suas folhas, uma vez que as frações solúvel e insolúvel deste tecido apresentaram atividade larvicida separadamente. Visto que proteínas, em geral, são solúveis em água e, metabólitos secundários, geralmente são solúveis em solventes orgânicos.
O processo de purificação de uma proteína tóxica do extrato aquoso da planta P. quadrangulare iniciou-se com uma precipitação protéica utlilizando acetona 80%, a fim de concentrar a proteína tóxica, visto que as folhas desta planta tem baixa concentração protéica (1 mg/mL). Este procedimento foi importante também para eliminar parte do alto teor de pigmentos presentes neste extrato e que interferiam nas dosagens protéicas e nas etapas de purificação.
As proteínas precipitadas com acetona foram inicialmente aplicadas a uma coluna de troca iônica (DEAE-Sepharose). A proteína tóxica não ficou retida a esta resina. Como uma alternativa para melhorar a purificação, utilizou-se uma outra resina de troca iônica (CM-Sepharose). Obteve-se dois picos retidos em que o primeiro pico apresentava a atividade larvicida. Este passo cromatográfico foi repetido outras vezes para verificar sua reprodutibilidade e acumular material para as etapas seguintes de purificação e verificou-se que nem sempre o segundo pico retido era observado. Como boa parte da amostra obtida (primeiro pico retido) era usado para verificar a atividade larvicida, não sobrava material suficiente para prosseguir as etapas de purificação.
Devido às da dificuldade encontradas para purificar a proteína tóxica, utilizou-se metodologia de purificação mais eficiente tais como os sistemas FPLC e HPLC. As amostras de proteínas (50 mg) de P. quadrangulare foram, desta vez, aplicadas em coluna HiTrap Q sistema FPLC. Esta cromatografia foi repetida 5 vezes e mostrou-se reprodutível em que três picos retidos foram eluidos com um gradiente contínuo de NaCl. O segundo pico retido continha a proteína tóxica de massa molecular de cerca de 20 kDa. O reconhecimento da atividade larvicida desta proteína será discutida mais abaixo.
O segundo pico retido da cromatografia em coluna Hitrap Q foi aplicado em uma coluna C8 (sistema HPLC). Foram obtidos seis picos de proteína sendo que o pico 4 continha a proteína tóxica (20 kDa) e uma outra banda menor que, possivelmente, foi originado pela degradação da proteína tóxica. Pelas análises
eletroforéticas, constatou-se que o extrato aquoso de P. quadrangulare, apesar de sua baixa concentração protéica, é pouco complexo, apresentando seis bandas de proteína majoritárias. Desta forma, resolveu-se usar a estratégia de cortar e eluir estas bandas do gel de uma eletroforose semi-desnaturante, concentrá-las por precipitação com acetona e verificar qual delas apresentaria atividade larvicida. De todas, somente a banda protéica com massa molecular próxima a 20 kDa mostrou-se letal para as larvas do mosquito. Esta estratégia mostrou-se, também, como uma alternativa de purificação desta proteína. A análise por cromatografia em coluna de fase reversa (C18), mostrou que a banda eluída do gel foi obtida em um pico único. A seqüência N-terminal da proteína deste pico (Ala-Pro-Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-X-Pro-Pro) foi comparada com outras sequências já depositadas em bancos de dados e não apresentou similaridade com nenhuma outra proteína. A massa molecular (cerca de 20 kDa) e a presença de seis prolinas nesta região sugerem que esta proteína possa ser um inibidor de uma alfa-amilase (Profa.
Aparecida Tanaka, UNIFESP, comunicação pessoal). Contudo novos estudos devem ser realizados para se saber a real natureza desta proteína.
Foram necessários a realização de oito eletroforeses com géis de poço único para acumular uma massa de proteína tóxica suficiente para a obtenção das curvas de dosagem letal. A DL50 calculada foi de 6,77 ppm.
Proteínas tóxicas contra mosquitos são sintetizadas pela bactéria Bacillus thuringiensis. Esta bactéria entomopatogênica é o mais importante bioinseticida vendido no mundo (Poopathi e Tyagi, 2006). A atividade larvicida se dá pelo efeito sinérgico de 4 proteínas tóxicas principais que atuam amplificando o efeito larvicida, tornando-o mais efetivo, além de diminuir a probabilidade de resistência.
Estas proteínas possuem valores de DL50 bastante baixos variando de 0,04 ppm a 0,135 ppm (Tabashnik, 1992).
A vantagem de se utilizar proteínas com atividade tóxica, para o controle de larvas de mosquito, é a possibilidade de utilização de seus genes para transformar geneticamente bactérias comumente presentes em ambientes aquáticos nos quais as larvas de mosquito se desenvolvem. Relatos deste tipo de abordagem já estão presentes na literatura científica (Stevens et al. 1994; Khasdan et. al., 2003;).
Um fato interessante que acontece com esta proteína (P. quadrangulare) é que, quando ela é eluída de um gel e reaplicada em um outro, seja em condições desnaturantes ou semi-desnaturantes, ela não é visualizada com uma banda protéica única. Proteínas com massas moleculares acima e abaixo da mesma são visualizadas. Pode-se concluir, então, que dois fenômenos provavelmente estão ocorrendo com esta proteína: agregação e degradação.
Para um controle mais eficiente das populações de mosquitos vetores a Organização Mundial de Saúde recomenda o uso de diferentes inseticidas associados, ou a rotação deles, como medida preventiva para evitar o desenvolvimento de resistência nos mosquitos (Andrade e Modolo, 1991), fato que tem sido observado com o uso continuado dos organofosforados (Ministério da saúde, 2002; Lima et. al., 2003) que, no Brasil, foi substituído pelo Bti que está sendo amplamente utilizado pelos órgão governamentais para o controle das larvas de A. aegypti ( Lima et al 2003 ). Apesar de sua resistência ainda não ter sido observada em condições de campo, resistência ao Bti tem sido induzida em laboratório ( Saleh et. al., 2003). Com isso faz-se necessário a busca por novas substâncias tóxicas para os mosquitos, para serem usadas juntamente com as já disponíveis ou em sistema de rodízio, minimizando a seleção de populações de mosquitos resistentes.
As folhas de P. quadrangulare, além de apresentarem uma proteína tóxica contra larvas de A. aegypti, possuem também uma atividade tóxica solúvel em uma solução de metanol/água. A DL50 calculada foi de 92 ppm. Esta dosagem letal está dentro dos valores obtidos para extratos orgânicos, obtidos de outras espécies de plantas, quando foram testados contra larvas de A. aegypti. Estes valores variam em uma escala bastante ampla, de unidades, dezenas e centenas de ppm, conforme é mostrado por Shaalan et al. (2005).
A fração solúvel em água do homogenato do líquen T. flavicans foi testado contra a larva de A. aegypti e não se mostrou ativo, ao contrário da fração insolúvel, que promoveu 100% de mortalidade larval. Decidiu-se, então, preparar um extrato usando metanol como solvente. Este solvente foi bastante eficiente na extração do metabólito tóxico deste líquen porque causou 100% de letalidade.
O extrato metanólico de T. flavicans foi fracionado com solventes de diferentes polaridades. A fração de diclorometano, mais abundante e com alta atividade larvicida, foi submetida à purificação em colunas de sílica gel. A fração purificada ativa obtida destas cromatografias foi analisada por cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massa e RMN 1H e 13C resultando na determinação da estrutura e identificação do metabólito secundário. Este metabólito já tinha sido previamente descrito, a caloploicina, por Yosioka e colaboradores em 1973. Entretanto não há registro na literatura a respeito de sua atividade biológica.
A partir da curva de mortalidade larval, em relação à concentrações crescentes de caloploicina, obteve-se o valor de DL50 de 2 ppm. Este valor é condizente com os valores de DL50 encontrados na literatura com outros metabólitos secundários isolados. Por exemplo, Goniotalamina, um metabolito secundário extraído da planta Bryonopsis laciniosa, possui DL50 de 21.5 ppm quando testado contra larvas de Culex quinquefasciatus (Kabir, et al 2003). O ácido tânico é eficaz em matar as larvas de A. aegypti e Cx quinquefasciatus com o valor de DL50 de 13 ppm (Rey et. al. 2001). Segundo Evans e Raj (1991), quassina, o metabólito extraído de Quassina amara mata larvas de Cx.
quinquefasciatus com DL50 de 6 ppm. Por sua vez, Pellitorina, extraída de frutos de Piper longum, possui DL50 de 0.92 ppm quando testado contra as larvas de A.
aegypti. O valor de DL50 de 23 ppm utilizando rotenona comercial, um conhecido inseticida ( Greenhalgh, 1986 ), nas mesmas condições utilizada para a caloploicina, mostra que este metabólito tem grande potencial para utilização como larvicida. O LT50 encontrado para caloploicina foi de 67 minutos na concentração de 5 ppm. Este tempo foi baixo se comparado ao LT50 encontrado para o extrato etanólico de Derris urucu, composto predominantemente de rotenona, que foi de 6h na concentração de 250 ppm (Gusmão et. al. 2002), mostrando o potencial da caloploicina como um possível agente larvicida.
O modo e sítio de ação dos metabólitos secundários com atividade larvicida tem recebido pouca atenção (Rey et. al. 1999). David et. al (2000) mostraram que as substancias larvicidas derivadas de plantas são ingeridas e, geralmente, afetam
primeiramente o epitélio do intestino médio e, em seguida, os cecos gástricos e os túbulos de Malpighi das larvas de mosquito. Aparentemente, o efeito tóxico da caloploicina se deve à sua ingestão pelas larvas, e não, pelo contato com o exoesqueleto. Esta afirmação é decorrente de testes de atividade inseticida da caloploicina sobre A. aegypti adultos. A pulverização em torre de Potter, de uma solução 10 ppm de caloploicina em DMSO 0,1% sobre grupos de 10 mosquitos, não causou mortalidade.
Os estudos de extratos e substâncias produzidas por plantas permitirão ampliar os conhecimentos sobre o metabolismo dos vegetais, possibilitando a descoberta de novas moléculas com atividade inseticida de interesse científico, social e econômico (Balandrin., 1993).