MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Agentes químicos

O composto cloreto de cis-tetraaminodiclororutênio (III) foi sintetizado no Laboratório de Química Supramolecular do Instituto de Química da Universidade Federal de Uberlândia (UFU), seguindo os procedimentos descritos por Marchant (1976) com algumas modificações adaptadas por Pavanin (1989). E posteriormente encaminhado ao Laboratório de Genética Molecular e Citogenética (UFG) para as análises.

O meio RPMI 1640 e o soro fetal bovino foram adquiridos da Gibco® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), a fitohemaglutinina e a colchicina adquiridas da Cultilab. A droga Oncodox® (Cloridrato de doxorrubicina 50mg) foi adquirida da Meizler. Os antibióticos foram adquiridos da Sigma (Aldrich Co St Louis, MO, USA ).

2.2. Droga teste

Para o preparo da droga teste, feita pela UFU, foi pesado cerca de 1g de [RuCl(NH3)5]Cl2 que foi adicionado a 25mL de NH4OH a 33% em NH3, previamente desaerados em argônio, com a mistura sendo refluxada até a dissolução do sólido e o aparecimento de coloração rosada, seguido da adição de 0,7g de ditionato de sódio à solução quente, que foi resfriada em banho de gelo, com a precipitação de sólido creme pela adição de excesso de etanol, havendo a filtração e a lavagem do sólido com éter; o filtrado foi dissolvido em 11,0mL de solução saturada de ácido oxálico sob refluxo até o aparecimento de um sólido amarelo, que foi coletado por filtração e lavado com etanol e éter, com posterior recristalização em HCl5mol.L- 1.

O composto cis-[RuCl2(NH3)4]Cl liofilizado foi pesado e dissolvido em meio RPMI incompleto nas concentrações de 0,001 a 1mg.mL- 1. Posteriormente foi submetido à agitação vigorosa para dissolução completa. O tratamento foi feito após 24 horas de cultura.

2.3. Droga controle

O cloridrato de doxorrubicina é um antibiótico antineoplásico, derivado da antraciclina e usada no tratamento de tumores sólidos (Chabner et al., 1996), originalmente obtido do fungo Streptomyces peucetius var. caesius. A intercalação ao DNA inibe a replicação nucleotídica e pode desencadear a quebra do DNA pela topoisomerase-II, originando distúrbios sérios na estrutura terciária do DNA, levando à formação de quebras duplas e simples da cadeia do DNA e, consequentemente, à morte celular. A capacidade da doxorrubicina (DXR) de se ligar à membrana celular pode afetar uma variedade de funções (Hurley, 2002). A DXR também parece estar envolvida nas reações de oxidação/redução, com a produção de radicais livres altamente reativos e altamente tóxicos (Chabner et al., 1996; Weijl, 1997).

Células tratadas com DXR têm manifestado alterações nas características morfológicas associadas à apoptose, o que pode ser um dos mecanismos de ação da droga. A DXR é ativa durante todo o ciclo celular, inclusive a intérfase (Mizutani et al., 2005). As quebras simples podem ser convertidas para quebras duplas de cadeia durante a replicação do DNA e transcrição do RNA (Robles et al., 1999). A DXR é conhecida comercialmente e clinicamente como andriamicina, apresentando-se como efetivo agente antineoplásico contra uma grande variedade de tumores. No entanto, seu uso clínico, freqüentemente, é limitado devido a indesejáveis efeitos colaterais especialmente a cardiotoxicidade. Quimicamente, a molécula de DXR consiste em um açúcar amino ligado a quatro anéis antraquinona cíclicos. A redução de um elétron do anel leva a formação de um radical livre semiquinona, o qual, na presença de O2, pode formar radicais superóxido (Xu et al., 2001). Os efeitos genotóxicos da DXR foram extensivamente investigados em pacientes submetidos ao tratamento quimioterápico (Boucher et al., 1993), em cultura de linfócitos de doadores saudáveis (Vig, 1971; Antunes & Takahashi, 2007), em linhagens celulares de mamíferos (Antunes et al., 1999) e em

experimento in vivo, utilizando-se células da medula óssea de ratos Wistar (Antunes & Takahashi, 1998, 1999). Os resultados dessas investigações mostram que a DXR é capaz de induzir aberrações cromossômicas do tipo quebras cromatídicas e isocromatídicas, “gaps” cromatídicos e isocromatídicos, rearranjos complexos como trirradiais e quadrirradiais e trocas entre cromátides irmãs. Segundo Albertini et al. (2000), as aberrações cromossômicas resultam de quebras diretas do DNA, replicação de um DNA molde danificado e da inibição da síntese de DNA.

A fórmula estrutural da DXR é C2 7H2 9NO11 e sua estrutura química é mostrada na Figura 01. Devido ser um bom indutor de danos no DNA, a DXR vem sido citada em vários estudos como controle positivo nos ensaios citogenéticos (Antunes et al., 2007).

Figura 1: Fórmula estrutural da Doxorrubicina

Figura 01. Fórmula estrutural da Doxorrubicina.

A droga utilizada neste estudo foi o Oncodox (Cloridrato de doxorrubicina 50mg da Meizler®), solução em pó liofilizado injetável 50mg, obtida comercialmente do laboratório. A droga controle foi dissolvida em meio incompleto a uma concentração final de 0,2µg.ml- 1. 2.4. Cultura de linfócitos

O sangue periférico foi coletado de seis doadores. Sendo eles, três homens e três mulheres entre 20 e 30 anos, saudáveis, sem histórico de doenças recentes, não fumantes e não consumidores de álcool. Os doadores não relataram o uso de medicamentos e não trabalhavam em laboratórios. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Goiás (Nº. 43/2007 – anexo1). O termo de consentimento foi assinado por todos os participantes (Anexo 2). As amostras de sangue periférico foram coletadas por punção venosa com seringas e tubos vacuntainer heparinizados.

A cultura de linfócitos foi realizada com base na metodologia desenvolvida por Moorhead et al. (1960), com algumas modificações. O meio de cultura consistiu em meio RPMI 1640 (80%), soro fetal bovino (20%), fitohemaglutinina (2%) e antibióticos (0,01mg.mL- 1 de penicilina e 0,005mg.mL- 1 de estreptomicina). Os frascos foram incubados por 48 horas em uma estufa, a 37°C e com 5% de CO2 e 95% de umidade.

o . Tratamentos e testes biológicos

Para análise citogenética, o cis-tetraamindiclororutênio foi estudado em quatro concentrações, (0,001, 0,01, 0,1 e 1mg. mL- 1). Com uma seringa estéril descartável, foram coletados cerca de 5 mL de sangue periférico que foram transferidos para um tubo vacuntainer heparinizado. Com uma pipeta Pasteur, retirou-se cerca de 0,5 mL do sangue total e semeou-se em 5 mL de meio de cultura completo + 20% de soro fetal bovino + 2% de fitohemaglutinina A. No total foram utilizados seis réplicas de cultura por doador.

As amostras foram previamente incubadas na estufa por 24 horas quando foram tratadas com as diferentes concentrações do complexo de rutênio. A DXR foi utilizada como controle positivo e para o controle negativo, foi utilizado meio completo (Figura 02).

0 ^{24 48h}

Tratamento das culturas: 1. Controle (sem tratamento). 2. Controle positivo (Doxorrubicina) 0,2µg.mL- 1 3. Tratamento Ru 1 µg.mL-1 4. Tratamento Ru 10 µ g.mL-1 5. Tratamento Ru 100 µg.mL-1 6. Tratamento Ru 1000 µg.mL-1 Coleta das culturas Semeio das células

Figura 02: Delineamento Experimental

o . Estudos citogenéticos

Para obter um número suficiente de metáfases para análise, colchicina foi adicionada 1h e 30m antes de completar 48 horas, em uma concentração de 0,0016%. Após este período as células foram centrifugadas e tratadas com 0,075 M de KCl a 37ºC durante 20 minutos. As células foram centrifugadas e fixadas em solução de ácido acético: metanol (1:3). As lâminas foram preparadas, secadas e colocadas em solução de Giemsa (pH 6,8) por 5 minutos (Moorhead et al., 1960).

As lâminas foram analisadas sob microscópia óptica (Olympus) e objetiva de imersão de 100x, visando o encontro de metáfases de células tratadas com o complexo de rutênio e seus respectivos controles positivo e negativo. As freqüências das aberrações cromossômicas (AC) foram determinadas meliante a análise de 100 metáfases por tratamento e o índice mitótico (IM) determinado pelo número de metáfases em 5000 linfócitos contados.

o . Ensaio cometa

A versão alcalina do ensaio cometa (single-cell gel electroforesis) foi seguida de acordo com Singh et al. (1988), com pequenas modificações.

O sangue periférico foi coletado em tubos heparinizado de um doador normal, saudável, com idade entre 20 e 30 anos, com histórico de não fumante, não etilista e sem o uso de medicação.

Os linfócitos do sangue periférico foram isolados e incubados por 24 horas e depois foram tratados com concentrações diferentes do cloreto de cis-tetraamindiclororutênio (III), controle positivo (Doxorrubicina) e negativo, por mais 24 horas e então homogeneizados e misturados em agarose low-melting (baixa fusão) e imediatamente colocada em uma lâmina que já continha uma camada de gel de agarose a 1%. A lâmina com as duas camadas de agarose foi colocada a 4°C por 5 minutos. Após foram incubadas em uma solução de lise (2,5M NaCl, 10mM Tris, 100mM EDTA, 1% Triton X-100 and 10% DMSO, pH10,0) e colocada a 4°C por duas horas para remover proteínas e membranas. Posteriormente, as lâminas foram colocadas na eletroforese com tampão (300mM NaOH, 1mM EDTA, pH > 13,0). A corrida de eletroforese foi por 20 minutos, a 0,9 V/cm, 300 mA e a 4°C. Todo o procedimento foi feito no escuro ou sob luz amarela para prevenir danos no DNA. As lâminas foram mergulhadas em solução de neutralização (0,4M Tris, pH 7,5), lavada com água destilada e secadas a temperatura ambiente (Figura 03).

Preparação de lâminas

DNA

Detecção de quebras de fitas de DNA

As lâminas foram preparadas em duplicatas e 100 núcleos analisados (50 núcleos para cada duplicata) utilizando microscópio de fluorescência (Zeiss) equipado com filtro de excitação de 515-560nm, um filtro de barreira de 590nm, e objetiva de 40x. O teste foi realizado no laboratório Lagene e no Núcleo de pesquisa Replicon, da Universidade Católica de Goiás.

Os núcleos sem danos no DNA apareceram intactos e sem cauda. Os cometas foram classificados pelo software CometScore 15, em classes: ausência de cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça (classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da cabeça (classe 2): cauda maior que duas vezes o diâmetro da cabeça (classe 3) e sem cabeça (classe 4) (Figura 04). As recomendações para o ensaio cometa consideram tanto avaliações visuais quanto as avaliações usando software (Burlinson et al., 2007). O total da contagem dos danos foi de 100 por amostra, perfazendo um total de 500 núcleos (desde a classificação 0-sem danos até 4 danos totais).

Figura 04: Classificação de leitura para o Ensaio Cometa: ausência de

cauda, ou seja, sem dano (classe 0); cauda menor do que o diâmetro da cabeça, muito pouco dano (classe 1); cauda até duas vezes o diâmetro da cabeça, pouco dano (classe 2): cauda maior que duas vezes o diâmetro da cabeça, alto dano (classe 3) e sem cabeça, dano máximo (classe 4).

o . Estudos estatísticos

As análises estatísticas dos ensaios citogenéticos (IM e EC) foram feitas empregando o teste ANOVA com comparações múltiplas pelo teste Tukey. Nível para significância de p foi estabelecido para 5%. Para as aberrações cromossômicas a análise foi descritiva.