Neste trabalho foram estudados três sistemas proteícos distintos, a Lisozima, a Crioglobulina e o Proteassomo. Por se tratar de sistemas biológicos diferentes, as seções serão subdivididas, para que a abordagem de cada sistema Ąque mais clara. Inicialmente, é necessário uma discussão geral sobre propriedades estruturais de proteínas.
Proteínas são constituídas por combinações de 20 aminoácidos (Ągura 4) diferentes suscitando a formação de estruturas diversas. Esses aminoácidos têm uma característica estrutural comum, pois têm um grupo carboxila e um grupo amino ligados ao mesmo
átomo de carbono, diferindo-se entre si pela cadeia lateral (ou grupo R) (Ągura 5), a qual varia em estrutura, tamanho e carga elétrica que inĆuenciam a solubilidade do aminoácido na água [17].
Figura 4: Os 20 aminoácidos formadores de proteínas (Retirada
de:http://educacao.globo.com/quimica/assunto/quimica-organica/proteinas-aminoacidos-e- enzimas.html)
Para formar as diversas sequências de proteínas, cada aminoácido une-se a seu vizinho através da ligação peptídica, uma ligação covalente, como representado na Ągura 6 [17].
Figura 5: Estrutura Geral dos Aminoácidos
Figura 6: Representação da ligação peptídica (Retirado de:
www.phschool.com/science/biolog_place/biocoach/translation/pepb.html)
Outras ligações ocorrem entre o restante da cadeia carbonada dos aminoácidos, como por exemplo, ligações covalentes entre os grupamentos -SH de dois aminoácidos cisteína, formando uma ponte dissulfeto, ou ligações de hidrogênio entre grupamentos polares da cadeia carbonada, ou até ligações fracas do tipo de van der Waals, mas que garantem estabilidade e conformação tridimensional única às proteínas, relacionada di- retamente com sua função [17]. Comumente são deĄnidos quatro níveis de estrutura de uma proteína: estrutura primária, a sequência de aminoácidos que forma a cadeia poli- peptídica através das ligações covalentes; estrutura secundária, resultante de ligações de
Hidrôgenio entre aminoácidos distintos; estrutura terciária, o arranjo tridimensional, ou seja, o dobramento tridimensional de um polipeptídio; estrutura quaternária, quando uma proteína possuí duas ou mais subunidades polipeptidicas, ou seja, a formação de dímeros, trímeros, etc. Uma representação dessas estruturas pode ser visto na Ągura 7 [17].
Figura 7: Representação dos níveis de estrutura de uma proteína (Adaptada de: http://lucindamorais.blogspot.com.br/p/proteinas-estrutura-e-funcao.html).
1.3.1 Lisozima
A Lisozima, descoberta em 1922 pelo médico escocês Alexander Fleming, é uma proteína pequena, de ≈ 14��� (129 resíduos) e teve sua estrutura tridimensional deĄnida em 1965 por David Chilton e colaboradores. Trata-se de uma molécula estável, responsável por proteger o organismo contra infecções bacterianas [17].
A sequência da Lisozima e sua estrutura secundária são representadas na Ągura 8.
A predição usando bioinformática da estrutura secundária é gerada pelo programa PSIPRED [13], em que é necessário fornecer a sequência da proteína (estrutura primária) para o cálculo da estrutura secundária.
Figura 8: Sequência primária e predição da estrutura secundária da Lisozima [6] [13].
Na Ągura 9 tem-se sua estrutura terciária no formato de cartoon, o que evidencia a estrutura secundária.
Por se tratar de uma proteína amplamente estudada na literatura, ser estável e ter a estrutura tridimensional resolvida, pode ser utilizada como um sistema modelo para o aprendizado e teste dos programas de análise de SAXS. Para tanto, variou-se a concentração de Lisozima em duas soluções salinas diferentes, a Ąm de observar os possíveis efeitos de concentração no sistema.
1.3.2 Crioglobulinas
As crioglobulinas são proteínas do tipo imunoglobulinas (Ig), ou seja, estão re- lacionadas ao sistema imunológico e portanto atacam proteínas estranhas ao corpo, os
Figura 9: Representação da estrutura cristalográĄca da Lisozima em cartoon, entrada no PDB: 2LYZ[6]
antígenos, realizando assim a defesa do organismo. A Ągura 10, ilustra um modelo de interação entre antígeno e anticorpo [17].
As crioglobulinas, normalmente, à temperatura abaixo de 37◇
�, quando em con-
centrações acima do valor considerado de referência, 80Ûg/mL [3], podem aglomerar e precipitar, causando danos em vasos de pequeno e médio calibre, resultando em infec- ções, doenças autoimunes e desordens neoplásicas. No entanto, trata-se de um processo reversível, torna-se solúvel ao aquecermos o criopreciptado [3] [5].
São classiĄcadas em três tipos: tipo I, formada apenas por imunoglobulinas mono- clonais; tipo II, formada por uma mistura de imunoglobulinas monoclonais e policlonais; tipo III, formada por uma mistura de imunoglobulinas policlonais. As imunoglobulinas monoclonais são sintetizadas por uma população de células B idênticas, já as policlo-
Figura 10: Modelo antígeno-anticorpo (Adaptada de:http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:Antibody.svg).
nais são produzidas por linfócitos B diferentes, o que corresponde respectivamente a um anticorpo homogêneo e a uma mistura de anticorpos [3].
Além disso, existem cinco classes de imunoglobulina, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Os diferentes tipos se diferenciam por suas propriedades biológicas, localizações funcionais e habilidade para lidar com diferentes antígenos. A IgA é encontrada principalmente em secreções, prevenindo as mucosas de colonização por patógenos; a IgD é produzida nas células B, mas sua função ainda não é suĄcientemente clara; a IgE tem um papel importante na atuação com alérgenos; a IgG é uma das proteínas mais abundantes no soro sanguíneo e proporcionam a principal imunidade contra os patógenos que invadem o corpo;a IgM é o anticorpo produzido primeiro quando o organismo precisa reagir contra um antígeno[17].
Os mecanismos que levam a agregação dessas proteínas não são bem deĄnidos. Na literatura, encontra-se indícios de que estudos de propriedades química e termodinâmica sugerem que forças eletrostática e de dispersão são responsáveis pela insolubilidade da crioglobulina[5]. Portanto, estudos variando a concentração de sais, como por exemplo de íons cloro, na solução podem regular o processo de agregação. Esses estudos foram reali- zados utilizando, principalmente, técnicas de Ćuorescência e de espalhamento dinâmico de luz. Estudos utilizando a técnica de SAXS são pouco descritos na literatura. Essa técnica, que nos permite estudar a proteína em solução, em condições próximas à Ąsiológica, pode ser utilizada para estudarmos as possíveis mudanças na conformação da crioglobulina, o que permite explorar os mecanismos que levam à agregação.
Entender o mecanismo de agregação pode auxiliar na busca de novas propostas de tratamento de pacientes com crioglobulemia.
1.3.3 Proteassomo
O processo de proteólise (degradação de proteínas) intracelular é tido como um me- canismo de regulação da homeostase celular tão importante quanto expressão gênica[32]. O proteassomo é um complexo proteolítico responsável pela degradação de proteí- nas previamente marcadas para degradação por uma cauda de poli-ubiquitina. As proteí- nas intracelulares poli-ubiquitináveis estão envolvidas na regulação do ciclo e sinalização celular. Esse sistema de degradação de proteínas intracelulares é altamente conservado ao longo da escala evolutiva em todos os organismos eucarióticos: da levedura (eucarioto unicelular) aos seres humanos [14].
O proteassomo, esquematicamente mostrado na Ągura 11 consiste de uma unidade catalítica central denominada 20S (PT 20S), onde se localizam os sítios que possuem
Figura 11: Representação do proteassomo (Adaptado de [11])
No entanto, a unidade catalítica (PT 20S) é capaz de degradar proteínas não marcadas por cauda de poli-ubiquitina, como no caso de proteínas oxidadas. As células possuem aproximadamente 1/3 do proteassomo destituído de unidades regulatórias, ou seja, apenas a unidade catalítica 20S.
A remoção de proteínas oxidadas pelo 20S PT é considerada defesa antioxidante, uma vez que, proteínas não são reparadas após dano oxidativo como no caso de nucleo- tídeos (DNA, RNA) e lipídeos. Proteínas oxidadas têm tendência à agregação (fenômeno
que subjaz patologias neurodegenerativas humanas), sendo assim elas devem ser eĄcaz- mente removidas por processo de degradação.
O PT 20S é constituído por uma unidade central formada por dois anéis heptamé- ricos denominados de Ñ, Ćanqueados por outros dois denominados Ð. Os sítios catalíticos se localizam nos anéis Ñ sendo que os Ð regulam a abertura / fechamento da câmera ca- talítica. Portanto, os anéis Ð controlam a entrada de substratos no PT 20S. O PT 20S em sua forma dita latente apresenta-se fechado impedindo a entrada de proteínas. No entanto, existem formas intracelulares abertas do PT 20S. Ou a abertura ocorre pelo acoplamento de unidades regulatórias 19S, ou, no caso do PT 20S destituído de unidades regulatórias, por processos de modiĄcação pós-traducionais ainda pouco explorados. Em trabalho re- cente [24], foi demonstrado que um dos mecanismos de abertura da câmera catalítica é a oxidação de resíduos de cisteína (Cys) do PT 20S. Nesse estudo, além da demonstra- ção da modiĄcação dos resíduos de Cys por espectrometria de massas, foi demonstrada, a modiĄcação estrutural, a abertura da câmera, por técnicas de Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e SAXS. Técnicas para a análise estrutural do PT 20S descritas até o momento se restringem à cristalograĄa seguida de difração de Raios X, microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de força atômica. Da Ągura 13 a 26 tem-se a representação da estrutura secudánria, das 28 subunidades que compõe o Proteassomo 20S. Para a predição da estrutura secundária utilizou-se o program PSIPRED [13], e a legenda da representação dessa estrutura pode ser vista na Ągura 12. Na Ągura 27, tem-se a estrutura terciária no formato de cartoon, o que evidencia a estrutura secundária.
A resolução estrutural 3D do proteassomo, PT 20S, tem grande importância para a melhor compreensão de seu mecanismo de ação na degradação de proteínas, principal- mente as oxidadas. Trata-se de um passo importante para a compreensão de sua interação
Figura 26: Predição da estrutura secundária das subunidades 27 e 28 do proteassomo 20S [13]
Figura 27: Vista superior e vista lateral da representação da estrutura tridimensional do proteassomo. Entrada no PDB:3d29 [12].