INTRODUÇÃO

1.1. Câncer

O câncer é uma doença genética das células somáticas. Nas células cancerosas, surgem várias mutações que afetam a sua multiplicação e sua propagação. Tanto as mutações de ganho de função dos oncogenes quanto as mutações de perda de função dos genes supressores tumorais podem contribuir para a progressão de um tumor através do desequilíbrio dos controles normais que reprimem o ciclo celular ou que promovem a apoptose (Griffith et al., 2001).

No Brasil, a estimativa para o ano de 2008 aponta que ocorrerão 466.730 novos casos de câncer. Os tipos mais incidentes serão os de próstata e pulmão para o sexo masculino e mama e colo útero para o sexo feminino (Tabela 01). Tornando-se o terceiro grupo de causas de mortalidade, superado apenas por doenças cardiovasculares e por morte acidental - tanto acidentes de trânsito quanto violência urbana - e consolidando-se como um problema de saúde pública (INCA 2008).

Os termos “câncer”, “neoplasia maligna” e “tumor maligno” são sinônimos e distinguem-se dos tumores benignos pelo poder de invasão e capacidade de metastatizar-se, isto é, disseminar-se para outras partes do corpo (Lodish et al., 2000).

Existem três abordagens principais para o tratamento de câncer: excisão cirúrgica, irradiação e quimioterapia dependendo do tipo de tumor e o estágio de desenvolvimento. A quimioterapia constitui o método mais utilizado como adjuvante da cirurgia para muitos tipos de tumores (Laurence et al., 1997). É classificada como curativa, adjuvante, neoadjuvante e paliativa (INCA 2008), (Tabela 02).

Tabela 1: Estimativas, para o ano 2008, do número de casos novos por câncer, em

homens e mulheres, segundo localização primária. Localização Primária

Neoplasia Maligna

Estimativa de casos novos Masculino Feminino Total

Próstata 49.530 - 49.530

Mama Feminina - 49.400 49.400

Traquéia, Brônquio e Pulmão 17.810 9.460 27.270

Cólon e Reto 12.490 14.500 26.990 Estômago 14.080 7.720 21.800 Colo do Útero - 18.680 18.680 Cavidade Oral 10.380 3.780 14.160 Esôfago 7.900 2.650 10.550 Leucemias 5.220 4.320 9.540 Pele/Melanoma 2.950 2.970 5.920 Outras Localizações 55.610 62.270 117.880 Subtotal 175.970 175.750 351.720 Pele/não-Melanoma 55.890 59.120 115.010 Todas as Neoplasias 231.860 234.870 466.730

Fonte: MS/Instituto Nacional de Câncer – INCA

Tabela 2: Classificação quanto ao tipo de quimioterapias.

Classificação Objetivos Exemplos

Curativa

Controle completo do tumor

Doença de Hodgkin, leucemias agudas, carcinomas de testículos, coriocarcinoma gestacional.

Adjuvante

Esterilizar células residuais locais ou circulantes, diminuindo incidências de metástases à distância.

Câncer de mama em estádio II.

Neoadjuvante ou prévia

Redução parcial do tumor Quimioterapia pré-operatória aplicada em caso de sarcomas de partes moles e ósseos

Paliativa ^{Qualidade de sobrevida Carcinoma indiferenciado de células} pequenas do pulmão

O conjunto de drogas antineoplásicas inclui agentes químicos que podem impedir o desenvolvimento de tumores através da inibição do crescimento celular ou pela morte das células que estão se replicando de forma continuada. Essas drogas incluem agentes alquilantes (ciclofosfamida), antimetabólicos (fluorouracil), antibióticos (doxorubicina), derivados vegetais (vincristina), hormônios (dietilstilbestrol) e agentes diversos, que não se enquadram nas categorias anteriores (Goodman & Gilman., 2002).

Agentes físicos e químicos usados como citostático têm demonstrado capacidade de induzir dano cromossômico, tanto em experimentos in vitro, como em estudos de monitoramento de pacientes tratados com este tipo de terapia (Migliore et al., 1991-a; Green et al., 1991). Muitas drogas antitumorais como os agentes alquilantes, inibidores de topoisomerase II e tiopurinas podem provocar mutações no DNA e podem causar câncer secundário (Jemal et al., 2004).

1.3. Drogas Metálicas

Há muitos anos atrás, metais preciosos como o ouro eram usados no tratamento de enfermidades e acreditava-se que estes metais eram benéficos para a saúde humana. Mas, estudos recentes têm associado as propriedades medicinais de drogas inorgânicas com suas propriedades biológicas (Claire & Dyson, 2001).

A descoberta das propriedades antitumorais da cisplatina na década de 1960 revolucionou a terapia dos tumores (Rosenberg et al., 1969; Claire & Dyson, 2001). A cisplatina é uma das drogas de maior efeito citostático desenvolvida para o tratamento de carcinomas sólidos (Nicolini, 1988) e, desde o seu desenvolvimento, vários complexos metálicos de platina e não-platina foram sintetizados e testados, demonstrando atividade antitumoral (Kostova, 2006).

Muitas drogas com compostos metálicos são usadas para outros tipos de tratamentos além do câncer como a prata, que é usada para o tratamento de infecções microbianas; o ouro que atua no tratamento do

câncer, vírus (HIV), asma, malária e artrite reumática (Claire & Dyson, 2001).

Vários outros compostos derivados de metais têm sido testados contra tumores em modelos humanos e animais experimentais. Estes compostos derivados compreendem os compostos metálicos, bismuto vanádio, irídio, rutênio, gálio, irídio, titânio, germânio e outros (Katsaros & Anagnostopoulou, 2002; Silveira-Lacerda, 2003).

Dentre os agentes antineoplásicos provenientes de metais, os mais promissores são os compostos de rutênio, pelo fato de demonstrarem atividade antimetastática e o câncer metastático ser de difícil controle. A descoberta da propriedade antimetastática representa um importante marco no desenvolvimento de uma nova droga antitumoral (Sava et al., 1999). O conhecimento da progressão dos tumores no estágio de metástase e o aparecimento de tumores secundários são importantes para o desenvolvimento de novas terapias que aproximam dos diagnósticos e do tratamento de tumores malignos (Bergamo & Sava, 2007).

Estudos pré-clinicos com KP1019

(trans-tetraclorobisimidazolrutênio (III)) mostraram atividade promissora no tratamento de tumores do colo-retal (Kapitza et al., 2003; Hartinger et al, 2006). O RM175 [(N6-C6H5C6H5)Ru (en)Cl]+, onde en=etilenodiamina é um composto organometálico de rutênio que possui propriedades citotóxicas para estudos in vitro comparado com a cisplatina (Aird et al., 2002). Outra droga de relevância está sendo estudada por Eric Meggers na Universidade de Pensilvânia, o composto de rutênio indolcarbozol que possui baixos valores de IC5 0 e mimetismo com estauroporinas

(Atilla-Gokcumen et al., 2006). NAMI-A

(trans-imidazoldimetilsulfoxidotetraclororutênio) também possui atividade em tumores sólidos metastáticos, em fase experimental (Sava et al., 2003).

1.4. Compostos de Rutênio e Mecanismo de Ação

Os compostos de rutênio têm sido objetos de grande atenção por terem propriedades antimetastática e de baixa toxicidade. Os

componentes do rutênio parecem penetrar na célula tumoral e ligar efetivamente ao seu DNA (Kostova, 2006).

Existem três propriedades principais do rutênio que fazem com que seus derivados sejam bem apropriados para aplicações biológicas a saber; (1) troca de ligante – os compostos de rutênio Ru (II) e Ru (III) apresentam cinética de troca de ligante similar aos compostos de platina (II), sendo importante para as drogas atingirem o alvo biológico sem serem modificadas; (2) estados de oxidação – o rutênio é o único entre o grupo de metais em que os estados de oxidação são acessíveis em condições fisiológicas, permitindo a administração de compostos de Ru (III) que poderão ser ativados por redução formando compostos de Ru (II) nos tecidos alvos. No sistema biológico, a redução de Ru (IV) e Ru (III) é favorecida pela glutationa, ascorbato e proteínas transportadoras de um único elétron, enquanto que o oxigênio e o citocromo oxidase promovem a oxidação do Ru (II); e (3) mimetizando o ferro - a baixa toxicidade das drogas de rutênio é explicada pela habilidade que este elemento tem de imitar o ferro na ligação a várias biomoléculas, incluindo a transferrina e a albumina. Em mamíferos, estas duas proteínas são responsáveis pela solubilização e transporte de ferro, reduzindo a toxicidade deste metal (Claire & Dayson, 2001; Silveira-Lacerda, 2003).

Quanto aos mecanismos de ação molecular, dentre os compostos de rutênio com atividade antitumoral, o mais bem explorado é o NAMI (Natrans-[Ru (Im) (Me2SO)Cl4]). O complexo de rutênio NAMI, atualmente na fase I de triagem clínica, apresenta atividade antimetastática e é ativo contra uma série de tumores incluindo carcinoma de pulmão, melanoma e câncer mamário (Sava et al., 1992). Segundo Bergamo et al. (1999), NAMI-A apresenta ser mais estável e de maior facilidade de ser sintetizada que NAMI. Trata-se de compostos menos tóxicos em relação à cisplatina, pois não modifica o crescimento celular causando bloqueio no ciclo celular de células tumorais na fase pré-mitótica, ao contrário da cisplatina que reduz a proliferação celular.

Mestroni et al. (1989) sugeriram que cis e trans-RuCl2(DMSO)4

nucleotídeos resultaram na ligação entre rutênio e DNA, que ocorre principalmente no N7 da guanina entre agrupamentos na dupla hélice (Kung et al., 2001).

A redução do Ru (III) para Ru (II) pode ser um mecanismo fundamental da ativação celular por compostos de rutênio (Depenbrock et al., 1997). Os compostos de Ru (III) podem ser reduzidos em áreas tumorais com hipóxia, onde se ligam rapidamente ao DNA e causam danos à biomolécula (Grguric-Sipka et al., 2003).

1.5. Citoxicidade

Definições de citotoxicidade variam, dependendo da natureza do estudo ou simplesmente da indução das alterações metabólicas. Enquanto um agente antitumoral pode ser requerido para destruir a célula, demonstrações da toxicidade de outros fármacos podem requerer análises de mudanças metabólicas ou uma alteração de sinalização célula-célula, que poderia promover um aumento inflamatório ou uma resposta alérgica (Flint, 1998 apud Silveira-Lacerda, 2003).

Testes in vitro são usados na avaliação do potencial de toxicidade ou como parte de uma investigação do mecanismo de identificação prévia na toxicidade in vivo. Nos estágios iniciais de descobertas farmacêuticas, quando o mínimo é conhecido sobre as propriedades de uma nova molécula, simples triagens preditivas são apropriadas. As triagens de toxicidade são usadas para detectarem novas drogas citostáticas antitumorais, e também em outros programas de descobertas de drogas para determinar se a toxicidade é induzida nas concentrações que tenham o efeito farmacológico desejado (Flint, 1998 apud Silveira-Lacerda, 2003).

A descoberta de complexos metálicos a base de rutênio como composto antitumoral tem induzido vários procedimentos de investigações. Silveira-Lacerda (2003), trabalhando com o composto de rutênio cloreto de tetraaminodiclororutênio (III) ou cis-[RuCl2(NH3)4]Cl, verificou que o mesmo apresentava atividade citostática significante, em estudo realizados em células tumorais

humanas e de camundongos. Os resultados indicaram que este composto apresentava atividade citotóxica e genotóxica sobre células tumorais em concentrações de 0,1mg.mL- 1 e o DNA de células tumorais tratadas apresentavam fragmentação do material genético. Esse complexo de rutênio atua como droga citostática ao impedir a progressão do ciclo celular das células tumorais e induzir a apoptose. Observou-se também que a atividade citostática exercida pelo composto de rutênio sobre células mononucleares do sangue periférico humano foi menor quando comparadas à atividade citostática deste composto em outras linhagens tumorais que foram testadas (Silveira-Lacerda, 2003). Verificou-se ainda que a toxicidade do composto foi seletiva às células cancerígenas e com potencial efeito imunoestimulante (Silveira-Lacerda, 2003),

Menezes et al. (2007) também estudou o cloreto de cis-tetraaminodiclorutênio (III) em camundongos Balb/c transplantados via subcutânea na virilha com células do S-180. Os autores constataram que o composto provocou redução do volume e peso tumoral e aumentou a sobrevida dos animais tratados.

1.6. Genotoxicidade

A genotoxicidade é a área da genética que estuda as alterações na base genética da vida, seja ela na estrutura físico-química do DNA, processo este classificado de mutagênese, ou na alteração da determinação genética ao nível celular, classificados respectivamente como carcinogênese e teratogênese. É uma especialidade relativamente recente e se situa na interface entre toxicologia e genética (Silva et al., 2003).

O estudo dos cariótipos é uma das metodologias mais tradicionais em genética humana, utilizada para a detecção de alterações cromossômicas numéricas e estruturais. A análise cromossômica é um procedimento diagnóstico cada vez mais importante em várias áreas da medicina clínica (Thompson & Thompson, 2002). E são baseados na detecção de trocas cromossômicas. Estas trocas, as mutações cromossômicas, são divididas em: aberrações cromossômicas estruturais

como as deleções, duplicações, inversões e translocações, as aberrações cromossômicas numéricas, como as aneuploidias e euploidias e as aberrações cromatídicas, como as quebras cromatídicas, que contribuem para um grande número de abortos, morte pré-natal e nascimento de pessoas com anormalidades estruturais, fisiológicas e mentais (Chandley, 1981; Sankaranarayanan, 1982; Kirsch-Volders et al., 2002).

Estudos citogenéticos constituem um sistema clássico de avaliação de mutagenicidade e clastogenicidade recomendado pelos “guidelines” por sua sensibilidade em responder a agentes indutores de danos no DNA, como quebras e outras alterações. Na obtenção de metáfases para estudo de alterações citogenéticas, um material comumente utilizado são os linfócitos obtidos de sangue periférico e colocados em cultura (Amara-Morkane et al., 1996). Cariótipos obtidos de linfócitos têm sido utilizados na observação de alterações cromossômicas desde que o genoma humano contém um total de 3,2 bilhões de pares de bases distribuídos em 23 pares de cromossomos, e qualquer alteração no DNA pode ser detectada nos cromossomos (Bernadini et al, 2004).

A freqüência de aberrações cromossômicas em linfócitos de sangue periférico humano tem sido usada por décadas como um biomarcador dos efeitos iniciais induzidos pela exposição ocupacional ou por tratamento quimioterápico com carcinógenos, em tecidos específicos. Assumindo-se que os mecanismos de formação dos danos cromossômicos são semelhantes em diferentes tecidos, os níveis de danos em linfócitos podem refletir o nível de danos induzidos em outros tecidos (Norppa et al., 2006). O acúmulo de anormalidades cromossômicas, tais como rearranjos, amplificações e deleções podem afetar genes críticos envolvidos no controle e proliferação, diferenciação e sobrevivência celular e assim direcionar os processos de múltiplas etapas do desenvolvimento e progressão do câncer (Goodison et al., 2005).

Em células somáticas as aberrações cromossômicas, as deleções cromossômicas e rearranjos ou perda total de cromossomos podem levar à eliminação de genes supressores de tumor, resultando em câncer (Phillips, 1987; Minden, 1987; Natarajan, 2002). As quebras que ocorrem na dupla fita de DNA são mais relevantes, pois são mais difíceis de

serem reparadas, podendo constituir, posteriormente, lesões letais ou mutagênicas nos organismos expostos (Collins et al., 1997).

Uma grande variedade de ensaios citogenéticos tem sido usada com sucesso no monitoramento de populações expostas a agentes mutagênicos e as aberrações cromossômicas têm sido de grande importância, por avaliarem a possibilidade da ocorrência de câncer na população (Au et al., 2001). Estes ensaios detectam efeitos de substâncias tóxicas para o genoma. Os mais utilizados são aqueles que detectam mutações em células germinativas ou somáticas, por exemplo, mutação gênica, associada às alterações na seqüência de nucleotídeos do DNA, ou ao nível cromossômico, como aberrações e micronúcleos (Rosa et al., 2007). As células respondem ao seu DNA lesado utilizando diferentes estratégias de ação, tais como morte por citotoxicidade ou apoptose, modulação da expressão gênica controlando o ciclo celular, e reparação do material genético por via livre ou sujeita a erro, sendo a segunda responsável pela fixação das mutações. Normalmente é a combinação destes fatores que compõem a resposta a danos genéticos (Agnoletto et al., 2007).

Testes de aberrações cromossômicas in vitro utilizam células somáticas de mamíferos, e o mais popular são os linfócitos do sangue periférico ou fibroblastos de hamster chinês (Madle & Obe, 1980). A cultura de linfócitos do sangue periférico constitui um ótimo sistema para se testar a capacidade de um agente (físico ou químico), quanto à sua maneira de causar danos no DNA e também ser utilizada no monitoramento de indivíduos expostos (Rabello-Gay et al., 1991). A maioria dos tecidos usados para a análise citogenética não possui um número significativo de mitoses endêmicas, o que impede a análise cromossômica sem o cultivo prévio das células. Desta forma, as técnicas de cultura celulares são fundamentais para a investigação cromossômica (Rainho, 2000).

Recentemente, o ensaio cometa ou teste do "Single cell gel eletrophoresis" (SCGE) vem sendo proposto para estudos de toxicogenética devido a sua peculiaridade e vantagens, quando

comparado a outros testes para detecção de substâncias genotóxicas. O teste cometa é utilizado para detectar danos no DNA, que após serem processadas, podem resultar em mutação (Tice et al., 2000; Rosa et al, 2007; Trzeciak et al., 2008).

Os compostos metálicos baseados em platina e seus derivados, os complexos de rutênio, vêm sendo estudados com interesse por suas características antitumorais. Considerando o DNA como alvo, vários compostos de rutênio foram desenvolvidos e suas propriedades de ligação estão sendo testadas (Clarke et al., 2003; Bergamo & Sava., 2007). As duas propriedades atribuídas ao complexo de rutênio: ativação pela redução e seus transporte seletivo via sistema transferrina pode explicar estas características antitumorais (Claire & Dyson, 2001; Frasca et al., 2001; Timerbaev et al., 2005).

O composto de rutênio, cloreto de cis-tetraamindiclororutênio (III) apresenta grande potencial para o uso clínico por possuir baixa toxicidade, segundo dados das pesquisas que estão sendo realizadas no laboratório de Genética Molecular e Citogenética da Universidade Federal de Goiás. Com este composto tem-se observado baixa toxicidade frente às células mononucleadas de sangue periférico (Silveira-Lacerda, 2003). Isto é devido, em parte, por ter a habilidade de mimetizar o ligamento do ferro com as biomoléculas, explorando o mecanismo que o corpo tem de transporte do ferro de uma forma não tóxica (Claire & Dyson, 2001). Estudos indicam que comparados com outras drogas a base de platina, o rutênio é o mais promissor para o tratamento do câncer.

Em trabalhos anteriores, foi descrito que o composto cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio(III) ou cis-[RuCl2(NH3)4]Cl apresenta atividade citotóxica sobre linhagem tumoral humanas Jurkat e HeLa, com IC5 0 de 190 e 3,5µM, respectivamente (Frasca et al., 2001). Em célula tumoral A-20 de camundongo, a atividade citostática foi observada em concentrações ≥ a 0,1mg.mL- 1 de cis-[RuCl2(NH3)4]Cl (Silveira-Lacerda, 2003). A citotoxicidade destes complexos de rutênio parece estar correlacionada com sua ligação com o DNA, no entanto, o mecanismo de ação destas drogas permanece ainda desconhecido (Menezes et al., 2007). Com os resultados desses trabalhos iniciais, veio a iniciativa de se testar

o mesmo composto frente a células do sangue periférico humano, com objetivo de estudar o efeito genotóxico do mesmo.

Menezes et al. (2005), estudou o mesmo complexo de rutênio e foi observado que esse complexo possui atividade antitumoral sobre a linhagem tumoral Sarcoma 180 de camundongos in vivo e in vitro; o valor encontrado da DL5 0 foi de 99,76mg/kg de animal, relativamente alta comparada às DL5 0 observadas para outros quimioterápicos derivados de metal. De acordo com as análises bioquímica e hematológica do sangue dos animais correlacionadas a histopatologia dos órgãos, o complexo de cis-[RuCl2(NH3)4]Cl não provocou efeito toxicológico grave, não foi genotóxico para células da medula óssea de camundongos, apresentou atividade bactericida sobre Staphylococcus aureus e Escherichia coli, e demonstrou interagir com o DNA plasmidial pUC18.

A morte celular é um processo que leva à degradação de DNA. Todos os métodos de avaliação primária de danos de DNA incluem o ensaio cometa, que tem um potencial para detectar agentes citotóxicos e genotóxicos. Os danos de DNA no ensaio cometa são avaliados no nível de células individuais, permitindo em alguns casos, identificar morte celular ou células que então morrendo. Em condições alcalinas, a necrose ou apoptose celular pode resultar em cometas com pequena cabeça ou com sua inexistência e com grande difusão da cauda (comumente referida como “hedgehogs” - porco-espinho), como observado em estudos in vitro seguido de tratamentos com compostos citotóxicos ou genotóxicos (Olive., 1995; Burlinson., 2007).

Com o desenvolvimento da síntese de compostos de Rutênio para a utilização em várias áreas de pesquisa, inclusive em atividade antitumoral, o composto cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) foi escolhido com o propósito de otimização de metodologias avaliando seu comportamento citotóxico em linhagens tumorais humanas (Jukart e SK-Br-3) e a linhagem tumoral de camundongo (A-20) pelo grupo de pesquisa. Desta forma, viu-se o grande potencial destes compostos a se tornar um novo antineoplásico, havendo assim a necessidade de se estudar a atividade genotóxica deste composto em linhagens de células normais de sangue humano em concentrações diferentes, como um dos testes pré-clínicos estabelecidos pela ANVISA para liberação de novos fármacos no mercado.

Nos sistemas de liberação de novos fármacos no mercado, testes genotóxicos são requisitados para os seus lançamentos. Como o Laboratório de Genética Molecular e Citogenética trabalha com a verificação do potencial de novos fármacos, vê-se a necessidade de implantação e otimização de novas metodologias em nosso laboratório para a triagem desses fármacos frente a atividade genotóxica para o sistema de liberação desses fármacos.

O complexo de rutênio tem sido estudado por possuir propriedades favoráveis contra o câncer e com menor índice de toxicidade comparando com a cisplatina. Consequentemente, é fundamental investigar a probabilidade de danos estruturais causados ao DNA devido a sua exposição ao composto de Ru, uma vez que as drogas usadas no tratamento do câncer atuam nas células normais da mesma forma que atuam, também, em células tumorais do paciente.

3.1. Objetivo Geral

O estudo visa avaliar o potencial do agente antineoplásico, composto rutênio cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III), como indutor de aberrações cromossômicas e fragmentação do DNA mediante a avaliação citogenética de linfócitos do sangue periférico.

3.2. Objetivos Específicos

1.0Analisar a freqüência de aberrações cromossômicas estruturais estáveis em células normais humanas tratadas ou não com o composto de cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) em cultura de