UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULTADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
GUSTAVO ALBERTO OBANDO PEREDA
Avaliação do desenvolvimento das espécies de Candida spp.
em biofilmes pré-formados por espécies de Streptococcus
spp.
e Staphylococcus aureus e sua inibição pela atividade
antifúngica de extratos vegetais
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas, para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Oral, área de concentração em Microbiologia e Imunologia Oral.
Orientador: Prof. Dr. José Francisco Höfling Co-orientadora: Prof. Dra. Marta Cristina
Duarte Teixeira.
PIRACICABA 2007
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA
BIBLIOTECA DA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
Bibliotecário: Marilene Girello – CRB-8a. / 6159
P413a
Pereda, Gustavo Alberto Obando.
Avaliação do desenvolvimento das espécies de Candida
spp. em biofilmes pré-formados por espécies de
Streptococcus spp. e Staphylococcus aureus e sua inibição
pela atividade antifúngica de extratos vegetais. / Gustavo Alberto Obando Pereda. -- Piracicaba, SP : [s.n.], 2007. Orientador: José Francisco Höfling.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba.
1. Leveduras. 2. Bactérias. 3. Fitoterapia. I. Höfling, José Francisco. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
(mg/fop)
Título em Inglês: Evaluation of development of Candida spp. on Streptococcus
spp. and Staphylococcus aureus preformed biofilms and their antifungal inibition
with vegetal extracts
Palavras-chave em Inglês (Keywords): 1. Yeasts. 2. Bacteria. 3. Phytotherapy
Área de Concentração: Microbiologia e Imunologia
Titulação: Mestre em Biologia Buco-Dental
Banca Examinadora: José Francisco Höfling, Izabel Yoko Ito, Antônio Olavo Cardoso Jorge
Data da Defesa: 26-02-2007
DEDICATORIAS
A Deus, pelo seu eterno amor e por permitir a culminação deste
Mestrado fechando uma etapa de minha vida, e peço a ele continuar
estudando.
A minha Mãe “Madre Minha Imaculada”, que sempre está a meu lado.
Dedico em forma muito especial a minha esposa, Karla Elena, por seu
grande amor, paciência e atenção.
A meus pais Marcos e Annie, pelo seu amor e ajuda incondicional, e
pelo apoio nestes 3 anos.
A meu irmão, que sempre esteve atento.
A minha avó, Rosa, por seu amor incondicional e ajuda, e para minha
avó Soledad, por seu amor e preocupação.
A meus avôs, Gustavo e Julio “in memoriam”.
A minha Família toda e amigos.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao BRASIL, pais maravilhoso, que me deu a oportunidade de estudar
uma pós-graduação.
Ao Professor Dr. José Francisco Hofling, Responsável pela disciplina
de Microbiologia e Imunologia do Departamento de Diagnostico Oral
da Faculdade de Odontologia de Piracicaba/ UNICAMP, meu
Orientador, pelo seu ensino, dedicação e exemplo.
À Professora Dra. Marta Cristina Duarte Texeira, pela boa bondade na
co-orientação desta tese.
Ao Professor Paulo Ferreira Caria, pela sua amizade.
A meus queridos amigos e irmãos Jorge e Mariana, quem sempre
estiveram presentes.
AGRADECIMENTOS
À UNICAMP na pessoa do seu magnífico reitor Prof. Dr. José Tadeu.
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba, na pessoa do seu diretor,
Prof. Dr. Francisco haiter Neto.
Ao Prof. Dr. Mário Alexandre Coelho Sinhoreti, coordenador geral dos
cursos de Pós-graduação da FOP – UNICAMP.
À Prof. Dr. Fausto Bérzin, coordenadora do Programa de
Pós-Graduação em Biologia Oral da FOP - UNICAMP, pela oportunidade
de um crescimento científico e profissional nesta conceitudad
institução.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior
(CNPQ), pelo apoio financiero para o desenvolvimento desta pesquisa,
na concessão da Bolsa de Mestrado.
Aos Professores Reginaldo Bruno Gonçalves e Renata de Oliveira
Mattos-Graner, pelo seu ensino.
A meus companheiros, de pesquisa Vivian, Iriana, Rita, Paula, Rafael,
Regianne, Cristiane, Thais, Marlise, Ruchele, Priscilla, Sérgio, Janaina,
Bruna, Daniel, Alessandra e também a Vilma, Flavia e Anderson, por
serem eles meus guias no laboratório e pelos momentos vividos.
“Tudo por uma maior glória de Deus”
RESUMO
Tem-se demonstrado que espécies de Candida podem também ser encontradas no biofilme oral, co-agregadas ou aderidas a espécies bacterianas ali presentes, preferencialmente à espécies de Estreptococos, como também há adesão destas leveduras às células do epitélio e aos aparatos protéticos (neste caso é muito comum que pacientes portadores de próteses sejam alvos para as infecções fúngicas). Assim, a habilidade das espécies de Candida para formar biofilme em dispositivos médicos tem ampliado a capacidade de causar doenças assim como a capacidade de resistir a antifúngicos. Por outro lado nas ultimas décadas, tem se observado um crescente interesse nas medicinas alternativas e nas terapias naturais, justificando o aumento significativo de pesquisas nessa área ampliando-se no preampliando-sente. O objetivo desta pesquisa é, primeiramente, avaliar a interação das espécies de Candida albicans, C. tropicalis e C. glabrata em biofilmes pré-formados por espécies de Streptococcus oralis, S. sanguis, S. mitis, S. mutans e
Staphylococcus aureus em diferentes materiais protéticos como: titânio e resina
acrílica, e, secundariamente, testar a ação de alguns extratos fitoterápicos como a
Mentha piperita, Cymbopogum martinii e Cympopogum winterianus através da
concentração mínima inibitória (CMI), na inibição da co-agregação das espécies de Candida spp. a estes microrganismos. Os dados obtidos nesta pesquisa demonstram que as espécies de Candida albicans desenvolvem biofilme sobre os biofilmes pré-formados das bactérias testadas independentemente do material avaliado. A presença de bactérias se demonstra determinante para o desenvolvimento de biofilme por espécies de Candida. A inibição de Candida spp. pelos extratos vegetais testados se mostrou parcial e semelhante quando comparadas, ao lado de se revelarem substâncias potencialmente antifúngicas.
Palavras-chave: Biofilme, Candida spp., Streptococcus spp., Staphylococcus
ABSTRACT
Candida spp. have been demonstrated found in the oral biofilm, coaggregated or
adhered to oral bacteria, especially Streptococcus spp., also too the adhesion of these yeast to mucosal cells and prosthetic devices (in this case is common that patients that carry a prosthetic device, could be targets to fungal infections). The ability of Candida spp. to form biofilm on medical devices has extended the capacity to cause diseases and to resist antifungal agents. The lasts decades, have been observed big interest concern to medicinal plants and natural therapies, justifying the significant increase of research on the area in the present. The aim of this research was firstly, evaluate the interaction of C. albicans, C. tropicalis and
C. glabrata on S. oralis, S. sanguis, S. mitis, S. mutans and Staphylococcus
aureus preformed biofilm in different prosthetics materials like titanium and acrylic
resin. Secondly, was evaluated the action of some vegetal extracts like Mentha
piperita, Cymbopogum martinii and Cympopogum winterianus, using the Minimal
Inhibitory Concentration (MIC), against the Candida spp. coaggregation with these microorganisms. The data obtained in this research show that Candida spp. develop biofilm on preformed bacterial biofilm, independently of tested material. Bacterias are determinant to Candida spp. biofilm development. The Candida spp. inhibition for vegetal extract was partial and equal when compared, revealing itself like potentially antifungal substances.
Key Words: Biofilm, Candida spp., Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, vegetal
LISTA DE GRÁFICOS E TABELA
Gráfico 1. Tempo de adesão bacteriana. 25
Gráfico 2. Tempo de adesão das Candida spp. 26
Gráfico 3. Curva de crescimento do biofilme. 29
Gráfico 4. Biofilme produzido pela C. albicans. 31
Gráfico 5. Biofilme produzido pela C. tropicalis. 31
Gráfico 6. Biofilme produzido pela C. glabrata. 33
Gráfico 7. Biofilme produzido por Candida spp. 35
Gráfico 8. Produção de biofilme por C. albicans nos materiais testados.
36
Gráfico 9. Produção de biofilme por C. tropicalis nos materiais testados.
36
Gráfico 10. Produção de biofilme por C. glabrata nos materiais testados. 37
Gráfico 11. Inibição da espécie C. albicans. 38
Gráfico 12. Inibição da espécie C. tropicalis. 41
Gráfico 13. Inibição da espécie C. glabrata. 44
Gráfico 14. Inibição das Candida spp. 47
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Microfotografia eletrônica de C. albicans e S. mutans. 31 Figura 2. Microfotografia eletrônica de C. tropicalis e S. mutans. 31 Figura 3. Microfotografia eletrônica de C. glabrata e S. mutans. 34 Figura 4. Microfotografia eletrônica de C. albicans em presença de
fluconazol.
39
Figura 5. Microfotografia eletrônica de C. albicans em presença de C.
martinii.
39
Figura 6. Microfotografia eletrônica de C. albicans em presença de C.
winteranus.
40
Figura 7. Microfotografia eletrônica de C. albicans em presença M.
piperita.
40
Figura 8. Microfotografia eletrônica de C. tropicalis em presença de fluconazol.
42
Figura 9. Microfotografia eletrônica de C. tropicalis em presença de C.
martinii.
42
Figura 10. Microfotografia eletrônica de C. tropicalis em presença de C.
winteranus.
43
Figura 11. Microfotografia eletrônica de C. tropicalis em presença M.
piperita.
43
Figura 12. Microfotografia eletrônica de C. glabrata em presença de fluconazol.
45
Figura 13. Microfotografia eletrônica de C. glabrata em presença de C.
martinii.
45
Figura 14. Microfotografia eletrônica de C. glabrata em presença de C.
winteranus.
46
Figura 15. Microfotografia eletrônica de C. glabrata em presença M.
piperita.
LISTA DE ABREVIATURAS
C. albicans - Candida albicans.
S. mutans - Streptococcus mutans.
S. oralis - Streptococcus oralis.
S. mitis - Streptococcus mitis.
S. sanguinis - Streptococcus sanguinis.
S. aureus - Staphylococcus aureus.
M. piperita - Mentha piperita.
C.martini - Cymbopogon martini.
C. winterianus Cymbopogon winterianus.
MEV - Microscopia eletrônica de varredura.
μL - Microlitro.
ATCC - American Type Culture Collection.
CBS - Centraalbureau voor Schimmelcultures.
CIM Concentração mínima inibitória.
mL - Mililitro
BHIY - Brain-heart infusion yeast.
AMS - Agar Mitis Salivarius
DAS - Saboraud Dextrose Agar
ºC - Grados Celsius
nm - Nanômetro
UFC - Unidade Formadora de Colônia
M - Molar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 1 2 REVISÃO DE LITERATURA 6 2.1 Biofilme 7 2.2 Formação do Biofilme 8 2.3 Processo de Formação 102.4 Metabolismo e atividade heterogênea 13
2.5 Formação de Biofilme por Candida spp 14
2.6 Interação dos microrganismos orais com os materiais
dentários 18
2.7 Fitoterápicos 19
3 PROPOSIÇÃO 21
4 MATERIAL E MÉTODOS 22
4.1 Preparação dos discos 22
4.2 Amostras 23
4.3 Tempo de adesão 24
4.4 Formação do biofilme 26
4.5 Microscopia eletrônica de varredura 27
4.6 Inibição por extratos vegetais 27
4.7 Processamento dos Dados 29
5 RESULTADOS 30
5.1 Biofilme produzido por espécies de Candida 31
5.2 Biofilme produzido pelas espécies de Candida nos materiais
testados 35
5.3 Inibição das espécies de C. albicans no Biofilme por extratos
vegetais 37
5.4 Inibição das espécies de C. tropicalis no Biofilme por extratos
vegetais 41
5.5 Inibição das espécies de C. glabrata no Biofilme por extratos
vegetais 44
5.6 Inibição das espécies de Candida no Biofilme por extratos vegetais 47 6 DISCUSSÃO 48 7 CONCLUSÕES 53 REFERENCIAS 54 ANEXO 1 67 ANEXO 2 69
1 Introdução
A nossa percepção de microrganismos como formas de vida unicelular está baseada primariamente no crescimento em cultura pura (Ramage et al., 2006). Desde que os microrganismos têm sido diluídos de materias biologicas, este método tem sido enormemente empregado no estudo da fisiologia e patogênese microbiana (Ramage et al., 2006). A maioria dos microrganismos em seu ambiente natural estão aderidos às superfícies dentro de uma estrutura denominada biofilme (Costerton et al., 1987; Donlan 2002). Os biofilmes são estruturas de comunidades microbianas aderidas às superfícies e encapsulados dentro de uma matriz extracelular protetora (Costerton et al., 1995).
Recentemente, tem se reconhecido o importante papel do biofilme microbiano na medicina humana, estimando-se que 65% de todas as infecções microbianas humanas envolvem esta estrutura (Costerton et al., 1999; Donlan 2001a, 2001b; Donlan & Costerton 2002; Douglas 2003), normalmente portadoras de características fenotípicas que as tornam diferentes das células no estado planctônico, como incremento da resistência a agentes antimicrobianos e proteção contra as defesas do hospedeiro (Costerton et al., 1995; Gilbert et al., 1997; Habash & Reid 1999).
Uma variedade de manifestações de infecções causadas por espécies de
Candida, está associada com a formação de biofilme em dispositivos médicos
superfícies necessárias para a formação de biofilme e,consequentemente, são as responsáveis por uma alta porcentagem de candidosis clínica (Ramage et al., 2006). Assim, a introdução de materiais artificiais dentro de zonas do corpo, tem sido acompanhadas pela habilidade de microrganismo - incluindo espécies de
Candida - de colonizar estes materiais e formar biofilme cuja estrutura protege
estes de antibióticos e das defesas do hospedeiro, contribuindo para a existência de infecções (Ramage et al., 2006).
Dispositivos como próteses (voz, valvas do coração, joelho, etc.), cateteres, implantes (lentes, silicones, dentaduras, etc.), tubos endotraqueais, marcapassos, e outras variedades de dispositivos tem mostrado a capacidade de permitir a colonização e formação de biofilme por espécies de Candida (Ramage et al., 2006), assim como também podem afetar e comprometer severamente o funcionamento destes dispositivos (Ramage et al., 2006). Em muitos casos, interações hospedeiro-levedura estão presentes em uma comunidade microbiana albergando diferentes espécies de bactérias e fungos, sendo estas interações bactéria-fungo indubitavelmente muito diversa (Wargo & Hogan 2006).
As leveduras tem uma reconhecida capacidade de adesão às superfícies abióticas, células e tecidos (Verstrepen & Klis 2006). Esta adesão impede que as células sejam constantemente lavadas até que estas encontrem um meio ambiente nutritivo, favorável à formação do biofilme, o qual determina proteção à condiçoes degenesicas (Verstrepen & Klis 2006). Assim, as leveduras patogênicas utilizam suas propriedades de adesão para se ligar a superfícies como próteses de plástico, as quais permitem o acesso ao sistema circulatório e órgãos internos de pacientes (Kojic & Darouiche 2004). Nesse sentido, próteses e cateteres podem
servir como suporte de biofilmes microbianos e, posteriormente, como reservatórios de células altamente infectivas e resistentes a antibióticos (Kojic & Darouiche 2004).
Dispositivos médicos como materiais dentários e cateteres venosos são comumente usados no cuidado de pacientes (Chandra et al., 2005) e muitos destes, atuam como reservatórios de microrganismos (Budtz-Jorgensen 1974; Sumi et al., 2003). Espécies de Candida têm sido freqüentemente encontradas na microbiota normal de humanos e estão mais associadas a biomaterias tais como próteses, implantes, tubos endotraqueais, vários tipos de cateteres e outros dispositivos, os quais mostram diversos tipos de superfícies onde se pode estabelecer uma infecção microbiana através do biofilme formado por Candida spp. (Brosky et al., 2003; Ramage et al., 2005).
O que sugere, uma vez mais, que a maioria das doenças produzidas por estes patógenos está associada ao biofilme (Douglas 2002). A habilidade das espécies de Candida para formar biofilme em dispositivos médicos tem tido um profundo impacto na capacidade de causar doenças (Ramage et al., 2001), assim como a capacidade de resistir a antifúngicos (d'Enfert 2006).
Candida albicans é a espécie mais associada a lesões orais, mas outras
espécies menos patogênicas como C. glabrata, C. tropicalis (Budtz-Jorgensen et
al., 1975), C. parapsilosis, e C. krusei são, ocasionalmente, isoladas
(Samaranayake & Samaranayake 1994). A aderência das espécies de Candida às superfícies de materiais protéticos é o primeiro passo fundamental para a iniciação e propagação da estomatite associada à prótese (Fukazawa & Kagaya 1997) com
a adesão da Candida spp. às células epiteliais da mucosa (Cawson 1965; Webb et
al., 1998), seguida pelo crescimento e invasão no tecido (Barnabe et al., 2004).
A adesão das espécies de Candida a estes materiais pode ser produzida por forças não específicas (Hazen 1989; Kulak et al., 1997); como, também, por fatores específicos como a presença de superfícies celulares monoprotéicas (Klotz
et al., 1985; Kulak et al., 1997) e pela formação de hifas (Kulak et al., 1997). Outro
mecanismo de adesão, menos pesquisado, é a co-agregação de leveduras com bactérias orais, principalmente, Streptococcus mutans (Kulak et al., 1997), que são os responsáveis por fornecer um ambiente ácido, ideal para o crescimento de outros microrganismos (Barnabe et al., 2004) e Staphylococcus aureus, que possui certa capacidade de adesão à superfícies orais. Tais mecanismos promovem a adesão de leveduras a superfícies orais (Barnabe et al., 2004).
Muitos pesquisadores têm avaliado o desenvolvimento de biofilme por espécies de Candida, individualmente ou associadas a outros microrganismos, enfatizando a importância do substrato e a influencia da saliva (Jin et al., 2004; Radford et al., 1999; Ramage et al., 2004; Samaranayake et al., 1980; San Millan
et al., 2000; Vasilas et al., 1992). Porém, uma pesquisa particularmente,
centrou-se na interação da C. albicans sobre biofilmes pré-formados por leveduras e/ou bactérias, enfatizando a heterogeneidade dos biofilmes e a sua capacidade de influir nas decisões terapêuticas (El-Azizi et al., 2004).
Com ênfase no uso de agentes antimicrobianos como controle de infecções por microrganismos, a utilização de produtos naturais no combate a doenças é muito antiga, devido as suas diversas propriedades farmacológicas (Bakana et al.,
1987; Ikeno et al., 1991; Koo et al., 2003; Kujumgiev et al., 1999; Paintz & Metzner 1979; Steinberg et al., 1996; Vynograd et al., 2000). Estudos com esses produtos e/ou suas substâncias ativas que possam demonstrar estas propriedades nos processos patogênicos que acometem a cavidade bucal, particularmente, na formação do biofilme e na inibição da agregação de microrganismos, poderão contribuir para ampliar o conhecimento sobre a atividade antimicrobiana destas substancias e seu papel na etiologia das doenças humanas.
2 Revisão de Literatura
2.1. BiofilmeA definição de biofilme tem evoluído os últimos 25 anos. Marshall (1976), notou o envolvimento de uma camada muito fina de polímero extracelular que aderia as bactérias às superfícies. Costerton e outros pesquisadores, observaram que comunidades aderidas de bactérias em sistemas aquáticos achavam-se cobertas por uma matriz de glicocalix, de natureza polissacarídica, a qual mediava a adesão (Costerton et al., 1978). Costerton et al. (1987), demonstrou que o biofilme consistia de simples células e microcolônias, todas elas embebidas numa matriz altamente hidratada e aniônica (Costerton et al., 1987).
Characklis & Marshall (1990), descreveram outros aspectos do biofilme, como as características espaciais, heterogenicidade temporal e o envolvimento de substancias inorgânicas e abióticas mantidas juntas dentro da matriz do biofilme . Costerton et al. (1995),enfatizou que os biofilmes podem aderir-se a superfícies, interfases e outros, definindo-os como agregados e floculados microbianos de populações agregadas em espaços e meios porosos, assim sendo, a adesão promove a expressão de genes que controlam a produção de componentes bacterianos necessários para a adesão e formação de biofilme, enfatizando que este processo de formação do biofilme é regulado por genes específicos transcritos durante a adesão inicial das bactérias.
Assim a nova definição de biofilme se baseia numa comunidade séssil de microrganismos caracterizado por células que estão irreversivelmente aderidas a
um substrato e/ou interfase, e embebidas numa matriz de substâncias poliméricas extracelulares (PEC) que estes microrganismos produzem, exibindo um fenótipo alterado ao crescimento e a transcrição gênica (Donlan & Costerton, 2002).
2.2. Formação do Biofilme
Fatores disponíveis como a superfície, nutrientes e ambiente, regula a formação do biofilme.
2.2.1. Superfície / Substrato:
A superfície pode ser viva, morta ou inerte. A adesão dos microrganismos à ela é um processo complexo, com muitas variáveis que afetam sua formação (Pratt & Kolter, 1998). Assim, o seu crescimento requer um complexo desenvolvimento de vias metabólicas que envolvem uma série de eventos, os quais são regulados em resposta ao meio ambiente e ao microbiano (Prakash et
al., 2003). A superfície deve ter características que são importantes no processo
de adesão, sendo que a colonização microbiana parece incrementar em superfícies rugosas . Este processo se deve ao fato de que as forças de corte são menores e a área de superfície é maior numa estrutura rugosa (Prakash et al., 2003).
Pesquisas têm demonstrado também que microrganismos ficam aderidos mais rapidamente em superfícies hidrofóbicas, superfícies apolares como o teflon e outros plásticos do que as superfícies hidrofílicas como vidros e metais (Bendinger et al., 1993; Fletcher & Loeb, 1979; Pringle & Fletcher, 1983). Assim, a superfície do material exposta a meio aquoso, fica condicionada ou tratada por polímeros do meio, resultando na modificação química, a qual afetará as dimensões da adesão microbiana (Prakash et al, 2003).
Uma expressao muito utilizada pode ser o condicionamento protéico em forma de película chamada película adquirida, a qual se desenvolve na superfície dos dentes (Prakash et al, 2003). Foi também observado que muitos fatores condicionantes do hospedeiro, como sangue, lagrimas, urina, saliva, fluido intervascular e/o secreções respiratórias, influem na adesão microbiana aos biomateriais (Mittelman, 1996)
2.2.2. Nutrientes:
O incremento na concentração de nutrientes está associado com o aumento das células microbianas aderidas (Donlan, 2002). Assim, a concentração de nutrientes por menor que seja, é suficiente para o crescimento do biofilme. Este absorve os nutrientes em concentrações mínima orgânicas nas superfícies através do polímero extracelular usando os catabólitos de seus vizinhos e colonizadores secundários, assim como também pela junção de suas vias bioquímicas com diferentes enzimas para quebrar as provisões nutricionais. Devido à natureza da matriz do biofilme ser carregada negativamente, muitos dos nutrientes
(particularmente os cátions) são atraídos para a superfície do biofilme, embora os nutrientes com carga negativa podem trocar com íons na superfície.
Este processo fornece aos microrganismos dentro do biofilme um ambiente rico em nutrientes em comparação ao meio externor (Prakash et al, 2003). Outras características do meio aquoso como o pH, níveis de nutrientes, ferro, oxigênio, forças iônicas, e temperatura, (características ambientais), podem ter um papel importante na adesão microbiana ao substrato (O'Toole et al., 2000).
2.2.3. Regulação genética:
Há uma evidencia de regulações de um grande numero de genes na adesão das células na etapa de interação com o substrato. Assim, por exemplo no caso da P. aeruginosa, um 22% dos genes regulam positivamente e outros 16% negativamente (Prigent-Combaret et al., 1999). Genes que codificam enzimas da glicólise ou fermentação, são regulados na formação do biofilme pelo
Staphylococcus aureus. Pesquisadores assumem que a regulação destes genes
pode se dar devido à limitação de oxigênio na formação do Biofilme, favorecendo a fermentação.
2.3. Processo de Formação:
A formação do biofilme por microrganismos, (processo de formação) caracteriza-se por apresentar mecanismos específicos de aderencia inicial à superfície, formação de microcolônias, desenvolvimento de uma comunidade de estrutura tridimensional, maturação e desligamento (Prakash et al, 2003).
2.3.1. Aderência:
O microrganismo aproxima-se à superfície lentamente, produzindo uma associação com a superfície e/ou com outros microrganismos previamente aderidos. A interfase sólido-liquido entre a superfície e o meio aquoso (água, sangue, etc.), fornece um ambiente ideal para a adesão e o crescimento destes microrganismos (Costerton et al., 1999). Geralmente, a adesão ocorre mais facilmente em superfícies que apresentem rugosidades, sejam hidrofóbicas, revestidas e acondicionadas por uma película.
Um aumento na velocidade do fluido, temperatura do meio aquoso e concentração de nutrientes, podem igualmente contribuir ao incremento da adesão. Propriedades como a superfície celular, especialmente a presença de fímbrias, flagelos, e superfícies associadas a polissacarídeos ou proteínas, são importantes e podem fornecer uma vantagem para o organismo numa comunidade microbiana mista (Donlan, 2002).
2.3.2. Formação da Microcolônia:
Depois da aderencia do microrganismo à superfície, a associação estabiliza-se para a formação da microcolônia. O microrganismo começa a se multiplicar e a emitir sinais químicos de comunicação para as outras células microbianas. Desde que a intensidade do sinal excede certos níveis, os mecanismos genéticos que governam a produção de exopolissacarideos, são ativados (Costerton et al., 1999). Deste jeito, o microrganismo multiplica-se dentro
da matriz de exopolissacarídeo, produzindo a formação da microcolônia (McKenney et al., 1998).
2.3.3. Formação da estrutura tridimensional e maturação:
Durante a fase de aderência do desenvolvimento do biofilme, depois da formação da microcolônia, a transcrição de certos genes para a síntese de exopolissacarídeo acontece. A adesão pode iniciar a síntese da matriz extracelular nas quais os microrganismos aderidos são embebidos, seguidos pela formação de canais de água. Tem-se proposto que estes canais constituem sistemas circulatórios primitivos, levando nutrientes e removendo produtos do catabolismo provenientes das populações microbianas nas microcolônias (Prakash et al., 2003).
2.3.4. Desalojamento:
Ocasionalmente, por razões puramente mecânicas, alguns microrganismos deixam de produzir polímero extracelular e são liberados do biofilme para o meio exterior. As células do biofilme podem ser dispersas pelo crescimento ativo das células irmãs, ou pelo destacamento, como resultado dos níveis de nutrientes ou “quorum sensing”, ou pelo destacamento de agregados de biofilme (Baselga et al., 1994). Devido ao incremento da camada superficial do biofilme, condições anaeróbias desenvolvem-se no biofilme em locais onde existem microrganismos anaeróbicos.
Enzimas polissacarídeas especificas para o polímero extracelular de diferentes organismos, podem possivelmente ser produzidas durante diferentes
fases do desenvolvimento do biofilme dos microrganismos e contribuir no desligamento dos mesmos (Boyd & Chakrabarty, 1994). O modo de dispersão, aparentemente afeta as características fenotípicas do microrganismo. A migração dos agregados do biofilme parecem reter certas características do biofilme, como propriedades de resistência antimicrobiana, em comparação à células que tem sido liberadas como resultado do crescimento, podendo reverter rapidamente ao fenótipo planctônico (Donlan, 2002).
Como conseqüência do desprendimento e liberação das células microbianas planctônicas do biofilme, e a evidência que suporta a idéia que há um padrão natural de programação de liberação e destacamento destas células, estas podem colonizar outras superfícies ou individualmente, formar novas microcolônias (Baselga et al., 1994). No entanto, os biofilmes podem atuar como foco central de uma infecção aguda, se as defesas do hospedeiro não puderem eliminar as células que são liberadas durante a infecção (Costerton et al., 1999).
Porém um trabalho feito em pulmoes de ratos comprobou que as microcolônias formadas no processo de desenvolvimento do biofilme ou os microrganismos aderidos dentro deste, liberam antígenos e estimulam a reposta do sistema imune induzindo a produção de anticorpos. Mas, estes anticorpos não são efetivos dentro do biofilme, podendo causar deposições de complexos imunes e danos aos tecidos (Cochrane et al., 1988).
2.4. Metabolismo e atividade heterogênea:
O desenvolvimento e aplicação de novas ferramentas moleculares em combinação com o avanço de novos microscopios, não somente prove detalhes
em imagens 3D da estrutura, mas também da atividade e o estado fisiológico das células individuais do biofilme (Wimpenny et al., 2000). Limitações na difusão devido à estrutura do biofilme resulta na variação local da disponibilidade de nutrientes, pH, e tensão de oxigênio. Consequentemente, os microrganismos dentro do biofilme são inevitavelmente heterogêneos com respeito à expressão genética.
Muitos biofilmes estão compostos por uma variedade de espécies bacterianas e, algumas vezes inclusive, podem conter misturas de bactérias e fungos. Os membros destes biofilmes tem diferentes requerimentos e utilizam diferentes funções metabólicas, apresentando comensalismo, um fenômeno difundido no biofilme (Shapiro, 1998). Por exemplo, em locais onde os colonizadores primários são aeróbios ou anaeróbios facultativos, a difusão de oxigênio através do biofilme, determina aos microrganismos anaeróbios sobreviverem como colonizadores secundários na superfície do biofilme (Loo et
al., 2000).
Um estudo onde a atividade dos promotores foi monitorada como uma função da expressão de um fluoroporo indicou que a heterogeneicidade na expressão de genes de células individuais existe incluso dentro de microcolônias da mesma espécie (Yarwood et al., 2004). É provável que esta heterogeneicidade se traduza em funções especializadas nas células do biofilme (Yarwood et al., 2004). Embora não se tenha definição comprovada de que a heterogeneicidade no biofilme possa certamente resultar na divisão de funções das espécies certamente incrementa a eficiência metabólica da população como um todo (Jefferson, 2004).
A maioria dos microrganismos precisa expressar somente uma parte de seu genoma para converter-se numa unidade estrutural e funcional de um
micro-sistema (Carlsson, 1997). As contínuas trocas no ecosmicro-sistema podem se acomodar por alterações no padrão de expressões genéticas, requerimento da comunicação entre o ecossistema e a coordenação da expressão genética (Carlsson, 1997). O biofilme oral está sujeito a presença de nutrientes que podem alterar as condições entre microrganismos aeróbicos e anaeróbicos e as flutuações do pH (Carlsson, 1997). Para minimizar estes processos, o biofilme possui circuitos regulatórios integrados, envolvidos com aspectos fisiológicos celulares numa coordenada resposta às trocas do ecossistema, sendo que estes circuitos regulatórios, incluem sistemas de “operons” que estão controlados por uma proteína simples regulatória (Carlsson, 1997).
2.5. Formação de Biofilme por Candida spp.
Os biofilmes consistem em estruturas de células embebidas dentro de um polímero extracelular (Baillie & Douglas, 2000), associadas irreversivelmente às superfícies e consórcio de multi-espécies (Costerton, 1997; Donlan & Costerton, 2002), representando o tipo mais prevalente de crescimento de microrganismos na natureza, sendo cruciais para o desenvolvimento de infecções clinicas (Davey & O'Toole, 2000; O'Toole et al., 2000). A formação do biofilme em espécies de C.
albicans, se dá por adesão de uma camada de células flutuantes leveduriformes a
uma superfície (Garcia-Sanchez et al., 2004), e sobre estas uma camada de formas filamentosas rodeadas por uma matriz de polissacarídeos (Baillie & Douglas, 2000; Chandra et al., 2001).
O material extracelular produzido pela espécie C. albicans contém carboidratos, proteínas e outros componentes ainda desconhecidos, sendo esta composição diferente das células não aderidas (planctônicas) segundo Adam et al. (2000), sendo muito mais forte e estável quando o biofilme desenvolve-se em meio aquoso (Hawser & Douglas, 1994), tendo uma resistência às drogas terapêuticas muito altas (Kumamoto, 2002).
Dispositivos implantados como catéteres, válvulas protéticas do coração, assim como dispositivos relacionados, capacitam a este patógeno aderir-se à superfície do dispositivo, formando biofilme (Costerton et al., 1987; Dougherty, 1988). O biofilme produzido pela C. albicans consiste em células leveduriformes e filamentosas (hifa e pseudohifa) acopladas numa bi-estrutura (Baillie & Douglas, 2000). Este é similar ao formado por outros microrganismos, mas a sua estrutura é altamente dependente das condições sob a qual este esteja formado; esta plasticidade sugere que o biofilme formado no hospedeiro, vai depender da natureza do dispositivo implantado e da sua localização (Kumamoto, 2002).
Alguns resultados de pesquisas indicam que a C. albicans, o mais patógeno dentre as espécies de Candida, produz o biofilme mais extenso (Kumamoto, 2002). Esta inclui formas leveduriformes e filamentares, ótimas para a colonização de superfícies inertes, sendo a forma leveduriforme a produtora de uma capa basal adesiva, e a forma filamentar a que provê o suporte para o desenvolvimento de uma estrutura multi-extrato (Baillie & Douglas, 2000).
2.5.1. Características do biofilme.
Da perspectiva de uma patogênese, a característica mais importante do crescimento em biofilme é a resistência a agentes antimicrobianos exibidos pelos
organismos (Kumamoto, 2002). A base molecular da resistência antifúngica ainda não está bem estabelecida, mas tem-se proposto que a matriz de polissacarídeos protege as células do biofilme das drogas antifúngicas (Kumamoto, 2002). Porém, alguns pesquisadores têm demonstrado que esta matriz não constitui uma barreira para a difusão destas drogas (Baillie & Douglas, 2000). A progressão da resistência às drogas para Chandra et al. (2001), estaria associada com o aumento da atividade metabólica num biofilme em desenvolvimento, no entanto, quando este é interrompido e os organismos ressuspensos são expostos a drogas antifúngicas, estes retêm significativamente a resistência aos antibióticos, indicando que esta característica fenotípica é uma propriedade intrínseca das próprias células (Kumamoto, 2002).
Uma característica da biologia da C. albicans é a habilidade de crescer em uma variedade de formas morfológicas (Sudbery et al., 2004). A C. albicans é um organismo polimórfico a qual está sujeito a transições morfológicas entre formas leveduriformes, hifas e pseudohifas (Villar et al., 2004). A habilidade em se transformar de levedura a formas filamentosas, é o maior determinante da virulência deste organismo (Berman & Sudbery, 2002; Saville et al., 2003; Sudbery
et al., 2004; Villar et al., 2004), no entanto, esta virulência pode aumentar devido à
presença de uma estrutura mista de comunidades similares às observadas no biofilme (Suci & Tyler, 2002). Assim, ambos estados filamentosos são invasivos, sendo esta propriedade determinante para a penetração nos tecidos durante os primeiros estágios da infecção (Sudbery et al., 2004; Villar et al., 2004), além de que todas as formas morfológicas deste fungo podem formar biofilme (Kumamoto, 2002).
2.5.2. Interações com outros organismos.
Algumas bactérias patogênicas têm demonstrado associação com outros microrganismos, e em alguns casos, com outras microcolônias em biofilmes em desenvolvimento. Estes microrganismos possuem a habilidade de adesão às superfícies de biofilmes existentes (Kolenbrander & London, 1993; Rickard et al., 2003). O mecanismo de interação e crescimento aparentemente varia com o patógeno (Donlan & Costerton, 2002; Rickard et al., 2003), e a sobrevivência e crescimento de organismos patogênicos dentro de um biofilme devem-se ao aumento da associação e interação metabólica com os organismos indígenas (Marsh, 2004). A figura do biofilme aumenta mais e mais, na qual existe a heterogeneicidade e um fluxo constante, e esta comunidade biológica se adapta às trocas das condições ambientais e da composição da comunidade presente (Kolenbrander & London, 1993; Marsh, 2004).
A C. albicans, sendo um comensal na cavidade oral, pode-se aderir a outras espécies da microbiota oral, como o Streptococcus sanguis, S. salivarius,
S. mutans, S. mitis, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces viscosus,
Lactobacillus amylovorus, Porphyromonas gingivalis (Hsu et al., 1990),
Eubacterium saburreum (Reynaud et al., 2001) e Staphylococcus spp. (Dahlen,
2006). Outros pesquisadores responsabilizam a C. albicans como promotor para a adesão de microrganismos, tais como Streptococcus spp, E. coli e Porphyromonas
gingivalis (Branting et al., 1989; Centeno et al., 1983). Estas interações estão
associadas a doenças como periodontite (Reynaud et al., 2001), periodontite apical (Slots et al., 1988), necrose da polpa dental e infecções de dentina (Waltimo
et al., 2003), já que a levedura possui a capacidade de colonizar a hidroxiapatita
Embora C. albicans seja a levedura considerada, majoritariamente, a mais patogênica das espécies de Candida, uma variedade de outros membros deste gênero como a C. krusei, Torulopsis glabrata, C. tropicalis e C. dubliniensis, têm sido citados como agentes causadores de um incremento do número de infecções (Gilfillan et al., 1998), assim como sua capacidade de adesão a superfícies plásticas (Panagoda et al., 1998; Samaranayake & Nair, 1995; Webb et al., 1998). Este fator de co-agregação pode depender de outros fatores como variações inter ou intra-espécie de açúcares (Branting et al., 1989) e componentes da parede celular bacteriana (Holmes et al., 1995).
Nem todos os microrganismos porém, possuem esta adesão com a C.
albicans. Esta limitação pode ser observada em certas espécies de Candida spp,
e em bactérias como a P. aeruginosa (Hogan & Kolter, 2002; Hogan et al., 2004), assim como também em S. epidermidis, Serratia marcescens e Enterobacter
cloaca (El-Azizi et al., 2004).
2.6. Interação dos microrganismos orais com os materiais dentários.
Há evidencia de que o uso de vários dispositivos médicos estão indicados em várias condições médicas e cirúrgicas. Porém, a introdução de materiais artificiais dentro do corpo tem demonstrado ser um fator de adesão de microrganismos, inclusive por espécies de Candida, as quais possuem a capacidade de colonizar estes dispositivos e formar biofilme, protegendo os microrganismos de antibióticos e das defesas do hospedeiro, determinando a cronicidade das infecções (Ramage et al., 2006).
Dispositivos como “bypass”, próteses (voz, valvas de coração, coelho, etc), implantes, tubos endotraqueais, marcapassos, e outras variedades de catéteres, determinam condições para a formação de biofilme por espécies de Candida (Ramage et al., 2006). O uso de prótese dental na substituição de dentes naturais, tem sido considerado clinicamente satisfatório (Boucher, 1975). No entanto, a adesão de microrganismos a superfícies orais duras como superfícies dentais, materiais restauradores, materiais protéticos e componentes de implantes, é um pré-requisito para a formação da placa dental que produz cárie dental, doença periodontal e periimplantite, sendo um dos mais sérios, a colonização e infecção da superfície do material por espécies de Streptococcus do grupo mutans, microrganismos colonizadores pioneiros (Liljemark & Bloomquist, 1996), A Candida albicans e espécies de Candida spp,. como espécies comensais (Scully et al., 1994), produzindo infecções como estomatite por uso de prótese, candidiase oral, gastrointestinal e pneumopulmonar (Budtz-Jorgensen, 1990; Nikawa et al., 1998).
2.7. Fitoterápicos.
As plantas medicinais estão sendo usadas em paises em desenvolvimento como tratamento alternativo para problemas de saúde (Duarte et al., 2005). Muitos extratos de plantas e óleos essenciais isolados de plantas medicinais, tem demonstrado exercer atividade biológica in vivo e in vitro, pelo qual se justifica a evaluação destas plantas tradicionais centrado na caracterização da atividade antimicrobiana destas plantas (Martinez et al., 1996). Produtos naturais usados como fitoterápicos como o alho (Allium sativum), a hortelã (Mentha piperita), a guaçatonga (Casearia sylvestris), o confrei (Symphytum officinale), o crajirú (Arrebidaea chica), o alecrim (Rosmarinus officinalis), a Bardana (Arctium minus),
dentre outros, tem demonstrando propriedades medicinais no combate a doenças que acometem o ser humano.
Já que estas plantas produzem uma variedade de componentes com propriedades antibacterianas e antifúngicas, se justificam pesquisar que venham, cada vez mais, selecionadas novas drogas antimicrobianas (Ahmad & Beg, 2001). Embora, se saiba que estes componentes das plantas mostrem alvos diferentes quando comparados com drogas sintéticas antibióticas, espera-se que sejam também ativas contra microorganismos patogênicos antibiótico-resistentes (Duarte
et al., 2005). Entre estas, são relatados a Mentha piperita, Cymbopogom
winteranus e Cymbopogom martinii, por apresentar propriedades antifúngicas e
antimicrobianas (Duarte et al., 2005), a Stevia rebaudiana por apresentar propriedades antibacterianas e antilevedura (Duarte et al., 2005) e a Matricaria
charmomilla por demonstrar propriedades antimicrobianas e antifúngicas (Mariann
et al., 1976). Estudos com esses produtos e/ou suas substancias, que possam
demonstrar estas propriedades nos processos patogênicos que acometem a cavidade oral, particularmente na formação do biofilme e na inibição da agregação de microrganismos, poderão contribuir para ampliar, de modo geral, o conhecimento sobre a atividade antimicrobiana destas substancias e seu papel na etiologia das doenças humanas.
3 Proposição
O presente trabalho de pesquisa tem o objetivo de avaliar o desenvolvimento do biofilme por Candida albicans, C. tropicalis e C. glabrata em materiais de polipropileno, resina e titânio em biofilmes pré-formados por
Streptococcus oralis, S. sanguis, S. mitis, S. mutans e Staphylococccus aureus.
Será também avaliada a ação dos extratos vegetais das espécies de Mentha
piperita, Cimbopogum martinii e Cimpopogum winterianus na inibição da
co-agregação da Candida albicans, C. tropicalis e C. glabrata a estes microrganismos.
4 Materiais
e
Métodos
4.1. Preparação dos discos.Os discos de titânio e nylon foram doados pela Conexão (Conexão, Sistema de Próteses, São Paulo, Brasil) já esterilizados medindo 1 cm de diâmetro e 1 mm de altura.
Os discos de resina acrílica usados nesta pesquisa foram preparados usando-se um molde de aço com seis círculos cortados a laser de 1,1 cm de diâmetro. Cera odontológica foi empregada como molde, derretida e depositada (em sua forma liquida) nos círculos do molde e posteriormente esfriados, permanecendo em uma mufla dental metálica para a confecção dos negativos dos discos. Resina de termo curado (Artigos Odontológicos Clássico Ltd, São Paulo, Brasil), foi preparada no molde de gesso, a 74ºC por 9 horas, permanecendo em um polimerizador (Termotron P-100, Termotron Equipamentos Ltd, Piracicaba, Brasil) de acordo com Moura et al., (2006). Após o esfriamento (por 2 horas) os discos foram removidos.
Os discos foram polidos progressivamente usando-se um lixador horizontal (modelos APL-4; Arotec, São Paulo, Brasil) com papéis de lija (320, 400, e 600 de grão). Para o polimento mecânico, foi utilizada uma polidora circular (TMP-200; Equilam, Diadema, Brasil), adicionando-se uma pasta polidora e um cone de feltro e pó de giz (Branco-Rio, OAB-ME, São Paulo, Brasil), segundo Braun et al., (2003). Todos os discos foram polidos por um mesmo operador, sendo expostos aos mesmos procedimentos; cada processo de polimento foi feito durante um minuto para cada superfície. Estes foram submetidos a limpeza por ultrassom (Thorthon t-740, Thorthon-Inpec Electronica Ltda, Vinhedo,Brasil) por 20 minutos, e imersos em água destilada a 37ºC por 12 horas para a liberação de resíduos de monômero (Oliveira et al., 2003). Após esses procedimentos, os discos foram
aleatoriamente selecionados antes do procedimento de adesão e formação do biofilme.
4.2. Cepas referenciais.
Foram utilizadas cepas referenciais de S. mutans UA159, S. sanguinis ATCC 10556, S. oralis PBI 182, S. mitis ATCC 903, S. aureus 25923, C. albicans CBS-562, C. tropicalis CBS-94 e C. glabrata B-07, provenientes da Bacterioteca e Micoteca da área de Microbiologia e Imunologia do Departamento de Diagnóstico Oral da Faculdade de Odontologia de Piracicaba, UNICAMP. Os Estreptococos e o S. aureus foram reativados de suas culturas originais (Ágar Mitis Salivarius; Difco e Ágar Cérebro-Coração; Mikrobiologie) em 5 mL de caldo cérebro-coração (Mikrobiologie), suplementado com 0.5% de Extrato de levedura (BHIY) granulado (Mikrobiologie), a uma temperatura de 37ºC em atmosfera com PCO2 de 10%
(Water-Jacked CO2 Incubators/Cole Parmer Instruments – USA) por 24 horas. As
espécies de Candida foram reativadas de suas culturas originais (Ágar Sabouraud; Difco, Sparks, Md), a temperatura de 37ºC em 5 ml de BHIY e incubados por 24 horas a 37ºC em atmosfera de aerobiose. As espécies cultivadas foram centrifugadas e suspensas em solução isotônica, NaCl 0.89%, tamponada com fosfato de sódio 0.1M, pH 7 (PBS, Phosphate Buffer Solution; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo), e agitadas por 15 segundos. O inoculo foi preparado em solução salina a uma absorbância de 0.25 a 520 nm, equivalente a uma concentração celular final de 1,2x108 UFC/mL para as bactérias, e a uma absorbância de 0,08 a 0,10 a 625 nm, equivalente a turbidez da escala Mc Farland (0,5), contendo aproximandamente 5,0 x 106 UFC/mL para as leveduras. (O'Sullivan et al., 2000).
4.3. Tempo de adesão.
As bactérias e leveduras foram submetidas à mensuração por espectrofotometria ajustadas a uma absorbância de 0.25 a 520 nm, equivalente a uma concentração celular final de 1,2x108 UFC/mL, onde suspensões de 80 µL
dos microrganismos foram depositadas nos discos e foram incubados em tempos de 60, 120, 180 e 240 minutos em placas de cultura celular. Em seguida os discos foram lavados, sonificados e submetidos ao método de plaqueamento em meios de Ágar mitis salivarius (AMS) para Estreptococos e sangue para S. aureus e em Sabouraud Dextrose Agar (SDA) para as leveduras. Com esse procedimento, determinou-se o tempo de adesão aos discos pelos microrganismos (Gráfico 1 e 2), permanecendo por um período de três horas, para servir como padrão em testes posteriores. Tempo / Minutos log(UFC/ml) 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 S. mutans S. oralis S. sanguinis S. mitis S. aureus 60 120 180 240
Tempo / Minutos lo g( U F C) /m l 3.9 4.0 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 C. albicans C. tropicalis C. glabrata 60 120 180 240
Gráfico 2. Tempo de adesão produzido por espécies de Candida em tempos de 60, 120, 180 e 240 minutos.
4.4. Formação do biofilme.
As bactérias foram semeadas em BHIY e incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera com PCO2 de 10%, em seguida as mostras foram centrifugadas
(2400g por 10 minutos) e lavadas duas vezes com tampão fosfato 0,05 mol/L, pH 6,8 sendo ajustadas a uma absorbância de 0.25 a 520 nm (Roberts et al., 2002) equivalente a uma concentração celular final de 1,2x108 UFC/mL (El-Azizi et al., 2004). Uma suspensão de 80 µL das bactérias foram depositadas nos discos por um tempo de 180 minutos - tempo de adesão. Depois do tempo de adesão os discos foram lavados com PBS 0,15 M pH 7.2 e depositados em placas de cultura celular (24-well Nunclon tissue culture plates) de superfície não tratada, com 1.5
mL de BHIY por 48 horas a 37ºC em atmosfera com PCO2 de 10%. As espécies de Candida foram semeadas 24 horas antes em YPD, e foram lidas a uma absorbância de 0,08 a 0,10 a 625 nm equivalente a uma concentração celular de 5,0 x 106 UFC/mL (Adam et al., 2002). Nos discos contendo os biofilmes das bactérias, foram depositados 80 µL das suspensões das leveduras permanecendo por um tempo de 180 minutos, lavados e transferidos para as placas de cultura com 1.5 mL de BHIY por 48 horas a 37ºC em condições aeróbicas (Chandra et al., 2001). As contagens das UFC/mL foram levadas a efeito pelo método de plaqueamento (Westergren & Krasse, 1978)em meio Ágar Sabouraud Dextrose.
4.5. Microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Os biofilmes formados no disco foram fixados com gluaraldeido tamponado 0,15 M 2,5% (vol/vol) por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, os discos foram preparados com trióxido de ósmio 1% por uma hora, e lavados três vezes com 3 mL de água destilada e, posteriormente, desidratados com séries de etanol (50% a 100%). Todos os discos foram secos a ponto critico e banhados em ouro, em seguida observados no MEV em aumentos de 3000x e 3500x. (Hawser & Douglas 1994).
4.6. Inibição por extratos vegetais.
Para se determinar o tempo de inibição do crescimento das espécies de
Candida no biofilme, foram depositadas alíquotas de 80 uL das amostras nos
discos; e depois do tempo de pré-incubação, os discos foram colocados em placas de cultura, adicionando-se 2 mL de BHIY, mantendo 1, 2 ,3, 6, 12, e 24 horas, respectivamente. O tempo de escolha para os demais testes foi de 6 horas, já que nos tempos de 1, 2 e 3 horas, as células levedurifomes se encontram em processo de ambientação (Gráfico 3). As plantas medicinais escolhidas para estudo no presente projeto pertencem à coleção de Germoplasmas do
CPQBA/UNICAMP, sendo espécies adaptadas à nossa região, com indicação de atividade anti-Candida (Tabela 1). Foram utilizadas amostras de plantas secas e moídas para obtenção dos extratos metanólicos. Os mesmos foram doados pela Profa. Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte responsável pela Divisão de Microbiologia do CPQBA/UNICAMP.
Tabela 1. Plantas medicinais da coleção de Germoplasmas do CPQBA/UNICAMP estudadas na presente pesquisa. (EM = extrato metanólico).
2.1 Planta Medicinal 2.2 Fam
ília 2.3 Nome Popular 2.4 No. CPM A 2.5 Prepar o
2.6 Mentha piperita 2.7 lami nac ea
2.8 Hortelã 2.9 1253 2.10 EM
2.11 Cymbopogon martini (Roxb.) J. F. Watson 2.12 Poa cea e
2.13 palmaros a
2.14 354 2.15 EM
2.16 C. winterianus Jowitt. 2.17 Poa cea e
2.18 citronella 2.19 712 2.20 EM
Extratos metanólicos de espécies de Mentha piperita, Cymbopogon martinii e C. winteranus foram diluídos para uma concentração de 1mg/mL em meio BHIY. Foi utilizado como controle positivo fluconazol em concentração de 1mg/mL. Alíquotas de 80 μL Candida spp. foram adicionadas aos discos com os biofilmes bacterianos previamente formados. Na seqüência, foram depositados em placas de cultura, contendo meio BHIY e, em seguida incubados por 6 horas a 37ºC em condições aeróbicas.
Após esse período o meio foi removido por aspiração. Posteriormente, adicionou-se caldo BHIY com o extrato vegetal a ser testado, para logo serem incubados por 48 horas a 37ºC em condições aeróbicas em estufa bacteriológica. A avaliação do potencial antifúngico dos extratos vegetais sobre biofilme das leveduras se deu pelo método de plaqueamento (Westergren & Krasse, 1978), em
diluição seriada, (10-4,10-5,10-6), semeando-se 20 μL de cada diluição em meio de Ágar Sabouraud Dextrose; em triplicata.
Tempo / Horas log(U F C)/ml 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 C.albicans C.tropicalis C.glabrata 1h 2h 3h 6h 12h 24h
Gráfico 3. Curva de formação do biofilme por espécies de Candida em tempos de 1, 2, 3, 6, 12 e 24 horas.
4.7. Processamentos dos Dados.
Os dados obtidos dos testes microbiológicos foram analisados no programa SIGMASTAT 3.0 DEMO (SPSS inc.) usando a prova estatística ANOVA “one-way” com correção Bonferroni sendo o valor P<0.05 estatisticamente significante eo teste Kruskal Wallis. Os Gráficos foram processados no programa SIGMAPLOT v.8.02 DEMO (SPSS inc.).
5. Resultados
5.1. Biofilme produzido por espécies de Candida
Os resultados do biofilme produzido por Candida spp. sobre biofilmes pré-formados de bactérias, demonstraram, particularmente, que as espécies de C.
albicans e C. tropicalis obtiveram maior interaçao sobre biofilmes pré-formados de
S. mutans e S. aureus, P<0.05. Isso pode ser confirmado através dos valores de
UFC/mL obtidos nessas reações e expressos nos Gráficos 4 e 5. A espécie C.
albicans desenvolveu biofilme sobre os biofilmes pré-formados de todas as
bactérias testadas em comparação com o controle positivo, porém, o S. mutans e o S. aureus, foram os microrganismos cujo biofilme teve maior influência na adesão e posterior desenvolvimento da C. albicans (P<0.05). O mesmo se deu em relação à C. tropicalis. Um grande incremento na adesão das Candida spp. sobre os materiais foram também observados, e comprovados pela microscopia eletrônica de varredura (Figuras 1 e 2).
B a c té ria s log(UFC)/mL 0 2 4 6 8 S . m u ta n s S . o ra lis S . s a n g u in is S . m itis S . a u re u s C o n tro l * *
Gráfico 4. Biofilme produzido por C. albicans sobre biofilme pré-formado de bactérias. * estatisticamente semelhantes.
B actérias lo g (UF C) /m L 0 2 4 6 8 S . m utans S . oralis S . sangu inis S . m itis S . au reus C ontrol * *
Figura 1. Células de C.albicans formando agregados com o S. mutans.
Os resultados obtidos nas reações com a espécie C. glabrata mostraram valores de UFC/mL estatisticamente menores dos apresentados pelas outras espécies de leveduras, P<0.05 (Gráfico 6 e Figura 3). Esta espécie obteve um desenvolvimento inferior de biofilme sobre os biofilmes pré-formados de todas as bactérias testadas, isto comparado ao controle positivo e as demais leveduras. Os dados obtidos mostraram um menor desenvolvimento do biofilme pela espécie C.
glabrata no biofilme pré-formado por S. aureus (P<0.05).
Bactérias lo g( UFC) /m L 0 1 2 3 4 5 6 7 S. mutans S. oralis S. sanguinis S. mitis S. aureus Control *
Gráfico 6. Biofilme produzido por C. glabrata sobre biofilme pré-formado de bactérias. * estatisticamente semelhantes.
Figura 3. Células de C. glabrata formando agregados com o S. mutans.
As espécies de Candida, de modo geral, mostraram valores mais significantes em biofilmes pré-formados por S. mutans e por S. aureus, P<0.05 (Gráfico 7), os quais independeram do material testado. As espécies de Candida desenvolveram biofilme sobre os biofilmes pré-formados de todas as bactérias testadas em comparação com o controle positivo, mas o S. mutans e o S. aureus, foram os microrganismos cujo biofilme mostrou maior influência na adesão e posterior desenvolvimento da Candida spp. (P<0.05). O desenvolvimento de
Candida spp. em biofilmes pré-formados por S. mitis e S. aureus, não revelaram
Bactérias lo g(UFC/ mL) 0 2 4 6 8 S. mutans S. oralis S. sanguinis S. mitis S. aureus Control * *** **
Gráfico 7. Biofilme produzido por espécies de Candida spp. em biofilmes pré-formados por bactérias. * estatisticamente semelhantes. ** estatisticamente semelhantes.
5.2. Biofilme produzido pelas espécies de Candida nos materiais testados
Os resultados obtidos em relação à influência dos matérias testados no desenvolvimento das espécies de Candida estão mostrados nos Gráficos 8, 9 e 10. Estatisticamente não se detectou diferenças significativas (P<0.05) na formação do biofilme para as espécies testadas.
M a te ria is lo g(UFC/m L ) 0 2 4 6 8
T itân io R esin a acrilica N ylon
Gráfico 8. Produção de biofilme pela C. albicans sobre biofilmes bacterianos pré-formados nos materiais testados.
M a t e r ia is lo g(UFC/ m L ) 0 2 4 6 8 T itâ n io R e s in a a c rilic a N y lo n
M a t e r ia is lo g (UF C/ m L ) 0 1 2 3 4 5 6 7 T itâ n io R e s in a a c rilic a N y lo n
Gráfico 10. Produção de biofilme pela C. glabrata sobre biofilmes bacterianos nos materiais testados.
5.3. Inibição das espécies de C. albicans no Biofilme por extratos vegetais
Os resultados obtidos nas reações de inibição das espécies de C. albicans por extratos vegetais, demonstraram valores semelhantes, quando comparados ao controle negativo fluconazol. (Gráfico 11). Estatisticamente, todos os extratos vegetais e o controle negativo mostraram o mesmo comportamento. Ao MEV as células de C. albicans se apresentaram formando agregados com o S. mutans, observando-se um comprometimento da parede celular das leveduras (Figuras 4-7).
Extratos vegetais log(UFC/ mL) 0 2 4 6 8 Cymbopogom martinii Cymbopogom winteranus Mentha piperita Fluconazol
Figura 4. Células de C. albicans formando agregados com S. mutans em presença de Fluconazol. Note-se a parede celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 5. Células de C. albicans formando agregados com o S. mutans em presença de C. martinii. Note-se a parede celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 6. Células de C. albicans formando agregados com S. mutans em presença de C. winteranus. Note-se a parede celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 7. Células de C. albicans formando agregados com S. mutans em presença de M. piperita. Note-se a parede celular comprometida e presença de formas filamentares
5.4. Inibição das espécies de C. tropicalis no Biofilme por extratos vegetais
Resultados semelhantes aos da espécie C. albicans foram obtidos nos testes de inibição das espécies de C. tropicalis, como podem ser observados no Gráfico 12. Estatisticamente, todos os extratos vegetais e o controle negativo (fluconazol) demonstraram o mesmo comportamento (P<0.05). Nas fotografias ao MEV as células de C. tropicalis estão formando agregados com o S. mutans e apresentam a parede celular também comprometida (Figuras 8-11).
Extratos vegetais log(UFC/ mL) 0 2 4 6 8 Cymbopogom martinii Cymbopogomwinteranus Mentha piperita Controle
Figura 8. Células de C. tropicalis em presença de Fluconazol. Note-se a parede celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 9. Células de C. tropicalis formando agregados com o S. mutans em presença de C. martinii. Note-se a parece celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 10. Células de C. tropicalis formando agregados com S. mutans em presença de C. winteranus. Note-se a parece celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 11. Células de C. tropicalis formando agregados com S. mutans em presença de M. piperita. Note-se a parede celular comprometida e presença de formas filamentares.
5.5. Inibição das espécies de C. glabrata no Biofilme por extratos vegetais
Os resultados obtidos na inibição das espécies de C. glabrata no biofilme por extratos vegetais mostraram valores mais elevados em relação à Mentha
piperita P<0.05 em comparação aos outros extratos e o controle (fluconazol)
(Gráfico 13). Os dados revelados pela microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostram um biofilme ativo formando agregados com a bactéria, assim como a presença de células superficiais do biofilme de C. glabrata com a parede celular comprometida (Figuras 12-15). Extratos vegetais log(UFC/mL) 0 1 2 3 4 5 6 7 Cymbopogom martinii Cymbopogomwinteranus Mentha piperita Controle *
Figura 12. Células de C. glabrata formando agregados com o S. mutans em presença de Fluconazol. Note-se a parece celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 13. Células de C. glabrata formando agregados com o S. mutans em presença de C. martinii. Note-se a parece celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 14. Células de C. glabrata formando agregados com S. mutans em presença de C. winteranus. Note-se a parece celular comprometida e presença de formas filamentares.
Figura 15. Células de C. glabrata formando agregados com S. mutans em presença de M. piperita. Note-se a parede celular comprometida e presenças de formas filamentares.
5.6. Inibição das espécies de Candida no Biofilme por extratos vegetais
A inibição parcial apresentada pelos extratos vegetais C. martinii, C.
winteranus e M. piperita contra o desenvolvimento de biofilme por espécies de
Candida, foi estatisticamente igual para estes extratos, comparado com o controle
negativo (fluconazol) (P<0.05), como pode ser observado no Gráfico 14. Os dados revelados pela microscopia eletrônica de varredura mostram um biofilme ativo formando agregados com a bactéria, apresentando formas filamentosas predominantemente, em comparação com os resultados obtidos nos biofilmes sem tratamento antifúngico. Extratos vegetais log( UFC /mL) 0 2 4 6 8 Cymbopogom martinii Cymbopogom winteranus Mentha piperita Controle
6 Discussão
Tem-se demonstrado com certa regularidade, que espécies de Candida estão presentes no biofilme oral, co-agregadas ou aderidas à espécies bacterianas ali presentes – preferencialmente espécies de Estreptococos, assim como também há adesão destas leveduras às células do epitélio e aos aparatos protéticos. Neste caso, é muito comum que pacientes portadores de próteses sejam alvos para as infecções fúngicas.
A interação entre diferentes microrganismos num biofilme pode ter uma conseqüência na colonização e subseqüente infecção (El-Azizi et al., 2004). Os microrganismos podem se aglutinar uns com os outros promovendo uma melhor adesão e desenvolvimento do biofilme, mas também outras aglutinações podem reduzir a capacidade de desenvolver esta estrutura (El-Azizi et al., 2004). As espécies de Candida existem na maioria das vezes numa mistura heterogênea com outros microrganismos, os quais podem, de algum modo, afetar o desenvolvimento de biofilme por leveduras (El-Azizi et al., 2004).
Pesquisas têm descrito variações na interação entre complexos de bactérias e Candida spp. no desenvolvimento do biofilme. Neste sentido, estreptococos orais são predominantemente habitantes da cavidade oral e podem ser co-cultivados com Candida spp. Algumas pesquisas têm-se referido ao S.
mutans, como um microrganismo que não influi no desenvolvimento do biofilme
por espécies de Candida (Jenkinson et al., 1990; Thein et al., 2006). Os dados obtidos na presente pesquisa, demonstraram que a especie Candida albicans é capaz de desenvolver biofilme sobre biofilmes pré-formados por bactérias, particularmente a espécie Streptococcus mutans, demonstrando ser esse microrganismo, um bom substrato para o posterior desenvolvimento de espécies de Candida. Outros estreptococos orais têm sido estudados, e os resultados demonstram que o S. sanguinis e o S. oralis são capazes também de se
