No decurso do projecto foram inseminados 9 efectivos de criadores de raça Serrana (ACORO e da ACRO) com sémen refrigerado de bodes existentes no Departamento de Reprodução Animal que foram utilizados no estudo da variação anual das características seminais do SF e SD atrás apresentado. Nos dois últimos anos do projecto foi possível inseminar um efectivo de raça Serrana com SD. Resumindo foram inseminadas 251 cabras com SR e 45 cabras com SD. Paralelamente colaborámos com a DRAALG e a DRABI na inseminação de 650 cabras das raça Algarvia, Serrana e Charnequeira com sémen refrigerado durante os três anos em que decorreu o projecto.
3.1 Refrigeração de sémen para Inseminação Artificial (IA)
Após a avaliação macroscópica e microscópica anteriormente descrita, só os ejaculados com mobilidades massais ≥3, MI ≥ 65 % e concentrações > 2 mil milhões de spz/ml são utilizados para IA. Os ejaculados com estas características são diluídos após prévia determinação da concentração com um diluidor à base de leite de vaca desnatado (FAO, 1993) contendo glucose e uma mistura de antibióticos (penicilina e estreptomicina) de modo a obter uma concentração de 800 milhões de spz/ml. Após esta etapa os tubos colectores contendo o sémen diluído são colocados num termos a que é adicionada uma ampola de ácido acético glacial (15 ºC), sendo substituída ao fim de 30 minutos. O processo de refrigeração (15 ºC) fica completo ao fim de duas horas devendo o sémen ser utilizado nas três horas seguintes. Previamente ao enchimento das palhinhas (0,25 ml) são retiradas alíquotas de sémen e feita nova observação ao microscópio para verificar se está apto a ser utilizado.
3.2 Sincronização do estro e IA com sémen refrigerado
A sincronização do estro das cabras que foram inseminadas foi efectuada com esponjas vaginais impregnadas com 45 mg de FGA (acetato de fluorogestona) durante 11 dias. Ao nono dia foram administradas 500 UI (i.m) de eCG e 100 µg de cloprostenol (análogo da PGF2α). Estas cabras apresentaram um bom estado sanitário e condição corporal e tiveram um comportamento reprodutivo normal na época de reprodução anterior. A IA foi realizada por via cervical nas 256 cabras entre as 42-44 horas após a remoção das esponjas vaginais (Rev) sem prévia detecção do estro utilizando uma dose de sémen contendo 200 milhões de spz totais. A época de IA decorreu na época reprodutiva tradicional (Primavera) entre 27 de Abril e 20 de Maio. Cerca de 14 dias após a IA, os bodes das respectivas explorações foram colocados no rebanho durante cerca de 45 dias permitindo a cobrição de animais que não tivessem ficado gestantes após a IA. Foram avaliados os parâmetros reprodutivos fertilidade (cabras paridas/cabras inseminadas), fecundidade (crias nascidas/cabras inseminadas) e prolificidade (crias nascidas/partos). Também avaliamos estes parâmetros reprodutivos por bode e por exploração.
3.3 Resultados reprodutivos após IA com sémen refrigerado
No programa de IA com sémen refrigerado foram utilizados 8 bodes nas 251 cabras inseminadas de criadores associados da Acoro e da Acro. No quadro 16, são apresentados os parâmetros reprodutivos globais após a IA, bem como os resultados reprodutivos por bode utilizado. Globalmente a fertilidade, fecundidade e prolificidade foram respectivamente 60,2 %,
106 % e 176 % respectivamente. Foram observadas variações significativas entre bodes relativamente a estes parâmetros reprodutivos.
Quadro 16. Parâmetros reprodutivos (%) obtidos após IA com sémen refrigerado em cabras Serranas (análise estatística pelo teste U de Mann-Whitney)
Bodes IA (n) Partos Crias Fertilidade Fecundidade Prolificidade
5 79 38 59 48,1a 75,0a 155,3a 106 11 5 10 45,50ab 91,0abc 200,0bc 107 25 19 41 76,0bc 164d 216,0c 131 31 26 48 83,9c 155,0cd 185,0b 142 40 25 48 62,5abc 120bcd 192,0bc 223 9 4 7 44,4ab 78,0ab 175,0abc 602 26 13 18 50,0ab 69,2a 139,0a 711 30 21 35 70,0bc 117,0bc 167,0ab Global 251 151 266 60,2 106,0 176,1
Neste programa de IA com sémen refrigerado os bodes 107 e 131 apresentaram as fertilidades e fecundidades mais elevadas, não havendo grandes variações de fertilidade nos restantes bodes. A prolificidade apresentou menores variações embora fossem registados valores mais elevados nos bodes 106, 107 e 142.
Procurou-se correlacionar a fertilidade após inseminações artificiais usando sémen refrigerado, com a qualidade do sémen expresso pela mobilidade individual, spz vivos e spz normais. Dos 7 bodes utilizados nas IA só foi possível usar 3 animais (5, 131 e 711), a partir das médias obtidas em ejaculados recolhidos na mesma época das IA (Primavera). Nestes animais não foram observadas diferenças significativas naqueles parâmetros seminais.
Foram observadas correlações positivas entre a MI (r=0,82), vivos (r=0,999) e normais (r=0,795) com a fertilidade. Contudo, somente a correlação entre a percentagem de spz vivos e a fertilidade foi significativa (p<0,05; gráfico 16).
Gráfico 16 – Regressão da percentagem de espermatozóides vivos com a fertilidade, utilizando sémen fresco colhido na Primavera de 3 bodes.
Fertilidade = -262,9 + 5,1805 * Vivos r = ,99960 (p<0,05) 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 Spz vivos (%) 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 Fer tilidade ( % ) 95% int conf
3.4 Sincronização do estro e IA com sémen descongelado
O protocolo de sincronização do estro, o momento de IA e a concentração de espermatozóides por dose foi idêntico ao utilizado na IA com sémen refrigerado. Foram descongeladas 1-2 palhinhas de cada ejaculado como anteriormente referimos. Só foram utilizados ejaculados contendo pelo menos 35 % de spz móveis cinco minutos após a descongelação. O sémen destinado á IA foi transportado no respectivo contentor. Após a descongelação realizada em banho-maria a 37 ºC durante 50 segundos, as palhinhas foram cuidadosamente secas, recortada a extremidade selada com álcool polivinílico e introduzidas no respectivo “pistolet”, procedendo-se de imediato à IA das cabras anteriormente sincronizadas. Na exploração em que foi possível inseminar com SD foi utilizado o sémen de um bode. No 1º ensaio de IA, esta foi realizada em Novembro por decisão do criador. No segundo ano a IA foi realizada em Maio, sendo utilizado o sémen de outro bode. Nas 45 cabras inseminadas com SD de 2 bodes não foram observadas variações significativas nos parâmetros reprodutivos cujos resultados médios foram respectivamente 27 % (fertilidade), 56 % (fecundidade) e 208 % (prolificidade) (Quadro 18). No bode 5 a prolificidade foi numericamente superior ao bode 131, mas sem significância (P=0,08).
Quadro 18. Parâmetros reprodutivos (%) obtidos após IA com sémen congelado em cabras Serranas
Bode IA (n) Partos Crias Fertilidade Fecundidade Prolificidade
5 23 5 12 22,0 52,2 2,4
131 22 7 13 32,0 59,1 1,86 Global 45 12 25 27,0 56,0 2,08 4. Estudos sobre a fertilidade in vitro com sémen descongelado
Os parâmetros clássicos de classificação espermática, estudados de forma subjectiva por microscopia óptica, são insuficientes para predizer a fertilidade nos machos domésticos, uma vez que poucos deles apresentam uma correlação significativa com a fertilidade in vivo. Quantos mais parâmetros forem utilizados, mais acurada será esta avaliação. Uma vez que a fertilização é um processo em que o sémen executa várias funções, parece lógico combinar diferentes testes de avaliação da fertilização para se obter uma melhor correlação entre eles e a fertilidade in vivo. O objectivo deste projecto seria, numa primeira fase, implementar em Portugal a técnica de produção in vitro (IVP) de embriões caprinos, comparando a fertilidade in vitro do sémen de vários bodes congelado em duas épocas diferentes (Outono e Inverno) e, numa segunda fase, correlacionar estes parâmetros de fertilidade in vitro com os de fertilidade in vivo após inseminação artificial.
Nesta vertente do projecto deparámos com uma grande dificuldade na obtenção de ovários a partir de cabras abatidas nos matadouros regionais. Por outro lado, os resultados desanimadores obtidos com o nosso sistema de produção (IVP) na espécie ovina, levaram-nos a contactar, em Janeiro de 2004, a equipa francesa de produção in vitro de embriões em pequenos ruminantes, do Departamento de Fisiologia da Reprodução e dos Comportamentos (INRA), Nouzilly, Tours, chefiada pelo Professor Yves Cognié. A sua colaboradora, Dra. Nati Poulin, veio a Portugal para demonstrar no nosso laboratório a sua técnica de produção in vitro de embriões ovinos e caprinos, com a qual tem obtido bastante sucesso em França.
Enquanto a implementação da técnica decorria ainda entre nós, foram enviadas para aquele Departamento de Fisiologia em França várias palhinhas de sémen de bode. Os resultados
de fertilização in vitro que referimos a seguir foram enviados pela Dra. Nati Poulin, de acordo com o seu sistema de produção de embriões caprinos e ovinos (Cognié et al., 2003).
4.1. Metodologia
a) Colheita de ovários e aspiração de oócitos
Os ovários foram transportados até ao laboratório numa solução fosfato-salina tamponizada da Dulbecco (PBS) entre os 30 a 35ºC, a que se adicionou antibiótico (0,05 mg ml-1 sulfato de kanamicina). À chegada ao laboratório os ovários foram lavados, primeiro com água tépida, depois com soro fisiológico, mantendo-se em banho-maria a 35ºC durante todo o processo de aspiração. Aspiraram-se os oócitos a partir de folículos superiores a 2 mm de diâmetro com agulha de 19,5 G adaptada a uma bomba de vácuo (pressão de 20 mm de Hg), utilizando-se meio de aspiração constituído por TCM 199 (Tissue Culture Médium, com sais de Earle, L-glutamina e 25 mM ml-1 de Hepes), suplementado com 2µl mL-1 de heparina e 4µl mL-1 de gentamicina. A este meio foi ainda adicionado 0,5g ml-1 de albumina sérica bovina (BSA; Fracção V), para evitar a aglutinação dos oócitos à parede do tubo de recolha. A taxa de colheita na cabra é de 1 a 2 oócitos de boa qualidade por ovário.
O líquido folicular recolheu-se em tubos de 50 ml onde se haviam colocado 5ml do meio referido anteriormente. Com a bomba de vácuo, a aspiração não demora mais que 10 minutos. Os oócitos foram seleccionados à lupa para poços em caixas de Petri contendo meio igual ao anterior, mas sem heparina (meio TCM 199 com sais de Earle, L-glutamina e 25 mM mL-1 de Hepes, suplementado com 4µl mL-1 de gentamicina). Depois de várias passagens neste meio, os oócitos lavados foram admitidos no processo seguinte de maturação in vitro.
b) Maturação in vitro de oócitos ovinos
Apenas se seleccionaram para a fase de maturação os oócitos que apresentaram citoplasma uniformemente granuloso, sem sinais de atrésia nas células do cumulus e da granulosa que os envolvem. O meio de maturação é um meio definido constituído por TCM 199 sem HEPES com bicarbonato, suplementado com estradiol (E2, 200 ng mL-1), cisteamina (100 µM, De Matos et al., 1999; Cognié et al., 2002) e um factor de crescimento, EGF (Epidermal Growing Factor, 10ng mL-1), estes últimos responsáveis pelo aumento da competência nuclear e citoplasmática de oócitos em ovinos e caprinos (Cognié et al., 2003). O meio é colocado em caixas de 4 poços (500 µl de meio/poço para cada grupo de 50 a 70 oócitos) e é estabilizado durante 1 hora na estufa a 38,5ºC com 5% de CO2 e máxima humidade antes de receber os oócitos. A maturação realizou-se na incubadora nas mesmas condições durante 24 horas.
c) Descongelação e capacitação dos espermatozóides
Previamente à fase de fertilização dos oócitos maturados, o sémen congelado foi sujeito a descongelação, centrifugação por gradientes de Percoll e capacitação in vitro. A centrifugação do sémen com gradientes de densidade (Percoll, 45%/90%) parece ser superior a outros procedimentos quando se utiliza sémen descongelado para fertilização in vitro (Rho et al., 2001). Consequentemente, 1 ml de Percoll a 90% (19 ml de Percoll a 100% com 1 ml de cloreto de sódio a 9%) foi colocado suavemente, sem misturar, no fundo de um tubo cónico de 15 ml contendo já 1 ml de Percoll a 45% Este gradiente foi preparado adicionando 500µl de Percoll a 90% com 500 µl de meio SOF (Synthetic Oviductal Fluid ou fluido tubárico sintético, Takahashi e First, 1992) sem BSA (Meio 1), suplementado com 2,35 mg HEPES mL-1 e 4 µl mL-1 de gentamicina. O conteúdo de duas palhinhas de sémen, descongelado em água a 37ºC durante 30
segundos, foi então depositado directamente na superfície deste gradiente, previamente equilibrado durante 1 hora em estufa a 39ºC com 5% de CO2 e máxima humidade. Após a centrifugação a 900 g durante 10 minutos, rejeitou-se o sobrenadante, determinou-se a concentração do eluato na câmara de Neubauer e calculou-se a diluição de modo a obter uma concentração de 1x107 spz mL-1 no meio de capacitação. O meio de capacitação é constituído por SOF sem BSA, suplementado com 10% de soro de cabra em cio, 10 µg mL-1 de heparina e 4 µL mL-1 de gentamicina. Os espermatozóides incubaram durante 15 a 30 minutos neste meio em estufa a 39ºC com 5% de CO2 e máxima humidade.
d) Fertilização in vitro
Os oócitos maturados foram desnudados das células do cumulus por pipetagens sucessivas em meio SOF com BSA sem gentamicina. Após a passagem por quatro banhos sucessivos neste mesmo meio, os oócitos lavados foram colocados em grupos de 40 a 50 dentro de poços com 450 µl de meio de fertilização, constituído por meio SOF sem BSA com 10% soro de cabra em cio e 4 µL mL-1 de gentamicina. A este meio adicionaram-se 50 µl da diluição de espermatozóides preparada como é referenciado na alínea anterior, de modo a obter uma concentração final de 1x106 spz mL-1. A fertilização in vitro realizou-se em caixas de 4 poços cobertos com 350 µl de óleo mineral em estufa a 39ºC com 5% de CO2 e máxima humidade. A taxa de clivagem (%) foi determinada às 24 e 48 horas após a inseminação correspondendo à razão entre o número de oócitos que se encontram na fase de 2 ou mais células e o total de oócitos inseminados.
e) Desenvolvimento embrionário in vitro
Após 18 horas de contacto com os espermatozóides, os possíveis zigotos foram de novo lavados por pipetagens sucessivas em poços com meio SOF com BSA sem gentamicina e colocados em grupos de 25 embriões dentro de gotas de 25 µl do mesmo meio, cobertas por 700 µl de óleo mineral, onde continuaram o seu desenvolvimento em estufa a 39ºC com 5% CO2, 5% de O2 e 90% de N2. Às 48 horas após a fertilização adicionaram-se 10% de soro de ovelha em cio ao meio SOF, até ao dia 8-9 de desenvolvimento. A taxa de desenvolvimento embrionário foi dada pela razão entre o número de zigotos em fase de mórula, jovem blastócito, blastócito, blastócito expandido e blastócito eclodido aos dias 5,6,7 e 8 de cultura e o número de oócitos clivados às 48 horas após a fertilização. A taxa de eclosão obtém-se pela percentagem de blastócitos eclodidos em oócitos clivados às 48 horas.
4.2. Resultados
Foram fertilizados in vitro 736 oócitos com sémen pertencente a dois bodes de raça Serrana (nº711 e nº131). Dos 736 oócitos referidos, um total de 363 foi inseminado com sémen congelado no Outono (bode nº711: n=235 e bode nº131: n=128) e 373 com sémen congelado no Inverno (bode nº711: n=237; bode nº131: n=136). Este estudo realizou-se em quatro (bode nº711) e duas (bode nº131) sessões. As diferenças entre grupos foram analisadas por análise de variância (ANOVA, Statistica), sendo os resultados expressos pelas médias ± desvio padrão (dp). Independentemente das épocas de colheita do sémen, o bode nº711 apresenta uma taxa de clivagem às 24 horas significativamente superior à do bode nº131 (39,89%±11,68% vs. 25,26%±7,12%, respectivamente, P<0,05), o mesmo não se verificando às 48 horas (Quadro 19).
Quadro 19. Taxas de clivagem às 24 e 48 horas após a fertilização in vitro de oócitos caprinos com sémen de dois bodes independentemente da sua época de congelação.
Bode (nº) Oócitos Insem. (n) Oóc. cliv. (24 h) (n) Clivagem (24 h) (%) Oóc. Cliv. (48 h) (n) Clivagem (48h) (%) 711 472 185 39,89±11,68ª 389 84,34±9,75ª 131 264 68 25,26 ± 7,12b 212 80,69±10,13ª
Sobrescritos diferentes na mesma coluna, indicam diferenças significativas (P<0,05)
No Quadro 20 verificamos que, independentemente do bode considerado, não existem diferenças significativas entre as taxas de clivagem às 24 horas da totalidade dos oócitos fertilizados com sémen dos dois bodes quando congelado no Outono (bodes nº711 e nº131, n=363) e no Inverno (bodes nº711 e nº131, n=373) (39,64%±15,91% vs. 30,39%±5,57%, respectivamente, P>0,05).
Quadro 20. Taxas de clivagem às 24 horas após a fertilização in vitro de oócitos caprinos com sémen de dois bodes congelados em épocas diferentes.
OUTONO INVERNO Bode (nº) Oócitos Insem (n) Oóc. cliv. (24 h) (n) Clivagem (24 h) (%) Oócitos Insem (n) Oóc. cliv. (24 h) (n) Clivagem (24 h) (%) 711 (n=4) 235 113 48,00±10,98 a1 237 72 31,78±4,70ª2 131 (n=2) 128 30 22,91±8,01 b1 136 38 27,60±8,10a1 Total 363 143 39,64±15,91 1 373 110 30,39±5,57 1
Sobrescritos diferentes indicam diferenças significativas (P<0,05; letras para colunas e números para linhas).
Por outro lado, verificamos que a taxa de clivagem às 24 horas após a inseminação com o sémen do bode nº711 congelado no Outono é significativamente superior à obtida quando se utiliza sémen do mesmo bode congelado no Inverno (48,00%±10,985% vs. 31,78%±4,70%, P<0,05). Aquele bode mostra-se superior ao bode nº131 no Outono (48,00%±10,985% vs. 22,91%±8,01%, respectivamente, P<0,05). Não existem diferenças significativas entre o sémen do bode nº131 congelado no Outono e no Inverno.
Como verificamos no Quadro 21, não existem diferenças significativas entre as épocas de Outono e de Inverno quanto às taxas de clivagem às 48 horas da totalidade dos oócitos fertilizados com o sémen dos dois bodes (83,34±9,71vs. 82,91±10,37, respectivamente, P>0,05). Também não existem diferenças às 48 horas nas taxas de clivagem entre o mesmo bode nas duas épocas ou entre bodes diferentes nas duas épocas.
Quadro 21. Taxas de clivagem às 48 horas após a fertilização in vitro de oócitos caprinos com sémen de dois bodes congelados em duas épocas diferentes.
OUTONO INVERNO Bode Oócitos Insem. (n) Oóc. cliv. (48h) (n) Clivagem (48h) (%) Oócitos insem. (n) Oóc. cliv. (48 h) (n) Clivagem (48 h) (%) 711 (n=4) 235 203 87,04±5,71 237 186 81,65±13,04 131 (n=2) 128 96 75,96±14,49 136 116 85,42±2,95 Total 363 299 83,34±9,71 373 302 82,91±10,37
Comparações entre animais na mesma época e entre épocas para o mesmo animal: P>0,05
Quanto ao desenvolvimento embrionário, e independentemente da época de congelação do sémen, o bode nº711 apresenta taxas de produção de embriões (embriões/oócitos clivados) aos dias 6, 7 e 8 de cultura significativamente superiores às do bode nº131 (Quadro 22).
Quadro 22. Taxas de produção de embriões aos dias 6, 7 e 8 de cultura in vitro (D6, D7, D8) e taxas de embriões eclodidos após inseminação dos oócitos com sémen de dois bodes (independentemente da época de congelação do sémen).
Bode (nº) Embriões D5 (%) Embriões D6 (%) Embriões D7 (%) Embriões D8 (%) Embriões Eclodidos (%) 711 (n=4) 20,04± 9,91 51,61±12,11 a 53,50± 11,56a 49,86±8,57ª 60,47±16,62ª 131 (n=2) 6,79 ±9,43 21,87± 10,59 b 31,36±13,14b 27,84±17,69b 42,63±45,08ª
Sobrescritos diferentes na mesma coluna, indicam diferenças significativas (P<0,05).
No Quadro 23, considerando as duas épocas e os dois animais, verificamos que apenas quando se utiliza sémen de Outono a taxa de produção de embriões do bode nº711 é significativamente superior à do bode nº131 ao dia 6 de cultura in vitro (58,08%± 11,42% vs 14,70± 3,81, respectivamente, P< 0.05). Na época de Inverno estas taxas não são diferentes significativamente. Para o mesmo bode, não existem também diferenças significativas entre épocas.
Quadro 23. Taxas de produção de embriões ao dia 6 (D6) de cultura in vitro após inseminação dos oócitos caprinos com sémen de dois bodes congelado em duas épocas do ano.
OUTONO INVERNO Bode (nº) Oócitos clivados Emb.D6 (n) Emb D6 (%) Oócitos clivados Emb. D6 (n) Emb D6 (%) 711 (n=4) 131 76 58,08± 11,42ª 1 159 75 47,30±12,59ª1 131 (n=2) 48 7 14,70± 3,81 b1 58 17 29,05± 10,77ª1
Sobrescritos diferentes na mesma coluna, indicam diferenças significativas (P<0,05); números indicam comparações entre épocas diferentes para o mesmo animal
Independentemente do factor individual, verificamos que não existem diferenças significativas entre as épocas de Outono e Inverno, quanto às taxas de embriões produzidos pelo conjunto dos dois bodes (nº711 e nº131) aos dias 5, 6, 7 e 8 de cultura in vitro e às taxas de embriões eclodidos.
4.2.1. Fertilidade in vivo vs. fertilidade in vitro
Correlacionaram-se os valores no sémen descongelado da MI, % de Vivos, % de Normais, e das endosmoses aos 5, 25 e 40 minutos, com as taxas de clivagem (24 e 48 h), de blastocistos em D8 e de embriões eclodidos. Utilizaram-se, para cada um destes parâmetros, as médias obtidas em dois bodes (131 e 711) no Outono e Inverno. Só foram observadas correlações significativas entre as endosmoses aos 25 (r=0,96) e 40 (r=0,98) minutos com a taxa de clivagem embrionária às 48 horas. Nestes dois animais, também se observou uma correlação significativa das endosmoses aos 25 minutos com a mobilidade individual (r=0,96) e com as anomalias da cabeça (r=-0,96).
Entre os dois bodes estudados (711/131), houve uma relação directa entre a fertilidade in vivo obtida a partir de inseminações com sémen refrigerado colhido na Primavera (ratio entre bodes: 0,83) e a fertilização in vitro obtida a partir das clivagens às 48 horas usando sémen congelado colhido no Inverno (ratio entre bodes: 0,92). Não houve diferenças significativas entre as fertilidades in vitro e in vivo, em ambos os bodes (p>0,05). Não se verificaram diferenças entre bodes, quer in vivo quer in vitro (p>0,05).
Quadro 24. Fertilidades in vivo (% partos por inseminações) e in vitro (% de clivagens às 48 horas) nos bodes 131 e 711.
Bodes IA
(n) Partos (n) in vivo (%) Fertilidade inseminadosOócitos Clivados às 48 h in vitro (%) Fertilidade
131 31 26 83,9 68 58 85,3
711 30 21 70,0 237 186 78,5
Razão: 711/131
0,83 0,92
Fertilidades entre linhas e colunas: p>0,05 (qui quadrado com correcção de Yates)
Gráfico 17. Fertilidades in vivo e in vitro nos bodes 131 e 711
85,3 78,5 83,9 70 Bode 131 Bode 711 50 55 60 65 70 75 80 85 90 F e rt ili dade i n vi vo e cl iv agens às 48h i n vi tr o ( % ) in vitro in vivo p>0,05 p>0,05 p>0,05
4.3. Conclusões
Estes resultados são provisórios, dado que faltam ainda realizar sessões de fertilização in
vitro com sémen de ambos os bodes referidos, assim como de outros bodes cujo sémen tem
vindo a ser congelado nas duas épocas de Outono e de Inverno.
Os dados parecem sugerir para já que, nos caprinos de raça Serrana, existem diferenças na capacidade de fertilização in vitro do sémen congelado/descongelado, apenas nas primeiras 24 horas após a inseminação, variação esta que se manifesta de animal para animal, na mesma época e entre épocas. O bode de raça Serrana nº711 tem uma maior taxa de clivagem, que se manifesta significativamente até às 24 horas após a inseminação, quando o seu sémen é congelado no Outono em relação ao bode nº131 da mesma raça, na mesma época. Por outro lado, o sémen daquele bode congelado no Inverno apresenta taxas de clivagem in vitro às 24 horas inferiores às de Outono. Também no Outono, o bode nº711 mostrou-se superior ao nº131 quanto às taxas de produção de embriões ao dia 6 de cultura. Entre os dois bodes estudados (711/131), houve uma relação directa entre a fertilidade invivo obtida a partir de inseminações com sémen refrigerado colhido na Primavera (ratio entre bodes: 0,83) e a fertilização in vitro obtida a partir das clivagens às 48 horas usando sémen congelado colhido no Inverno (ratio entre bodes: 0,92). 5. Objectivos vs Realização
Não foi possível concretizar todos os objectivos pretendidos. A implementação da tecnologia de congelação de sémen de bode foi no entanto alcançada, após as muitas afinações que esta técnica exigiu. Congelou-se sémen de bode ao longo do ano, embora o sémen de alguns bodes não demonstrasse aptidão para a congelação. A situação complicou-se quando, por limitações logísticas, não foi possível ter em estudo mais de 6 bodes simultaneamente durante os ensaios. O treino dos bodes para a obtenção de sémen por vagina artificial também não foi fácil, pois estes animais são naturalmente “desconfiados”, decidindo algumas vezes não saltar/ejacular,