4 Materiais e Métodos 4.1 Preparação dos discos.
5.6. Inibição das espécies de Candida no Biofilme por extratos vegetais
A inibição parcial apresentada pelos extratos vegetais C. martinii, C.
winteranus e M. piperita contra o desenvolvimento de biofilme por espécies de
Candida, foi estatisticamente igual para estes extratos, comparado com o controle
negativo (fluconazol) (P<0.05), como pode ser observado no Gráfico 14. Os dados revelados pela microscopia eletrônica de varredura mostram um biofilme ativo formando agregados com a bactéria, apresentando formas filamentosas predominantemente, em comparação com os resultados obtidos nos biofilmes sem tratamento antifúngico. Extratos vegetais log( UFC /mL) 0 2 4 6 8 Cymbopogom martinii Cymbopogom winteranus Mentha piperita Controle
6 Discussão
Tem-se demonstrado com certa regularidade, que espécies de Candida estão presentes no biofilme oral, co-agregadas ou aderidas à espécies bacterianas ali presentes – preferencialmente espécies de Estreptococos, assim como também há adesão destas leveduras às células do epitélio e aos aparatos protéticos. Neste caso, é muito comum que pacientes portadores de próteses sejam alvos para as infecções fúngicas.
A interação entre diferentes microrganismos num biofilme pode ter uma conseqüência na colonização e subseqüente infecção (El-Azizi et al., 2004). Os microrganismos podem se aglutinar uns com os outros promovendo uma melhor adesão e desenvolvimento do biofilme, mas também outras aglutinações podem reduzir a capacidade de desenvolver esta estrutura (El-Azizi et al., 2004). As espécies de Candida existem na maioria das vezes numa mistura heterogênea com outros microrganismos, os quais podem, de algum modo, afetar o desenvolvimento de biofilme por leveduras (El-Azizi et al., 2004).
Pesquisas têm descrito variações na interação entre complexos de bactérias e Candida spp. no desenvolvimento do biofilme. Neste sentido, estreptococos orais são predominantemente habitantes da cavidade oral e podem ser co-cultivados com Candida spp. Algumas pesquisas têm-se referido ao S.
mutans, como um microrganismo que não influi no desenvolvimento do biofilme
por espécies de Candida (Jenkinson et al., 1990; Thein et al., 2006). Os dados obtidos na presente pesquisa, demonstraram que a especie Candida albicans é capaz de desenvolver biofilme sobre biofilmes pré-formados por bactérias, particularmente a espécie Streptococcus mutans, demonstrando ser esse microrganismo, um bom substrato para o posterior desenvolvimento de espécies de Candida. Outros estreptococos orais têm sido estudados, e os resultados demonstram que o S. sanguinis e o S. oralis são capazes também de se
coagregar com espécies de Candida (Branting et al., 1989; El-Azizi et al., 2004; Rickard et al., 2003). Tais dados confirmam as descrições anteriores sobre a interação entre diferentes microrganismos num biofilme.
Baena-Monroy recentemente demonstrou associação positiva entre S.
aureus e C. albicans isolados de lesões estomáticas (Baena-Monroy et al., 2005).
A literatura, de modo geral, não possui dados de co-agregações entre S. mitis e C.
albicans, assim como as co-agregações entre estes microrganismos orais e
espécies de C. tropicalis e C. glabrata, diminuindo a possibilidade de confrontar os nossos resultados. Os resultados do biofilme produzido por Candida spp. sobre biofilmes pré-formados por bactérias, no entanto, demonstraram que estes microrganismos são determinantes para o desenvolvimento de biofilme por espécies de Candida. Tais dados, indicam que esses organismos possuem um papel importante na adesão inicial, e posterior desenvolvimento de espécies de fungos.
Os dados encontrados na literatura permitem considerar, portanto, que nem todos os microrganismos possuem a capacidade de adesão à espécies de
Candida. Esta incapacidade pode ser observada para algumas espécies de
Candida, mas também em bactérias, como a P. aeruginosa, S. epidermidis, S.
marcensces e Enterobacter cloaca (El-Azizi et al., 2004; Hogan & Kolter 2002;
Hogan et al., 2004). Assim, o mecanismo de interação entre estes organismos, de modo geral, sugere variar com o patógeno (Donlan & Costerton 2002; Rickard et
al., 2003). Tudo indica que a sobrevivência de organismos patogênicos no
biofilme, se deve ao aumento da associação e interação metabólica com outros organismos (Marsh, 2004), contribuindo para ampliar a heterogeneidade e o fluxo constante entre eles, levando a comunidade biológica a se adaptar às trocas das condições ambientais e à composição da comunidade presente (Kolenbrander & London 1993; Marsh, 2004).
Os resultados dos testes de inibição das espécies de C. albicans no biofilme por extratos vegetais, demonstraram que não houve uma completa inibição. Todos os extratos vegetais e o controle mostraram o mesmo comportamento. Ao MEV, as células de Candida spp., se apresentaram formando agregados com o S. mutans, revelando a parede celular comprometida (Figuras 4 – 7). O mesmo comportamento pode ser observado em relação as outras espécies de Candida (Gráficos 8 – 11). Assim, a inibição por extratos de plantas usadas nesta pesquisa, se mostrou parcial e apresentaram um comportamento semelhante, quando comparados entre si. Em principio, esses estes resultados concordam com as considerações de Al-Fattani e Douglas (2004), os quais demonstraram que a presença de bactérias e matriz bacteriana retardam a difusão de agentes antifúngicos em biofilmes mistos com espécies de Candida. A parede celular comprometida, como pode se observar nas Figuras 4 – 7, sugerem, por tanto, uma interação efetiva dos extratos com esses organismos.
É sabido, pela literatura disponível, que plantas medicinais, quer sejam na forma de extratos brutos ou purificados, ou isolando-se os seus componentes bioativos, têm sido usadas em vários paises, como tratamento alternativo no combate à doenças e problemas de saúde (Duarte et al., 2005). Muitos extratos de plantas e óleos essenciais isolados de plantas medicinais tem demonstrado exercer atividade biológica “in vitro” e “in vivo” (Martinez et al., 1996) e se espera, que estes componentes das plantas possam ser usados como drogas sintéticas antibióticas, que sejam ativas contra microrganismos patogênicos antibiótico- resistentes (Duarte et al., 2005).
Os nossos resultados, demonstraram que estas substâncias não inibiram de modo total as espécies de Candida, de modo geral. Semelhantes resultados foram encontrados por Al-Fattani em 2004, os quais testaram quatro antifúngicos em biofilmes multi-espécies contendo C. albicans, revelando que, provavelmente, ocorra uma difusão muito lenta dessas substâncias através do biofilme, onde a presença de bactérias e matriz bacteriana, podem retardar a difusão dos agentes
antifúngicos, devido aos polímeros produzidos pelas bactérias e pela Candida, - em biofilmes mistos- podem resultar numa maior viscosidade da matriz (Al-Fattani & Douglas 2004). Esses dados indicam, que a despeito do potencial antimicrobiano dessas substâncias, vários são os fatores, ainda não conhecidos, que podem influenciar no processo de interação dessas substâncias com microrganismos, antes de exercerem sua atividade biológica complexa como agentes antimicrobianos.
Os resultados da observação dos biofilmes em microscopia eletrônica de varredura mostraram diferenças na morfologia das células fúngicas. O biofilme misto de bactérias e leveduras, sem tratamento antifúngico, revelou agregados microbianos associados a formas de células leveduriformes, ao contrário dos biofilmes mistos com tratamento antifúngico, os quais mostraram agregados microbianos com presença de formas filamentares de fungos. Estes resultados estão de acordo com Fattani e Douglas (2004), cujos dados de biofilmes, revelaram uma rede densa de células contendo ambos os tipos de morfologia (Al- Fattani & Douglas 2004).
Candida albicans é a espécie mais comumente encontrada em lesões
estomáticas, assim como também a presença de outras variedades de espécies de Candida e bactérias que tem sido isoladas dessas lesões (Lamfon et al., 2005). A adesão desta espécie aos materiais dentários é influenciada positivamente se tiver um biofilme bacteriano previamente desenvolvido, independente da natureza da superfície do material. A matriz do biofilme bacteriano incrementa a adesão das espécies de Candida, assim como, protege a mesma de possíveis propriedades antifúngicas do material (Al-Fattani & Douglas 2004). Os resultados obtidos na presente pesquisa são concordantes com este autor e, em adição, demonstraram também que entre os materiais testados (titânio, resina acrílica e nylon) não se observou diferença na influência no biofilme.
Com base nestes resultados, pode-se demonstrar que os biofilmes bacterianos testados, influíram positivamente no desenvolvimento posterior do biofilme pelas leveduras, sendo os biofilmes pré-formados por espécies de S.
mutans e S. aureus, as que melhor permitiram a formação de biofilme pelas
leveduras. Após 6 horas de formado o biofilme pelas leveduras em biofilmes bacterianos pré-formados, o efeito dos extratos vegetais foi parcial. Mais estudos, no entanto, são necessários para se avaliar melhor acerca desta estrutura mista em biofilmes, nas quais se possa permitir um melhor conhecimento das interações entre estes microrganismos e outras espécies de bactérias e leveduras.
Estudos concomitantes sobre a produção de polímeros extracelulares no biofilme; de sua estrutura tridimensional; dos possíveis sinais moleculares que possam governar esta estrutura; o efeito antifúngico, mais detalhado, dos extratos vegetais sobre estes organismos; e o poder de penetração destes antifúngicos no biofilme em diferentes etapas de sua formação, além de avaliar quais são os sistemas pela quais as leveduras tendem a formar estruturas filamentares frente um estresse com os extratos vegetais, devem ser a preocupação futura de nossas pesquisas, para que se possam entender melhor os fatores que estão envolvidos nos mecanismos que regem as interações entre biofilmes mistos de bactérias e leveduras.
7 Conclusões
Os dados obtidos nesta pesquisa, permitem as seguintes conclusões:
1. A espécie C. albicans desenvolveu biofilme sobre os biofilmes pré-formados de todas as bactérias.
2. Candida glabrata apresenta um desenvolvimento menor de biofilme sobre biofilmes pré-formados das bactérias. O Staphylococcus aureus demonstra influencia negativa na adesão e posterior desenvolvimento desta espécie.
3. As espécies de Candida, de modo geral, se desenvolvem em biofilmes pré- formados por S. mutans e S. aureus.
4. A inibição das espécies Candida albicans, C. tropicalis e C. glabrata, por extratos vegetais é parcial e apresentam comportamentos semelhantes quanto comparadas.
5. Os materiais testados não influenciam positiva nem negativamente na formação do biofilme pelas espécies de Candida, uma vez que, estas se desenvolvem em biofilmes bacterianos previamente formados.
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