Isolamento dos metabólitos secundários de C depauperata

A fração CH2Cl2 (24,1 g), resultante da extração líquido-líquido do extrato etanólico das raízes de C. depauperata, codificada como EECDD, foi misturada a 39,3 g de gel de sílica, pulverizada em gral de porcelana e submetida a fracionamento cromatográfico sobre 55,8 g de gel de sílica em uma coluna de 1000 mL. A eluição foi realizada com os solventes hexano, AcOEt e MeOH, puros ou em misturas binárias, conforme a Tabela 47, pág.170. Foram obtidas 47 frações de 50 mL, que após análise em CCD foram reunidas conforme seus Rfs, resultando em sete blocos de frações: Fr:1/3 (I), Fr:4/11 (II), Fr:12/21 (III), Fr:22/28 (IV), Fr: 29/37 (V), Fr:38/43 (VI) e Fr:44/47 (VII), ver Fluxograma 02, pág 177.

Tabela 47. Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de EECDD.o d EECCA

Eluente Concentração Fração

Hexano/AcOEt 8:2 1/10 Hexano/AcOEt 6:4 11/17 Hexano/AcOEt 4:6 18/25 Hexano/AcOEt 2:8 26/31 AcOEt 100 32/35 MeOH 100 36/45

Capítulo 4-Parte Experimental

A fração III (5,4 g), resultante do fracionamento cromatográfico da fração CH2Cl2 (EECDD, Fluxograma 02, pág. 175), foi misturada a 6,0 g de gel de sílica

“flash”, pulverizadas em gral de porcelana e submetidas a fracionamento cromatográfico sobre 9γ,0 g de gel de sílica “flash”, em uma coluna de 500 mL. A

coluna foi empacotada e eluída com uma mistura de CH2Cl2/AcOEt (6:4), deste procedimento foram obtidas 86 frações de 10 mL, as quais foram reunidas após análise

em CCD. A fração Frμγ6/6β (β,7 g) foi misturada a γ,4 g de gel de sílica “flash” e cromatografada sobre 11β,0 g de gel de sílica “flash”, em coluna de 500 mL. A coluna

foi empacotada e eluída com CH2Cl2/AcOEt (8:2), e foram obtidas 80 frações de 10 mL, que foram reunidas conforme seus Rfs após análise em CCD. A fração Fr:45/68 (763,1

mg) foi misturada a 1,β g de gel de sílica “flash” e cromatografada sobre 93,9 g de gel de sílica “flash”, em uma coluna de β50 mL. A coluna foi empacotada e eluida com

CH2Cl2/Isopropanol (98:2), deste procedimento foram coletadas 63 frações de 10 mL, reunidas após análise por CCD. As Frações Fr:47/57 (209,1 mg) foi novamente

submetidas a fracionamento cromatográfico utilizando gel de sílica “flash”, sendo misturada a 416,7 mg de gel de sílica “flash” e acondicionada sobre 55,4 g de gel de sílica “flash”. A eluição foi realizada com hexano/AcOEt (7μγ), foram obtidas 60

frações de 8 mL, das quais as frações 45/57, reunidas de acordo com seus Rfs após monitoramento por CCD, resultaram em 51 mg de um composto isolado sob a forma de um sólido branco, codificado de CD-1. Sua determinação estrutural encontra-se na págs.120.

A fração IV (4,4 g), resultante do fracionamento cromatográfico da fração CH2Cl2 (EECDD, Fluxograma 02, pág. 175), foi misturada a 6,2 g de gel de sílica

“flash” e pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 94,1 g de gel de sílica “flash”, em uma coluna de 500 mL. A coluna foi empacotada e eluida com

CH2Cl2/AcOEt (6:4), foram coletadas 81 frações de 10 mL, reunidas conforme seus Rfs após monitoramento por CCD. A fração 59/81 (1,0 g), ver Tabela 48, pág. 171, foi

submetida a uma cromatografia em sílica “flash” com CH2Cl2/Isopropanol-94:6. Foram coletadas 46 frações de 8 mL, reunidas após análise em CCD. As frações Fr:25/46 (1,18 g) foram submetidas a uma coluna em Sephadex LH-20, utilizando uma mistura ternária dos solventes hexano/CH2Cl2/MeOH (1:1:1), deste procedimento foram coletadas 80 frações de 8 mL, reunidas conforme seus Rfs após monitoramento por CCD. As frações Fr:42/47 (206,2 mg) foram submetidas a uma nova coluna em Sephadex LH-20,

Capítulo 4-Parte Experimental

processo foram obtidas 40 frações que após análise por CCD foram reunidas de acordo com seus Rf. As frações Fr:12/22 (64,3 mg) foram misturadas a 120,3 mg de gel sílica

“flash” e acondicionadas sobre γ4,γ g de gel de sílica “flash”, em uma coluna de 250

mL. A coluna foi empacotada e eluída com CH2Cl2/AcOEt (1:1), AcOEt e MeOH, foram coletadas 56 frações de 8 mL. As frações Fr:39/54, resultante da eluição com AcOEt, após análise em CCD, foram reunidas resultando em 14,3 mg de um sólido branco, codificado de CD-2, cuja determinação estrutural encontra-se na pág. 150, respectivamente. As frações Fr:48/54 (236,7 mg), resultantes do Sephadex LH-20 da Fr:25/46, foram submetidas a uma coluna em Sephadex LH-20, utilizando uma mistura ternária dos solventes hexano/CH2Cl2/MeOH (1:1:1), foram coletadas 36 frações que após análise em CCD foram reunidas. As frações 18/32 (181,5 mg) foram misturadas a

β15,6 mg de gel de sílica “flash” pulverizada em gral de porcelana e acondicionada

sobre 34,0 g de gel de sílica “flash”. A eluição foi realizada com a mistura binária dos solventes CH2Cl2/Isopropanol (98:2) com a adição de 4 gotas de ácido acético para cada 10 mL de solução, deste procedimento foram coletadas 66 frações de 10 mL. As frações Fr:52/65 (157,8 mg) foram misturadas a β41,1 mg de gel de sílica “flash” e

acondicionada sobre γ4,γ g de gel de sílica “flash”, a eluição foi realizada com a

mistura binária dos solventes CH2Cl2/Isopropanol (96:4) com a adição de 4 gotas de ácido acético para cada 10 mL de solução. Foram coletadas 59 frações de 8 mL, reunidas após monitoramento em CCD. As frações Fr:29/40 (11,7 mg) foram reunidas com as frações Fr: 45/51 (22,1 mg), resultantes do fracionamento de Fr:18/32 descrito anteriormente, e submetidas a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), em uma coluna semi-preparativa C-18 fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 250 x 10 mm (5

ηm), e eluídas com H2O/ACN (1:1) em um tempo de corrida de dez minutos, com fluxo de 4,5 mL/min e volume de injeção de 200 µL. Os picos correspondentes aos tempos de retenção de 5,55 e 7,72 min (Fig. 147, pág. 172) foram coletados, resultando no isolamento de CD-3 e CD-4, respectivamente, cujas determinações estruturais encontram-se nas págs.135 e 128.

Capítulo 4-Parte Experimental

Figura 147. Cromatograma obtido a partir de Fr29/40 e Fr:45/51.

Tabela 48. Dados referentes ao fracionamento cromatográfico das frações IV.ECCA

Eluente Concentração Fração

CH2Cl2/AcOEt 6:4 1/8

CH2Cl2/AcOEt 8:2 9/27

CH2Cl2/AcOEt 1:1 28/40

AcOEt 2:8 41/58

MeOH 100 59/81**

** Frações contendp as substâncias CD-2, CD-3 e CD-4

A fração V (3,4 g), resultantes do fracionamento cromatográfico do EECDD (Fluxograma 02, pág. 175), foi misturada a 7,0 g de gel de sílica e acondicionada sobre 54,7 g de gel de sílica, em uma coluna de 1000 mL. A eluição foi realizada com hexano, AcOEt e MeOH, puros ou em misturas binárias, conforme descritos na Tabela 49, pág. 174. foram coletadas 94 frações de 10 mL, as quais foram reunidas após monitoramento por CCD. As fração Fr:41/93 (2,6 g) foram misturadas a 3,6 g de gel de sílica e acondicionadas sobre 51,7 g de gel de sílica em uma coluna de 1000 mL. A eluição foi realizada com CH2Cl2/AcOEt (1:1), CH2Cl2/AcOEt (6:4), CH2Cl2/AcOEt (2:8), AcOEt e MeOH, foram obtidas 96 frações de 8 mL, que após análise por CCD foram reunidas.

As frações Frμ10/β1 (180,5 mg) foi misturada a γ74,9 mg de gel de sílica “flash”, acondicionada sobre γ4,7 g de gel de sílica “flash” e empacotada e eluída com

CH2Cl2/Isopropanol (96:4). Foram coletadas 70 frações de aproximadamente 8 mL, as quais foram reunidas após monitoramento por CCD. As frações 13/21 (13,1 mg) foram cromatografadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE), em uma coluna semi-preparativa C-18 fase reversa (Gemini®, Phenomenex) 250 x 10 mm (5 ηm), e

Capítulo 4-Parte Experimental

eluídas com H2O/ACN (1:1) em um tempo de corrida de dez minutos, com fluxo de 4,5 mL/min e volume de injeção de 200 µL. O pico correspondente ao tempo de retenção de 6,71 min (Figura 155, pág. 176) foi coletado e resultou no isolamento de CD-5 (3,3 mg), cuja determinação estrutural encontra-se na pág. 96. As frações Fr:33/62 (353,3 mg), resultantes do fracionamento de Fr:10/21, foram misturadas a 678,5 mg de gel de

sílica “flash”, acondicionada sobre β9,γ g de gel de sílica “flash” e eluída com

CH2Cl2/AcOEt/Isopropanol (70:28:2), deste procedimento foram coletadas 52 frações de 5 mL, reunidas após monitoramento por CCD. As frações Fr:17/31 (130,1 mg) foram

novamente misturadas a γ18,γ mg de gel de sílica “flash” e cromatografada sobre 17,7 g de gel de sílica “flash”. Foram coletadas 50 frações de 5 mL, monitoradas e reunidas

por CCD, as frações Fr:8/19 (75,1 mg) foram cromatografadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE), em uma coluna semi-preparativa C-18 fase reversa (Gemini®,

Phenomenex) 250 x 10 mm (5 ηm), e eluídas com H2O/ACN-6:4 em um tempo de corrida de dez minutos, com fluxo de 4,5 mL/min e volume de injeção de 200 µL. O pico correspondente ao tempo de retenção de 4,54 min (Figura 155, pág. 176) foi coletado e resultou no isolamento de CD-6 (7,6 mg), cuja determinação estrutural encontra-se na pág. 103. As frações Fr:52/92 (923,3 mg), resultante do fracionamento cromatográfico de Fr:41/93 descrito anteriomente, foi submetida a uma coluna em Sephadex LH-20 utilizando uma mistura ternária dos solventes hexano/CH2Cl2/MeOH (1:1:1). Foram coletadas 78 frações de 5 mL, reunidas após análise em CCD conforme seus Rfs. As frações Fr:66/69 (31,8 mg) foram misturadas a 87,8 mg de gel de sílica

“flash” e acondicionadas sobre 17,8 g de gel de sílica “flash”, a eluição foi realizada

com CH2Cl2/AcOEt (1:1). Foram coletadas 77 frações de 5 mL, as quais foram reunidas após análise em CCD. As frações Fr:18/55 (19,9 mg) apresentaram-se na forma de um sólido amarelo e foi codificada de CD-7, cuja determinação estrutural encontra-se na pág. 111, respectivamente. As frações Fr:93/96 (858,1 mg), resultantes do fracionamento cromatográfico de Fr:41/93, foi submetida a uma coluna em Sephadex LH-20 utilizando uma mistura ternária dos solventes hexano/CH2Cl2/MeOH (1:1:1), deste procedimento foram coletadas 50 frações de 5 mL. As frações Fr:29/32 (52,6 mg)

foram misturadas a 1β9,0 mg de gel de sílica “flash” e acondicionada sobre 17,β g de gel de sílica “flash”, a coluna foi empacotada e eluida com uma mistura binária dos

solventes CH2Cl2/AcOEt (2:8). Foram coletadas 52 frações de 5 mL, as frações 28/52 foram reunidas após análise por CCD e resultaram no isolamento de 16,3 mg de um metabólito denominado de CD-8, cuja determinação estrutural encontra-se na pág. 143.

Capítulo 4-Parte Experimental

Tabela 49. Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de Fr:V.CA

Eluente Concentração Fração

Hexano/AcOEt 1:1 1/16

Hexano/AcOEt 3:7 17/43

AcOEt 100 44/75*

MeOH 100 76/94*

* Frações contendo as substâncias CD-5, CD-6, CD-7 e CD-8

Capítulo 4-Parte Experimental

Fluxograma 02. Isolamento dos constituintes químicos obtidos do extrato etanólico das