atingido a divergência (<8,5mm) não foram responsivos.
Em uma outra parte do mesmo estudo, Sartori et al. (2001) verificaram ainda que a dose do LH influenciava significativamente a indução da ovulação. Após a administração de 24mg de LH, 69,2% dos folículos apresentando 10,0mm de diâmetro ovularam, entretanto, apenas 7,7% dos folículos responderam ao tratamento de 4mg do indutor.
Estes resultados mostram que a ovulação está condicionada à aquisição de receptores de LH pelo folículo dominante e ao aumento das concentrações do hormônio luteinizante.
No entanto, durante o ciclo estral natural, o pico pré-ovulatório de LH permanece oprimido devido as elevadas concentrações de progesterona impedirem o estradiol de exercer feedback positivo a nível hipotalâmico (BROWNING et al., 1994). Para melhor entendimento do padrão de liberação do LH durante o ciclo estral, Rahe et al. (1980) avaliaram as concentrações séricas deste hormônio durante três períodos do ciclo estral: três dias pós-ovulação (início da fase luteal) - os animais apresentavam um padrão de secreção de alta frequência e baixa amplitude; entre os dias 10 e 11 (fase luteínica intermediária) os pulsos de LH foram caracterizados por baixa frequência e alta amplitude, e entre os dias 18 e 19 do ciclo tanto a frequência quanto a amplitude eram aumentadas.
Para Ribeiro Filho (2001), as elevadas concentrações de progesterona durante a fase luteal determinam um padrão de liberação de LH característico de alta amplitude e baixa frequência, todavia, após a lise do corpo lúteo, este padrão de liberação é alterado e passa a ocorrer a episódios de alta frequência. Binelli et al. (2006), atribuíram ao aumento da frequência de pulsos de LH um acelerado crescimento final do folículo e o acúmulo de estrógeno, que irão resultar no pico de liberação de LH induzindo a ovulação do folículo dominante.
Sartori & Barros (2011) esclareceram que após a luteólise as concentrações de progesterona diminuem enquanto as quantidades de estradiol produzidas pelo folículo dominante aumentam. O pico pré-ovulatório do LH coincide com o início do estro e a ovulação ocorre em média, 24 a 32h após. Pinheiro et al. (1998) observaram que o intervalo entre o início do estro e a ovulação foi de 27,7±2,4 e 26,1±1,2h para novilhas Nelore que tiveram o estro induzido pela aplicação de prostaglandina-F2α (PGF2α) ou no estro natural, respectivamente; em vacas, estes intervalos foram de 26,8±0,8 e 28,0±0,9h.
Desta forma, Ferreira (2010), considerou o LH como o principal hormônio envolvido no processo da ovulação e atribui a este, uma série de eventos coordenados de ativação e inibição de genes e eventos relacionados com o rompimento da parede folicular. Segundo este autor, o LH está envolvido também na produção da hialuronidase e estímulo a cyclooxygenase-2 (COX-2), uma enzima essencial para síntese de prostaglandinas. A Hialuronidase é responsável por dissociar as células da granulosa e
promover a expansão do cumulus, enquanto que a prostaglandina-E2 (PGE2) aumenta a produção de plasmina, que participa da remodelagem tecidual (RICHARDS et al., 2002; FERREIRA, 2010).
Richards et al. (2008) avaliaram a ovulação sob vários aspectos e a comparou a uma resposta inflamatória aguda pelas características apresentadas: vasodilatação, hiperemia, edema, exsudação, colagenólise, proliferação celular, remodelagem de tecido, além de outras alterações comuns em tecido inflamado. Estes autores ressaltaram que o folículo ovulatório, não participa como um agente passivo durante o processo de ovulação, pelo contrário, ele coordena uma rede de citocinas que envolve não apenas moléculas inflamatórias, mas também a ativação de células imunes e a expressão de genes relacionados a esta função.
A progesterona tem sido sugerida como mediadora da ovulação por apresentar-se aumentada no fluido folicular quando o momento da ovulação se aproxima. Fortune et al. (2009) levantaram a hipótese de um mecanismo de feedback positivo entre a prostaglandina, progesterona e os receptores de progesterona. Segundo Fernandes et al. (2003), os receptores de progesterona produzidos em abundância nas células tecais passariam a atuar na ADAMTS-1 e na catepsina L, proteínas envolvidas na degradação da parede folicular. Ferreira et al. (2011) citaram que o aumento do volume do líquido folicular promove a distensão do folículo e projeta-o à superfície do ovário, enquanto as enzimas encarregam-se do rompimento/fragilização das membranas para exteriorização do oócito.
Smith et al. (1994) afirmaram que após a ovulação as células da teca e da granulosa passam por uma transformação para que as células que antes produziam estradiol passem a secretar progesterona. Nesse processo, a parede do folículo recém rompida dobra-se em pregas e ocorre invasão de fibroblastos, de células endoteliais e células da teca interna. O rompimento de capilares da teca interna resulta em hemorragia com formação de coágulo e a estrutura transitória é denominada corpo hemorrágico (REYNOLDS et al., 2000). As células da teca interna dão origem às pequenas células luteais e as da granulosa originam as grandes células luteais (BRADEN et al., 1988).
Cientes da estreita relação entre a formação do corpo lúteo a partir das células remanescentes do folículo pré-ovulatório, Vasconcelos et al. (2001) e Baruselli et al. (2003) compararam estas variáveis, encontrando uma correlação positiva entre o diâmetro folicular com o diâmetro do corpo lúteo; associado a estes resultados, Vasconcelos et al. (2001) e Ferraz et al. (2010) verificaram que o maior diâmetro do folículo ovulatório estava relacionado com melhores índices de concepção. Desta forma, foi suposto por estes autores que maiores folículos poderiam estar relacionados com a formação de corpos lúteos de maior tamanho e com maior capacidade de produzir progesterona.
Neste contexto, Robinson et al. (2005) experimentaram induzir a ovulação de folículos cujos diâmetros haviam sido monitorados por ultrassonografia transretal. Os animais tiveram a luteólise induzida na presença de folículos que apresentavam, menos ou mais de 10mm de diâmetros, afim de se induzir a ovulação e observar as consequências do diâmetro folicular sobre a produção de estradiol, progesterona e o tamanho do corpo lúteo. A correlação entre o diâmetro do folículo com o diâmetro do corpo lúteo não foi confirmada, ainda assim, folículos com mais de 10mm apresentaram maior capacidade em produzir estradiol no período pré-ovulatório e foram mais eficientes em elevar as concentrações de progesterona entre os dias 3 e 8, pós-ovulação. Desta forma, embora o tamanho do corpo lúteo não esteja diretamente relacionado ao diâmetro do folículo ovulatório, o tamanho e o grau de vascularização folicular antes da ovulação estão diretamente associados à função luteal subsequente.
2.3 Dinâmica lútea
O corpo lúteo é uma glândula endócrina transitória que se desenvolve a partir de um rápido crescimento, diferenciação e luteinização das células do folículo ovulado, cuja principal função é promover a produção de progesterona (SCHAMS & BERISHA, 2004).
Como salientado por Smith et al. (1994), durante o processo de formação do corpo lúteo, a parede do folículo recém rompida dobra-se em pregas e ocorre invasão de fibroblastos, células endoteliais e células da teca interna. As células da teca interna dão
origem às pequenas células luteais, ao passo que as células da granulosa originarão as grandes células luteais (BRADEN et al., 1988; REYNOLDS et al., 2000). Gordon (2003) afirmou que embora tenha sido encontrado receptores nas grandes células luteais, apenas nas pequenas células luteais são eficientes em responder ao estímulo do LH. As grandes células luteais, apesar de não serem tão responsivas ao LH, produzem mais de 80% da progesterona secretada pelo corpo lúteo, sendo responsável pela concentração basal deste hormônio.
Desta forma, o corpo lúteo se torna a estrutura dominante entre os dias 4 e 17 do ciclo estral (HAFEZ & HAFEZ, 2004). Em pesquisas sobre o desenvolvimento luteal em vacas das raças Gir e Nelore, Borges et al. (2003) detectaram o corpo lúteo pela primeira vez por volta do dia 2,6±0,7 após a ovulação. Resultados semelhantes foram encontrados por Viana et al. (1999a), ao trabalharem com vacas Gir, identificaram a massa de tecido luteal por exame ultrassonográfico entre os dias 2 e 5 pós-ovulação, sendo mais frequente o aparecimento no dia 3 (64,29%). Estes resultados parecem diferenciar-se em relação a animais com predisposição a apresentarem maior tamanho do corpo lúteo, a exemplo do trabalho de Kastelic et al. (1990a), os quais observaram a presença de corpos lúteos a partir do dia 0,5 em novilhas Holandesas.
A produção de progesterona pelo recém formado corpo lúteo surge logo após a ovulação, como ficou demonstrado no estudo de Robinson et al. (2005). Ao avaliarem a produção de progesterona em animais Holandeses, estes autores verificaram que as concentrações de progesterona excedia 1,0ng/mL, a partir do segundo dia pós-ovulação. Viana et al. (1999a), caracterizando a fase luteal pela produção de níveis de progesterona acima de 1,0ng/mL, verificaram que este valor era atingido 4,71 dias após a ovulação em vacas da raça Gir. Estes resultados assemelhan-se aos de Robinson et al. (2005), nos quais pequenas quantidades de progesterona puderam ser detectadas com o corpo lúteo em processo de formação luteal. Segundo Wiltbank et al. (1995) os eventos subsequentes de reorganização do tecido luteal, com posterior aumento do fluxo sanguíneo ovariano e do peso do corpo lúteo, levam a um aumento gradativo da síntese de progesterona caracterizando o período de diestro.
Borges et al. (2003) observaram que as concentrações de progesterona seguem um perfil ascendente até o 14º dia do ciclo estral, com as maiores concentrações variando de 3,5 a
5,9ng/mL entre os dias 12,1 e 14,9 do ciclo estral. Viana et al. (1999a) ao associarem a produção de progesterona ao tamanho do corpo lúteo, observaram que as concentrações plasmáticas alcançaram o valor máximo entre os dias 11 e 15 do ciclo (5,28±0,19ng/mL), coincidindo com a estabilização observada após o corpo lúteo atingir seu tamanho máximo (9,64±0,25cm2). Os autores concluíram que a variação observada entre os dias 9 e 14 na concentração de progesterona foi decorrente da maturação funcional da estrutura, e não do aumento na massa do tecido luteal.
Bertan et al. (2006) apontaram que para a progesterona ser sintetizada em grande quantidade, além da diferenciação celular, deve ocorrer um aumento na expressão das enzimas necessárias à conversão do colesterol em progesterona, e das proteínas transportadoras do colesterol para o interior da membrana mitocondrial. No modelo apresentado por Niswender (2002), o colesterol transportado para a membrana mitocondrial interna interage com a enzima P450scc que o cliva, transformando-o em pregnenolona. Este precursor é transportado para o retículo endoplasmático liso pela enzima StAR (proteína reguladora aguda estereidogênica) e, por ação da enzima 3β-HSD (3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/5-ene-4-ene isomerase) é convertido em progesterona. Ainda segundo este autor, o estímulo a síntese de progesterona nas pequenas células luteais se dá pela ligação do LH a um receptor específico, que promove uma maior disponibilidade de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e ativação da proteína quinase A (PKA).
Neste ponto, Rekawiecki et al. (2005) verificaram que a própria progesterona atua em um mecanismo parácrino/autócrino de retroalimentação no corpo lúteo. Ao exporem células luteais a diferentes concentrações de progesterona, esses autores verificaram uma maior expressão gênica para a 3β-HSD, StAR e do citocromo P450scc. Em experimentos semelhantes, a progesterona esteve relacionada também com a síntese de PGE2 (KOTWICA et al., 2003), de receptores de LH (JONES et al., 1992) e de ocitocina (REKAWIECKI & KOTWICA, 2007). Skarzynski & Okuda (1999) trataram células luteínicas com antagonistas específicos da progesterona e verificaram inibição da ocitocina e de prostaglandinas, com exceção da PGF2α, cuja síntese foi aumentada. Os resultados apresentados revelam que a progesterona também teria um efeito protetor sobre as células luteais no início e meio do ciclo estral.
Por outro lado, segundo Silvia et al. (1991) e Spencer et al. (2004), as altas concentrações de progesterona mantidas durante a fase luteal tendem a reduzir seus próprios receptores no hipotálamo e endométrio e aumentar os receptores de ocitocina e estradiol. Tal fato, permite que o estradiol produzido nos folículos passem a agir com mais eficiência sobre estas estruturas (SILVIA et al., 1991). Desta forma, o estradiol de origem folicular aumenta a quantidade de receptores de ocitocina, que é essencial a produção de PGF2α e regressão lútea (GORDON, 2003). McCracken et al. (1999) afirmaram que o estímulo inicial para a produção de PGF2α parece ser a ocitocina de origem neurohipofisária, no entanto, a liberação pulsátil de PGF2α é gerada por um feedback positivo entre as ocitocina luteal e hipofisária.
Bertan et al. (2006) definiram a PGF2α como o principal agente luteolítico responsável por promover a lise e bloquear a síntese de progesterona pelo corpo lúteo, finalizando assim, a fase luteínica. A maior produção de prostaglandina, de acordo com Niswender et al. (2000), passa a atuar diretamente sobre as células luteais interferindo sobre a produção de progesterona e desencadeando eventos relacionados com a apoptose. No modelo apresentado pelo autor, a prostaglandina age como molécula sinalizadora ligando-se a receptores das células luteais para liberação do cálcio intracelular e ativação da PKC (proteína quinase C). A PKC ocupa um dos sítios de ligação da proteína StAR, impedindo que ela transporte o colesterol para a mitocôndria, o que leva a uma menor produção de pregnenolona e consequentemente, de progesterona. Por outra via, o cálcio intracelular liberado, desempenha um papel essencial no processo de degeneração das células esteroidogênicas.
Neste contexto, a regressão dos níveis de progesterona foram observadas no trabalho de Viana et al. (1999a) ocorrendo entre os dias 15 e 21 do ciclo estral, e níveis séricos abaixo de 1,0ng/mL, a partir do dia 17,36±0,32. A regressão luteal ocorreu entre os dias 16 e 21 e o último dia de detecção do corpo lúteo aconteceu, em média, no dia 20,00±0,26 do ciclo. Viana et al. (1999b), ao avaliarem a regressão funcional do corpo lúteo de vacas Gir, definiram o início da luteólise como o momento em que se detectava redução significativa na concentração de progesterona; os autores identificaram que tal evento era acompanhado de uma redução significativa na área do corpo lúteo 48 horas depois. Borges et al. (2003) detectaram ainda, que a duração do corpo lúteo era influenciada pelo número de ondas foliculares, sendo maior em fêmeas Nelores que
apresentavam três ondas (17,9±0,9 dias), do que nos animais que apresentavam duas ondas de desenvolvimento folicular (16,0±0,5 dias).
2.4 Controle farmacológico do ciclo estral
A definição da dinâmica folicular nos termos inicialmente propostos por Savio et al. (1988) e Sirois & Fortune (1988) tornaram possível o embasamento para elaboração dos atuais protocolos hormonais. Segundo Barros & Ereno (2004), a ampliação do conhecimento sobre a fisiologia ovariana ocorrido na última década permitiu o desenvolvimento de diversos protocolos hormonais, capazes de regular o crescimento folicular e o momento da ovulação, possibilitando a inseminação artificial em tempo fixo consolidar-se como uma ferramenta de melhoramento genético e da eficiência reprodutiva no rebanho bovino.
Para Ribeiro Filho (2001), os protocolos de sincronia/indução do estro visando a prática da inseminação em tempo fixo devem ser empregados objetivando: a) ajustar a emergência de uma nova onda folicular, b) terminar a fase luteínica de forma sincronizada e c) sincronizar as ovulações.
2.4.1 Sincronizando a emergência da onda folicular
Os tratamentos visando o controle do ciclo estral inicialmente concentraram-se sobre a sincronização do comportamento do cio como um prelúdio para a inseminação. Os primeiros fármacos utilizados com esta finalidade foram progestágenos sintéticos administrados via oral ou subcutânea, empregados com o objetivo de prolongar o período do diestro, de maneira que a supressão do tratamento resultasse em sincronização do comportamento estral (MACMILLAN, 2010).
Contudo, a necessidade de melhorar os índices de concepção utilizando estes protocolos fez com que pesquisadores buscassem novas estratégias para os programas de sincronização existentes. Nesse sentido, um dos estudos precursores e que provavelmente resultaram em atresia e emergência de uma nova onda folicular surgiram
do trabalho de Wiltbank et al. (1965), que atribuindo as baixas taxas de fertilidade às altas concentrações de progesterona, resolveram incluir o valerato de estradiol como um agente luteolítico nos protocolos. A hipótese dos autores quanto a regressão luteal foi confirmada, no entanto, a possível regressão do pool de folículos com surgimento de uma nova onda folicular subsequente não puderam ser observadas pela falta de ferramentas tecnológicas.
Na década de 90, com o conhecimento dos padrões de ondas foliculares e a possibilidade da utilização da ultrassonografia para acompanhamento da dinâmica folicular, foi possível o entendimento do efeito dos protocolos que suplementavam progesterona e associavam seu uso aos estrógenos (MACMILLAN, 2010).
Desta forma, Bo et al. (1991) constataram que a administração do valerato de estradiol junto a inserção de um implante de progesterona estava associado a uma redução no diâmetro médio dos maiores folículos por um período de cinco dias; posteriormente, os folículos maiores tornavam a aparecer nas imagens ecográficas, possivelmente originados de uma nova onda folicular.
Para melhor elucidar estes acontecimentos, Bo et al. (1993) avaliaram os efeitos do valerato de estradiol em uma onda folicular e suas consequências sobre a emergência da onda subsequente. Para tanto, os animais tiveram seu ciclo estral acompanhado por meio de um aparelho de ultrassonografia para que a administração de 5mg de valerato de estradiol ocorresse nos dias 1, 3 e 6 pós-ovulação. Os principais achados desses autores foram: 1) a administração do valerato de estradiol nos dias posteriores ao processo de seleção folicular (dias 3 e 6) retardou a emergência da próxima onda; 2) animais tratados no final do crescimento da onda (dia 6) não tiveram alterados o início da regressão folicular e o tamanho dos folículos em relação ao grupo controle - sem tratamento; 3) Os animais que tiveram o valerato de estradiol aplicado no dia 1, a regressão folicular foi observada mais precocemente em relação ao grupo controle, acompanhada de uma elevação das concentrações do FSH em relação aos demais grupos do experimento. Estes resultados levaram os autores a concluírem que o efeito supressivo do valerato de estradiol estava dependente do estádio de desenvolvimento folicular e que a emergência precoce de uma nova onda apenas ocorria nos animais tratados ao início da onda (dia 1).
O atraso na emergência da onda observada quando o tratamento ocorre em uma fase posterior à divergência folicular foram atribuídas a incompleta supressão do folículo dominante e ao prolongado efeito do valerato de estradiol suprimindo a nova onda (BO et al. 1995b). Partindo deste princípio, Bo et al. (1994) avaliaram o efeito de um fármaco de ação mais curta, o 17-estradiol - os autores observaram que o tratamento associado ao progestágeno foi eficiente em promover a regressão do folículo dominante, resultando em emergência de uma nova onda folicular, em média 5,2±0,2 dias após o tratamento. Por outro lado, o tratamento sem a associação com a progesterona não suprimiu efetivamente o folículo dominante e a próxima onda emergiu em média, 9,8±1,1 dias após.
Baseado nestes resultados, uma série de experimentos buscaram avaliar o efeito de diferentes ésteres de estradiol sobre o surgimento da nova onda folicular. Thundathil et al. (1998), ao iniciarem o tratamento em um estádio aleatório do ciclo estral, com a utilização de 1mg de cipionato de estradiol associado a um dispositivo de progesterona, constataram uma limitada sincronia no surgimento da nova onda folicular (3,4±2,1 dias). Fato semelhante foi observado por Colazo et al. (2003) ao compararem o efeito de 5,0mg de 17-estradiol ou 1,0mg de cipionato de estradiol, empregados junto a inserção do dispositivo de progesterona - os autores concluíram que a meia vida prolongada do cipionato de estradiol resultava em uma menor sincronia da onda (4,1±0,4 dias), em relação a utilização do 17-estradiol (3,3±0,1 dias).
Rhinehart et al. (2002) realizaram um experimento para comparar a eficácia do 17-estradiol, do benzoato de estradiol e do cipionato de estradiol em induzir regressão do folículo dominante e estimular o recrutamento de nova onda de crescimento folicular em novilhas de corte. Os autores realizaram duas avaliações ultrassonográficas, três e um dia antes da administração de 1,0mg dos estrógenos (considerado D0) para classificá-los nas seguintes fases: em fase de crescimento, estático ou em regressão. Foi verificado que a atresia do folículo dominante três dias após o tratamento ocorreu em 60% das novilhas que receberam o cipionato de estradiol, em 80% das novilhas que receberam o 17-estradiol, e em 100% para aquelas tratadas com benzoato de estradiol. O número de dias para emergência de nova onda folicular (presença de vários folículos
com 5mm) tendeu a ser antecipado nas novilhas tratadas com 17-estradiol (3,0±0,22 dias) e benzoato de estradiol (3,2±0,20 dias), comparado àquelas que receberam o cipionato de estradiol (4,0±0,31 dias).
Atualmente, tem-se atribuído a meia-vida longa do cipionato de estradiol e do valerato de estradiol a emergência de uma onda com intervalo de tempo menos previsível do que a determinada por fármacos de ação mais curta, como o 17β-estradiol (THUNDATHIL et al., 1998; COLAZO et al., 2003) ou o benzoato de estradiol (RHINEHART et al., 2002). Adicionalmente, os efeitos dos estrógenos, de forma geral, foram sintetizados no trabalho de Farias (2004), no qual o autor cita que os estrógenos podem estimular ou inibir a liberação de gonadotrofinas dependendo da sua dose e das concentrações de progesterona circulante. Roche (1996), por sua vez, definiu que a utilização de doses fisiológicas quando aplicadas em animais apresentando pequenas concentrações de progesterona, estimulam a liberação de LH para que ocorra a ovulação. Todavia, quando são associadas altas doses de estrógeno a concentrações elevadas de progesterona, ocorre bloqueio do FSH decorrente da inibição do gene que codifica para subunidade β desta gonadotrofina (ROCHE, 1996).
Além dos estrógenos, a emergência de uma nova onda pode se obtida pela administração de análogos do hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH). O GnRH foi sintetizado pela primeira vez em 1970, surgindo no mercado como uma ferramenta ao tratamento de cistos foliculares em bovinos (MATSUO et al., 1971). Kittok et al. (1973) observaram que repetidas ou a prolongada exposição ao GnRH mimetizava uma onda pré-ovulatória de LH em vacas, promovendo a retomada de ciclos estrais fisiológicos em fêmeas portadoras de cistos foliculares.
Macmillan et al. (1985a) conduziram quatro testes para verificar os efeitos da aplicação de 5,0μg de agonista do GnRH sobre a concentração de LH, progesterona e duração do ciclo estral de vacas cíclicas. No primeiro teste eles verificaram que a administração do GnRH aplicado no meio do ciclo estral promovia um aumento das concentrações de LH e progesterona em relação aos animais sem tratamento. No segundo teste, os animais tiveram os estros monitorados (dia zero), e a partir de então, eram submetidos a aplicação de GnRH nos dias 3, 6 ou 9. Foi observado que exceto no grupo de animais que receberam o tratamento no dia 3, todos os outros grupos tiveram as concentrações
de progesterona aumentadas. Nos demais testes realizados por estes autores, a aplicação do GnRH entre os dias 1 e 10 do ciclo não comprometeu a duração do ciclo estral, no entanto, quando o tratamento era realizado entre os dias 12 e 16, a distribuição do ciclo estral era alterada e ocorreu uma maior incidência de ovulações sem a detecção de estro. Desta forma, foi concluído que a utilização do GnRH apresentava diferentes ações sobre a manutenção do crescimento folicular, promovendo atresia ou luteinização a depender do estádio do ciclo estral em que se encontrava o animal.
Em continuidade ao estudo anterior, Macmillan et al. (1985b) observaram que a administração de PGF2α entre os dias 7 e 16 do ciclo (controle), quando associada a aplicação prévia de 5 μg do GnRH, estendia o intervalo entre a injeção de PGF e o estro de 4,6 dias para 7,9 dias, bem como reduzia a taxa de retorno ao cio.
Apesar dos resultados apresentados, o papel do GnRH não estava completamente esclarecido, sendo assim, para elucidar estas observações, Macmillan & Thatcher (1991), submeteram um grupo de novilhas a 25mg de PGF2α aplicados no dia 13 do ciclo associado ou não, a 10μg de buserelina (análogo do GnRH) administrada no dia anterior. Os autores confirmaram que a buserelina era capaz de atrasar ou prevenir a ação luteolítica da prostaglandina. No mesmo estudo, um grupo de novilhas foram submetidas a aplicação intramuscular de 10μg de buserelina no dia 12 do ciclo - nestes animais foram observados que o número de folículos de tamanho médio (6-9mm) aumentou, enquanto que o número de folículos de maior diâmetro (>9mm) foi reduzido, sendo detectado também, um maior número de folículos luteinizados em relação ao grupo controle (sem buserelina). Adicionalmente, os autores avaliaram as concentrações de estradiol das novilhas que receberam buserelina e observaram que logo após o tratamento, houve um declínio nos níveis deste hormônio.
Desta forma, Macmillan & Thatcher (1991) puderam estabelecer que o GnRH quando utilizado em um determinado estádio do ciclo estral tem a capacidade de induzir a ovulação de folículos com mais de 9,0mm ou promover a atresia de folículos menores; como resultado, ocorre uma padronização do tamanho folicular, predominando folículos de tamanhos intermediários. Associado a esta padronização, em animais que tinham o crescimento da onda interrompida havia um recrutamento de uma nova onda folicular.
Estes resultados foram complementados pelos estudos de Twagiramungu et al. (1995), os quais observaram que a administração de GnRH induzia o pico de LH, resultando na ovulação do folículo dominante ou atresia de folículos menores, com uma nova onda emergindo dentro de 3 a 4 dias após o tratamento. Pursley et al. (1995) desenvolvendo um esquema hormonal baseado no emprego do GnRH observaram que em vacas leiteiras uma nova onda folicular surgia em cerca de 2 a 3 dias após o tratamento e o mesmo evento fora observado em 1,5 dias em novilhas.
Trabalhando com vacas Nelore, Barros et al. (2000) observaram que uma nova onda folicular emergia 1,79±0,34 dias após a administração de 8,0μg de buserelina. Estes autores observaram também que dos animais que responderam ao tratamento (n=19/24), a emergência surgiu logo após a luteinização folicular ou atresia dos folículos, em respectivamente, 8 e 6 animais. Em 5 animais a emergência da onda coincidia com o início do tratamento e portanto, a utilização do GnRH não alterava o desenvolvimento da onda.
Martinez et al. (1999) propuseram avaliar o efeito do GnRH sobre os folículos em diferentes fases de crescimento. Para isso, um grupo de novilhas tiveram o ciclo controlado por meio de aparelho de ultrassonografia para determinarem o momento da ovulação (D0). A partir de então, os autores administraram 100μg de GnRH nos dias 3, 6 ou 9, correspondendo a folículos que encontravam-se em fase de crescimento, entrando em fase estática ou, em fase estática completamente estabelecida. O grupo controle não recebeu nenhum tratamento. Os autores puderam observar que a ovulação ocorreu em 89%, 56% e 22% nos animais dos respectivos tratamentos e que o tempo requerido após a ovulação para o surgimento da nova onda foi semelhante entre os animais controle (8,7±1,6 dias) e os animais tratados no dia 6 (8,1±0,5 dias), entretanto, diferiu dos animais que receberam o tratamento no dia 3 (5,6±1,2 dias) e 9 (10,9±0,4 dias). Os autores confirmaram que o tempo de emergência da onda está relacionada com a fase de crescimento em que se encontra o folículo no momento do tratamento, adicionalmente, puderam observar que a emergência somente é induzida quando ocorre ovulação em resposta ao tratamento e que a probabilidade deste acontecimento se torna maior quando os folículos estão em fase final de crescimento ou em fase estática de desenvolvimento.
Estudos ainda demonstraram que a cauterização do folículo dominante (KO et al., 1991) ou a sua ablação guiada por ultrassonografia (BERFELT et al., 1994; BO et al., 1995b) anula os efeitos de dominância, levando a uma descarga de FSH e induzindo a emergência de uma nova onda de crescimento folicular em aproximadamente 2 dias (BERFELT et al., 1994).
Sendo assim, Buratini Júnior et al. (2000) avaliaram a emergência da onda após remoção do folículo dominante utilizando aspiração guiada por ultrassonografia. No referido estudo foram utilizadas novilhas Nelore nas quais ciclo estral havia sido acompanhado para determinar o momento da ovulação. Cinco dias depois, o folículo dominante da primeira onda foi aspirado e os autores observaram que uma nova onda emergia em média, 1,9±0,1 dias após. Todavia, Bó et al. (2003) concluíram que apesar da eficiência desta técnica na sincronização da emergência folicular, é um método que apresenta alto grau de dificuldade de aplicação a campo, sendo pouco utilizada.
Martinez et al. (2000) buscaram avaliar a eficiência das diferentes técnicas disponíveis para sincronizar a emergência de uma nova onda folicular, para tanto, compararam quatro grupos experimentais assim definidos: 1) grupo de novilhas que não receberam tratamento, 2) aplicação de 5,0mg de 17β-estradiol mais 100mg de progesterona aplicados via intramuscular, 3) 100μg de GnRH e 4) aspiração dos folículos visualizados com mais de 5mm de diâmetro. Esses autores observaram que a emergência da onda ocorria mais tardiamente nos animais controle (3,5±0,6 dias) e nos que receberam o 17β-estradiol (3,4±0,1 dias), comparado àqueles tratados com GnRH (1,5±0,3 dias) ou submetidos a aspiração folicular (1,0 ±0,1 dias), entretanto, todas as técnicas revelaram-se eficientes para o propósito definido.
2.4.2 Terminando a fase luteínica de forma sincronizada
Os primeiros trabalhos relatando a manipulação da fase luteínica surgiram na década de 20 quando cobaias submetidas a histerectomia, durante a fase luteal, apresentavam persistência do corpo lúteo, sendo os principais aspectos observados nestes indivíduos, a inibição da ovulação e manutenção do epitélio vaginal em um estágio secretório equivalente ao período de gestação (ROWLANDS & SHORT, 1959).
