Purificação de substâncias ativas da planta
Phoradendron quadrangulare (Santalales:Viscacae) e do líquen Teloschistes flavicans
(Telochistales:Telochistaceae) contra a larva de Aedes aegypti (Diptera:Culicidae)
Analiz de Oliveira Gaio
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Campos dos Goytacazes – RJ
Março de 2007
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Purificação de substâncias ativas da planta
Phoradendron quadrangulare (Santalales:Viscacae) e do líquen Teloschistes flavicans
(Telochistales:Telochistaceae) contra a larva de Aedes aegypti (Diptera:Culicidae)
Analiz de Oliveira Gaio
Campos dos Goytacazes – RJ Março de 2007
Dissertação de mestrado apresentada ao
Centro de Biociência e Biotecnologia da
Universidade Estadual do Norte Fluminense
para obtenção do grau de Mestre em
Biociência e Biotecnologia.
Purificação de substâncias ativas da planta Phoradendron quadrangulare (Santalales:Viscacae) e do líquen Teloschistes flavicans
(Telochistales:Telochistaceae) contra a larva de Aedes aegypti (Diptera:Culicidae)
Analiz de Oliveira Gaio
Dissertação de mestrado apresentada ao Centro de Biociência e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense para obtenção do grau de Mestre em Biociência e Biotecnologia
.
Banca Examinadora:
___________________________________
Dr. José Roberto da Silva
___________________________________
Dr. Vanildo Silveira
____________________________________
Drª. Antônia Elenir Amâncio Oliveira
_____________________________________
Dr. Ivo José Curcino Vieira (Co-orientador)
___________________________________
Dr. Francisco José Alves Lemos (Orientador)
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Biotecnologia – LBT, no Centro de Biociência e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, sob a orientação do Dr. Francisco José Alves Lemos.
Financiamento: Faperj
AG A GR RA AD DE EC CI IM ME EN NT TO OS S
À Deus por ter me concedido a vida e as oportunidades e ter me sustentado quando todas as outras forças me falharam.
Aos meus pais Antônio José e Áurea pela educação que me foi dada, pelo apoio nas minhas escolhas, pela compreensão nos momentos difíceis e principalmente pelo amor dedicado a mim.
Ao meu orientador Francisco José Alves Lemos por sempre ter estimulado o interesse de seus alunos pela ciência, por ter acreditado no meu potencial, pela amizade, paciência e respeito oferecidos a mim, pela humildade, e pelo exemplo de conduta profissional e pessoal que desejo seguir ao longo de minha vida.
Ao meu co-orientador Ivo Curcino Vieira, pelos ensinamentos tão valiosos para a elaboração deste trabalho e ao Daniel Uchoa por realizar a espectrometria de massa e ressonância magnética.
À professora Aparecida TanaKa da Unifesp, São Paulo, Pelo auxilio na purificação e sequenciamento da proteína tóxica.
Aos meus irmãos Tiago e Cícero por terem me apoiado para que eu pudesse estudar e pelo orgulho que demonstram de mim, e a minha cunhada Jeanne pela amizade.
Ao Adão por ter aceitado fazer a revisão da minha monografia.
Ao João Marcelo Alvarenga Braga, do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro pelo auxilio na identificação das plantas e a Profª Sionara Eliasaro do Departamento de Botânica/UFPR pela identificação do líquen.
Aos professores José Roberto da Silva, Vanildo Silveira e Antônia Elenir Amâncio Oliveira, por aceitarem fazer parte da minha banca.
Às técnicas Telma e Rívea pelo auxílio nos experimentos e pela disposição de sempre ajudar.
A toda a minha família: avós, tios e primos que tanto me apóiam e admiram.
As minhas companheiras de bancada Tatiane, Kamilla , Natália, Flávia, Desiely, Mirian, Raquel e Saulo pelo auxilio e pelos momentos de descontração.
E a todos que de algumas forma me auxiliaram para a conclusão deste trabalho.
ÍN Í ND DI IC CE E
Índice de figuras...III Índice de tabelas...VI Abreviatura...VII Resumo...VIII Abstract...IX 1. INTRODUÇÃO
1.1. Biologia, importância médica e controle do mosquito Aedes aegypti...1
1.2. Interação inseto-planta...8
1.3. Proteínas com atividade inseticida...11
1.4. Metabólitos secundários...14
1.5. Ervas-de-passarinho...17
1.6. Líquen...20
2. OBJETIVOS...21
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Manutenção dos mosquitos...22
3.2. Coleta e identificação das plantas e líquen estudados... 22
3.3. Ensaios de atividade larvicida contra Aedes aegypti...22
3.4. Preparação dos extratos aquosos e orgânicos de Phoradendron quadrangulare... 23
3.5. Determinação de proteína e eletroforese das amostras dos extratos
vegetais...25
3.6. Eluição de proteínas de gel de poliacrilamida...25
3.7. Cromatografias de troca iônica DEAE e CM-Sepharose...25
3.8. Cromatografia de troca iônica em Hitrap Q (sistema FPLC)...26
3.9. Cromatografia de fase reversa (sistema HPLC)...26
3.10. Sequenciamento da região N-terminal da proteína tóxica...27
3.11. Preparação dos extratos orgânicos de Telochistes flavicans...28
3.12. Purificação do metabólito secundário do líquen Telochistes flavicans...28
3.13. Avaliação do grau de pureza das frações e identificação do metabólito secundário purificado...28
4. RESULTADOS 4.1. Atividade larvicida dos homogenatos aquosos de plantas e líquen...31
4.2. Purificação da proteína tóxica de Phoradendron quadrangulare...31
4.3. Atividade larvicida de extratos orgânicos de Phoradendron quadrangulare...48
4.4. Purificação e identificação do metabólito secundário do líquen Telochistes flavicans...48
5. DISCUSSÃO...58
6. CONCLUSÕES...64
7. REFERÊNCIAS BBLIOGRÁFICAS...65
ÍÍNNDDIICCEE DDEE FFIIGGUURRAASS
Figura 1. Ciclo biológico de A. aegypti ...2
Figura 2. Distribuição mundial do dengue...7
Figura 3. Estrutura química de compostos com atividade inseticida...16
Figura 4. Erva-de-passarinho Phoradendron quadrangulare ...18
Figura 5. Líquen Telochistes flavicans...20
Figura 6. Extrações do extrato metanol/água de Phoradendron quadrangulare...24
Figura 7. Passos de extração realizados com o líquen Telochistes flavicans...30
Figura 8. Perfil cromatográfico em DEAE-Sepharose do extrato aquoso de Phorandedron quadrangulare...31
Figura 9. Perfil cromatrográfico de uma CM-Sepharose de extrato aquoso de Phoradendron quadrangulare...32
Figura 10. Perfil cromatográfico de uma CM-Sepharose de extrato aquoso de P.
quadrangulare...33
Figura 11. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 10% corado com Coomassie das frações de CM-Sepharose do extrato de Phoradendron quadrangularare...35
Figura 12. Cromatografia de troca-iônica em coluna HiTrap Q (sistema FPLC)...36
Figura 13. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 15% corado com Coomassie das frações obtidas de troca iônica de extrato bruto Phoradendron quadrangulare...37
Figura 14. Cromatografia de fase reversa da amostra oriunda da coluna HiTrap...38
Figura 15. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 10% corado com Coomassie das frações obtidas da fase reversa...39
Figura 16. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 10% de poço único corado com Coomassie...41
Figura 17. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 15% corado com Coomassie...42
Figura 18. Eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida 10% corado com Coomassie de extrato aquoso de Phoradendron quadrangulare...43
Figura 19. Cromatografia de fase reversa de proteína tóxica eluida de gel de poliacrilamida ...44
Figura 20. Toxidade da proteína de Phoradendron quadrangulare sobre as larvas de A.
aegypti...45 Figura 21. Toxidade do extrato metanol-água da planta P. quadrangulare sobre as larvas de A. aegypti...47
Figura 22. TLC em coluna de sílica gel...49
Figura 23. Cromatografia gasosa da fração 6 proveniente da fase de diclorometano....50
Figura 24. Estrutura química da caloploicina...51
Figura 25. Efeito tóxico de diferentes concentrações da caloploicina sobre larvas de Aedes aegypti...53
Figura 26. Toxidade da rotenona sobre as larvas de A. aegypti...54
Figura 27. Mortalidade de larvas de Aedes aegypti ao longo do tempo...55
ÍNÍNDDIICCEE DDEE TTAABBEELLAASS
Tabela 1. Gradiente de eluição da cromatografia de troca iônica em coluna HiTrap Q...24
Tabela 2. Gradiente de eluição de cromatografia de fase reversa coluna C8...25
Tabela 3. Atividade larvicida contra Aedes aegypti de homogenatos de 6 plantas e 1 líquen coletadas na região Norte Fluminense...30
Tabela 4. Frações de cromatografia com atividade larvicida...48
Abreviaturas:
ACN- acetonitrila
BSA-Albumina sérica bovina CM- carboxi metil
DEAE-Dietilaminoetil DMSO- dimetilsulfóxido
EDTA- Ácido etileno diamina tetracética
HPLC- Cromatografia líquida de alta eficiência KDa- Quilodaltons
SDS- dodecil sulfato de sódio PBS- Tampão fosfato salino TRIS- Hidrometil amino metano
RESUMO
O mosquito Aedes Aegypti possui grande importância médica por ser transmissor de doenças como a dengue e febre amarela. Plantas e liquens possuem mecanismos de defesa, como a produção de proteínas e metabolitos secundário, para se protegerem de patógenos e do ataque de insetos herbívoros.
Os inseticidas convencionais para o controle deste vetor, têm provocado resistência na população de insetos. Uma alternativa para esse problema é a busca de novos compostos tóxicos que participam dos mecanismo de defesa de plantas e liquens. O objetivo deste trabalho foi a purificação de proteínas e metabólitos secundários da planta Phoradendron quadrangulare e do Teloschistes flavicans contra as larvas de A. aegypti . Extrato aquoso e metanólico de P.
quadrangulare foram testados contra as larvas de A. aegypti, e somente o extrato aquoso promoveu 100% de mortalidade larval. Por eletroforese, observou-se um perfil protéico de 6 bandas de proteína majoritárias em P. quadrangulare. Estas bandas foram eluidas do gel e testadas. Uma proteína de cerca de 20 kDa promoveu 100% de mortalidade larval. A região N-terminal desta proteína foi seqüenciada e não apresentou similaridade com outras proteínas. Uma curva de dosagem letal foi feita, obendo-se uma DL 50 de 6.77 mg/L. Alternativamente, esta proteína tóxica foi purificada por cromatografias de troca iônica e fase reversa.
Extrato metanólico bruto de T. flavicans mostrou-se ativo contra as larvas de A.
aegypti. Após o fracionamento com diferentes solventes obteve-se 3 frações, das quais a fração de diclorometano e acetate de etila foram ativas. A fase diclorometano foi submetida a cromatrografia em silica gel, obtendo-se 5 frãções tóxicas para a larva de A. aegypti, estando uma purificada. O metabólito secundário tóxico foi identificado como caloploicina por espectometria de massa e ressonância magnética nuclear de H e C13 e o valor de DL50 encontrado foi de 2 ppm.
AABBSSTTRRAACCTT
The mosquito Aedes aegypti is the world's most important vector of yellow fever and dengue viruses. Plants and lichens have evolved an array of defense mechanisms to protect themselves against the wide variety of pathogens and pests with which they are confronted. Included in these defense mechanisms are the proteins and secondary metabolites. Attempts to eradicate mosquitoes have been unsuccessful and search for more powerful alternatives. The objective of this work was to purify the toxic proteins and secondary metabolites from the plant Phoradendron quadrangulare and from the lichen Teloschistes flavicans against A.
aegypti larvae. Aqueous and methanol-water extracts of the P. quadrangulare caused 100% of mortality in A. aegypti larvae. Through electrophoresis it was observed 6 majority bands that were removed of the gel and tested separately against A. aegypti larvae. The toxic 20 kDa protein was sequenced and did not show homology to any other protein. The LD50 value of toxic protein was 6.77 mg/L. Alternatively, the toxic proteins was purified using ion exchange and reverse phase chromatographies. Methanol extracts from the lichen T. flavicans was fractioned using different organic solvents and three fractions were obtained and tested against A. aegypti larvae. Two fractions presented high larval mortality: etil acetate and dichloromethane. By Thin Layer Chromatography (TLC) was verified that both fractions had similar composition. Dichloromethane phase from the lichen Teloschistes flavicans was submitted to silica gel chromatography resulting in five different toxic fractions which one of them was purified. The biologically active component of T. flavicans was characterized as caloploicin by mass spectrometric and magnetic ressonance analyses. The LD50 value of caloploicin was 2 mg/L.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Biologia, importância médica e controle do mosquito Aedes aegypti
Os mosquitos são insetos dípteros, pertencentes à família Culicidae, conhecidos como pernilongos, muriçocas ou carapanãs. Os adultos são alados, possuem patas e antenas longas e a maioria é hematófaga, enquanto as fases imaturas são aquáticas (Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1997).
Aedes aegypti é um mosquito de coloração preta, com listras e manchas brancas, adaptado ao ambiente urbano (Taveira et al., 2001). Somente as fêmeas adultas são hematófagas e possuem hábitos diurnos, picando preferencialmente ao amanhecer e antes do por do sol, mas podem picar durante todo o dia, buscando refúgio dentro das residências atrás de objetos e móveis (Natal, 2002).
O local da picada é selecionado cuidadosamente, em geral diretamente num vaso capilar, com a saliva concomitantemente inoculada. A saliva pode conter anticoagulantes, aglutininas e substâncias alergênicas (Cobert e Smith,1974). Este mosquito ataca diferentes animais, de acordo com a proximidade ao seu habitat, mas, de uma maneira geral, prefere se alimentar do homem (Consoli e Lourenço- de-Oliveira, 1997).
Os mosquitos apresentam um curto ciclo biológico, variando em média de 8 a 12 dias e são holometábolos, passando pelos estágios de ovo, larva, pupa e adulto (Fig. 1). No gênero Aedes a oviposição é feita fora do meio líquido, porém próximos a estes ou em locais inundáveis. Assim, o mosquito A. aegypti se adaptou a depositar os ovos nas paredes de recipientes que acumulam água (Natal, 2002).
O mosquito A. aegypti adota preferencialmente criadouros artificiais, tanto recipientes abandonados pelo homem e que tiveram o acúmulo de água da chuva quanto reservatórios de uso doméstico (Juliano, 1998; Cives, 2002). A água para o desenvolvimento das larvas geralmente é pobre em matéria orgânica mas nada impede que elas se desenvolvam em águas poluídas (Juliano, 1998).
Figura 1. Ciclo biológico de mosquito mostrando os quatro estágios de desenvolvimento do Aedes aegypti. Adaptado de www.arbovirus.health.nsw.gov.au/arbovirus/mosquit/photos.ht ml
As larvas possuem mandíbulas e maxilas adaptadas para obter o alimento presente na água, os quais podem ser microrganismos, detritos, folhas e invertebrados vivos ou mortos (Nasci e Miller, 1996).
O corpo de A. aegypti adulto é nitidamente dividido em cabeça, tórax e abdômen. Órgãos como os olhos, as antenas e os palpos situam-se na cabeça.
No tórax estão os apêndices especializados na locomoção (patas e asas), e no abdômen está a maior parte dos órgãos internos, os aparelhos reprodutor, digestivo e excretor (Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1997).
Os mosquitos são transmissores de uma série de doenças de grande importância no campo da saúde pública, presentes em grande escala na América Latina e África (Gwards e Collins, 1996). O dengue e a febre amarela são doenças virais com graves conseqüências na saúde pública. O dengue e o dengue hemorrágico são consideradas as mais importantes e disseminadas doenças virais transmitidas por mosquito; e A. aegypti tem papel crucial na transmissão destas infecções (Paho 1995; Nogueira et al., 1999).
O dengue configura, no momento atual, uma arbovirose reincidente e esta situação se agrava nos países tropicais, onde as condições do ambiente, associadas à ineficácia das políticas públicas de saúde, favorecem o desenvolvimento e a proliferação de A. aegypti (FUNASA, 1998).
Atualmente, o dengue atinge mais de 100 países da África, Américas, Leste Mediterrâneo, Sudeste da Ásia e no Oeste do Pacífico, e cerca de dois milhões e meio de pessoas no mundo correm o risco de serem afetadas, pelo transmissor, anualmente. Apenas no ano de 2001, foram registrados mais de 609 mil casos de dengue nas Américas, dos quais 15 mil casos foram de dengue hemorrágica.
Neste mesmo ano, o Brasil registrou mais de 390 mil casos, incluindo 670 de dengue hemorrágica (WHO, 2002). Em 2002, segundo dados divulgados pela OMS e FUNASA, nos primeiros quatro meses do ano o Brasil registrou 84 mortes em resposta ao dengue transmitida pela picada do mosquito. No total, foram registrados no ano 550 mil casos da dengue, sendo que 200 mil pacientes tiveram o tipo mais grave da doença, o dengue hemorrágica. Na região Sudeste foi notificado o maior número de casos de Dengue (FUNASA, 1999).
O dengue é uma doença febril aguda causada por um arbobírus do gênero Flavivírus, em que são reconhecidos atualmente 4 sorotipos: DEN-1, DEN-2, DEN- 3, DEN-4. As manifestações variam de uma síndrome viral, benigna e inespecífica até um quadro grave fatal de doença hemorrágica (Tauil, 2001). O seu espectro clínico é muito amplo, variando de formas assintomáticas ou oligosintomáticas até formas graves e letais. As causas da ocorrência de formas graves ainda não estão plenamente estabelecidas, existindo algumas teorias explicativas relacionadas à maior virulência da cepa de vírus infectante, à seqüência de infecções pelos diferentes sorotipos do agente etiológico, a fatores individuais do hospedeiro e a uma combinação de todas as explicações anteriores. Por outro lado, apesar de muito pesquisada, ainda não está disponível uma vacina preventiva eficaz (Miagostovich et al. 2003).
Há três teorias que tentam explicar a ocorrência do dengue hemorrágico. A primeira diz que o seu aparecimento se deve à virulência da cepa infectante, de modo que as formas mais graves sejam resultantes de cepas extremamente virulentas. A segunda teoria e mais aceita relaciona o dengue hemorrágico com infecções seqüenciais por diferentes sorotipos do vírus da dengue, num período de 3 meses a 5 anos. Nessa teoria, a resposta imunológica na segunda infecção é exacerbada, o que resulta numa forma mais grave da doença. E finalmente a terceira que tem sido proposta por autores cubanos, aliam as duas teorias citadas acima a outros fatores de risco. A interação desses fatores de risco promoveria condições para a ocorrência do dengue hemorrágico (Ministério da Saúde, 2002).
O mosquito A. aegypti é o vetor responsável pela febre amarela na América Central e do Sul e é também vetor da dengue hemorrágica endêmica no Sul da África e nas áreas das ilhas do Pacífico (Fig. 2).
A febre amarela é um outro tipo de doença causada por um arbovírus do gênero Flavivírus, encontrado principalmente na África e nas Américas. Esta doença pode ser classificada epidemiologicamente de duas maneiras: febre amarela silvestre e febre amarela urbana (Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1997;
Nasci e Miller, 1996). A forma silvestre é veiculada na floresta por mosquitos silvestres que picam animais susceptíveis ao vírus, especialmente macacos. Por
sua vez, a forma urbana é veiculada dentro das cidades sendo transmitida entre os seres humanos (Consoli e Lourenço-de-Oliveira, 1997).
A febre amarela urbana considerada extinta das Américas desde 1942 (Nasci e Miller, 1996; Consoli e Lourenço-de-Oliveira,1997; Gubler e Clark, 1995), pode voltar a ser deflagrada a qualquer momento, uma vez que os grandes centros urbanos estão novamente infestados com o mosquito vetor. Mesmo com o desenvolvimento de uma vacina eficiente, criada há décadas, a febre amarela pode ser importada, através dos doentes, das áreas silvestres para a urbana, o que pode reintroduzir a doença promovendo uma nova epidemia (Gubler e Clarck,1995).
O mosquito A. aegypti, que havia sido erradicado em vários países do continente americano nas décadas de 50 e 60, retornou na década de 70 por falhas na vigilância epidemiológica e pelas mudanças sociais e ambientais propiciadas pela urbanização acelerada da época (Tauil, 2002). Atualmente, este mosquito é encontrado numa ampla faixa do continente americano, que se estende desde o Uruguai até o sul dos Estados Unidos, com registro de surtos importantes em vários países como Venezuela, Cuba, Brasil e no Paraguai.
No Brasil, desde 1967 e até recentemente, os programas de Saúde Pública usaram exclusivamente inseticidas organofosforados para o controle de A. aegypti (Ministério da Saúde, 1968; Lima et al., 2003). Em 1999, a resistência do mosquito a este grupo de inseticidas começou a ser monitorada em vários municípios, em um programa coordenado pela FUNASA. A comprovação da resistência, em várias localidades do país, ao temefós, único larvicida usado até 2000 contra Aedes (FUNASA, 1999; Lima et al., 2003) começou a nortear a definição de novas estratégias de controle do vetor. Como alternativa, além do uso de piretróides no controle de adultos, algumas formulações do biolarvicida Bti têm sido aplicadas em regiões onde se detectou resistência.
A febre amarela pode ser controlada com vacinas, entretanto, a vacina é inviável no caso do dengue devido a existência de, pelo menos, 4 sorotipos diferentes que causam a doença. Sendo assim, a melhor alternativa, para o controle do dengue, é o controle do vetor. Por experiências anteriores, viu-se que
toxinas liberadas ao ar livre (como spray) são muitas vezes ineficientes para os adultos, já que os mosquitos optam por permanecerem escondidos em recintos fechados. Então, o melhor caminho para o controle da população de A. aegypti é atingir os locais de procriação das larvas (Carvalho et al., 2003).
Fonte: www.anlis.gov.ar/dengue/dengue
Figura 2. Distribuição mundial do dengue. Em A países de risco de surto de febre amarela na América do Sul e África. Em B distribuição mundial do dengue
1.2. Interação Inseto-Planta
Os variados seres hoje existentes resultam do processo evolutivo ocorrido na Terra desde o surgimento da vida. A teoria da evolução pela seleção natural diz que a mutação dos organismos é aleatória, e que mutantes inadaptados às condições ambientais tendem a ser extintos. A sobrevivência dos seres vivos depende, portanto, de sua habilidade para se adaptar ao estresse, que atua como pressão seletiva. Assim, as várias estratégias de sobrevivência selecionadas permitiram o aparecimento de diferentes formas de vida (Margis-Pinheiro et al., 1999).
Plantas e insetos são organismos intimamente associados. Os insetos beneficiam as plantas promovendo sua defesa e polinização, enquanto as plantas oferecem aos insetos abrigo, sítios de oviposição e alimento, necessários para a proliferação dos mesmos (Panda e Khush, 1995). Entretanto, dependendo da intensidade do ataque dos insetos, este pode ser extremamente danoso para as plantas, levando inclusive à morte do vegetal. Para minimizar os ataques, as plantas desenvolveram diferentes mecanismos de defesas, que incluem barreiras químicas e físicas, como a indução de proteínas de defesa (Haruta et al.; 2001), voláteis que atraem predadores de insetos herbívoros (Birkett et al., 2000) e metabólitos secundários (Kliebenstein et al., 2001).
As plantas possuem mecanismos químicos de defesa que podem envenenar e interferir na digestão de herbívoros que se alimentam delas. A diversidade dos metabólitos secundários é devida, em parte, à pressão seletiva causada pela herbivoria. Metabólitos secundários são moléculas orgânicas de baixa massa molecular que, por definição, não são requeridos para os processos fisiológicos normais de crescimento. Ao contrário dos compostos do metabolismo primário, estas substâncias são sintetizadas por grupos específicos de plantas, sendo empregadas como marcadores para estabelecer linhas filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos (Gottlieb, 1982).
Os estudos referentes às defesas contra herbivoria têm sido, freqüentemente, direcionados para os metabólitos secundários, ao invés das proteínas. Isto, talvez seja, devido à sua grande diversidade estrutural e,
geralmente, uma maior atividade biológica (Duffey e Stout, 1996). Dentro deste contexto, mais de 2.000 espécies de plantas que possuem propriedades inseticidas naturais foram identificadas, apresentando metabólitos secundários tóxicos tais como rotenóides, nicotina, alcalóides, entre outros (Macêdo et. al., 1997). Estas moléculas freqüentemente afetam a função nervosa e o comportamento do inseto. Extratos de plantas têm mostrado grande potencial como larvicidas naturais no controle de mosquitos vetores, sendo conhecidas mais de 300 espécies de plantas com esta característica (Pohlit et al., 2004).
Dentre as proteínas envolvidas em mecanismos de defesa as mais conhecidas são as lectinas, as proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) e os inibidores de enzimas proteolíticas e glicosidases (Ryan, 1990; Bowles, 1990;
Chrispeels e Raikhel, 1991; Barbieri et al., 1993; Peumans e Van Damme, 1995;
Koiwa et al., 1997). Outras proteínas vegetais, que também atuam em mecanismos complexos de defesa, são as arcelinas (Osborn et al., 1988), as quitinases (Herget et al., 1990) e a canatoxina (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).
As plantas têm utilizado sofisticados mecanismos de defesa. A maioria deles está concentrada nos frutos já que são responsáveis pela propagação e sobrevivência das espécies. Os tecidos da semente podem acumular compostos que conferem resistência contra fitófagos predadores e infecção por vírus, bactérias, fungos, nematóides, etc. (Wittstock e Gershenzon, 2002).
Estudos sugerem que algumas partes das plantas com alto capacidade adaptativa, ou cuja destruição possa afetar a sobrevivência da espécie podem ser melhor protegidas por defensivos que outras, que podem se defender induzindo respostas após um dano inicial. Como o exemplo, a cenoura selvagen (Pastinaca sativa) cujos órgãos reprodutores são freqüentemente atacados por herbívoros.
Estes órgãos acumulam altos níveis de substâncias tóxicas como xantotoxina e suas concentrações não sofrem aumento com danos artificiais. Ao contrário, as raízes são raramente atacadas, apresentando baixos níveis de xantotoxina, ao qual sofre rápido aumento após sofrerem algum ferimento (Wittstock e Gershenzon, 2002).
A pressão seletiva dos inseticidas convencionais vem aumentando as populações de mosquitos resistentes, crescendo a demanda por novos produtos que sejam seguros para o meio ambiente, específicos para o grupo de organismos que se deseja controlar e, também, facilmente degradáveis (Carlini e Grossi-de- Sá, 2002).
Atualmente existem dois larvicidas efetivos contra A. aegypti no mercado: o Metoprene, um análogo do hormônio juvenil, que interfere no desenvolvimento larval; e o Bacillus thuringiensis israelensis (Bti), que produz toxinas que se ligam às células epiteliais do intestino, formando poros não específicos que levam ao inchaço intestinal e a morte larval (Henrick et al., 1973). Contudo, a formulações de Bti e de Metoprene disponíveis para uso no controle de A. aegypti, além de terem custo elevado, apresentam baixo poder residual em nossas condições climáticas. Sendo assim, estudos que objetivem o desenvolvimento de alternativas eficientes de controle são importantes do ponto de vista estratégico.
As proteínas, como moléculas de defesa, têm uma vantagem sobre os metabólitos secundários sob o ponto de vista biotecnológico. Cada proteína, geralmente é codificada por um único gene. O gene pode ser isolado e usado para transformação de uma determinada cultura visando aumentar a sua resistência às pragas. Esta estratégia vem sendo utilizada pela indústria biotecnológica que busca novas proteínas de defesa em plantas como também em outros organismos (Rey et al., 1991).
Dentro deste contexto, as plantas podem representar uma forma alternativa para o controle de mosquitos. Muitos trabalhos já têm sido feitos focalizando os extratos de plantas ou metabólitos secundários como uma fonte potencial de produtos comerciais visando o controle de mosquitos (Rey et al., 1991).
1.3. Proteínas com atividade inseticida
As plantas possuem sofisticados mecanismos de defesa contra predadores e infecção por patógenos (Sales et. al., 2000). Uma das formas de proteção, que as plantas se utilizam, é a produção de proteínas tóxicas. As principais proteínas sintetizadas por plantas que estão envolvidas em mecanismos de defesa são:
lectinas, proteínas inativadoras de ribossomos, enzimas inibidoras de proteólise e glicoidrolases (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).
As plantas sofrem um constante ataque de insetos herbívoros e uma potente defesa destas, em resposta a este ataque, é a produção de inibidores contra proteinases digestivas de insetos. Entretanto, com o processo evolutivo, os insetos têm se adaptado a estes inibidores desenvolvendo proteinases variantes que minimizam o efeito das proteínas defensivas das plantas (Giri et. al. 2003).
Em adição, alguns insetos polifagos são capazes de alterar a expressão de diferentes isoformas de proteinases de intestino maximizando sua resistência aos inibidores produzidos pelas espécies de plantas (Patankar et al., 2001).
Há evidências que componentes do sistema de defesa de algumas plantas pode ter sido perdido durante a seleção artificial imposta pela domesticação.
Exemplo desse processo ocorreu com as arcelinas, uma família de proteínas que exibem propriedades inseticidas, que são encontradas somente em variedades selvagens do feijão Phaseolus vulgaris (Osborn et al.,1998).
A estratégia para aprimorar os sistemas de defesa de plantas para o futuro é identificar inibidores de proteinases com alta atividade contra tipo particular de insetos (Giri et. al., 2003).
Lectinas são uma classe de proteína que possui pelo menos um domínio não catalítico que especificamente liga mono ou oligossacarídeos. Uma típica lectina é multivalente e tem habilidade de aglutinar células. Elas são extensivamente distribuídas na natureza e por vários anos essas moléculas têm sido isoladas de plantas, vírus, bactérias, invertebrados e vertebrados. Sementes,
particularmente de leguminosas são ricas em lectina (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).
Várias lectinas de plantas têm mostrado efeitos tóxicos quando ingeridas por insetos das ordens Coleoptera e Lepidoptera. Tem sido demonstrado que algumas lectinas se ligam à membrana das células epiteliais intestinais de insetos, ou no caso de lectinas com domínios de ligação a quitina, à membrana peritrófica que é composta de uma malha de quitina associada à proteoglicanos e proteínas, incluindo as glicoproteínas (Peters, 1992). Outra possibilidade de efeito tóxico inclui ligação da lectina a enzimas digestivas glicosiladas. Contudo o mecanismo preciso de ação das lectinas em insetos ainda é desconhecido (Carlini e Grossi- de-Sá, 2002).
Tipicamente, lectinas multivalentes estão freqüentemente presentes em sementes de plantas que contém proteínas tóxicas. Em contraste com as demais lectinas, que possuem sítios multivalentes de ligação a carboidratos, ricina e abrinina são outras proteínas tóxicas de plantas e de origem microbial que se comportam como lectinas monovalentes, por possuirem sítios únicos de ligação à carboidratos sendo designadas de hemilectinas (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).
Ricina e abrina têm se mostrado ativas como proteínas inibidoras de síntese em células eucarióticas através da inativação da subunidade ribossomal 60S.
Muitas destas toxinas microbiais e proteínas tóxicas em plantas exercem seus efeitos intracelularmente, sendo compostas de duas cadeias polipeptídicas ou domínios com propriedades biológicas distintas. O hapetomer ou domínio B reconhece a célula alvo por interação especifica com carboidratos ou glicoderivados presentes na superfície das células. Sabe-se que a cadeia B de proteínas tóxicas em plantas se liga longe de resíduos de D-galactose, N-acetil- galactosamina (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).
Em geral os eventos que procedem aos efeitos tóxicos dessas proteínas são: (1) ligação da subunidade B ao receptor na superfície das células o mediador para a internalização da holotoxina; (2) uma vez dentro do compartimento endocítico, as proteínas podem ser processadas por proteólise e/ou redução do
grupo tiol e /ou mudanças conformacionais devido a acidificação da vesícula endocítica; (3) separação dos dois domínios que ocorrem na toxina, redistribuindo o efeito da ação enzimática;(4) o domínio de efeito que se insere na membrana da vesícula, alcança o citoplasma; (5) o efeito final da toxina é dependente da atividade enzimática e dos componentes do citoplasma (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).
Outro grupo de proteínas, que podem possuir propriedades inseticidas são os inibidores de proteinase. Estas proteínas inibem as enzimas proteolíticas que catalisam a quebra da ligação peptídica na proteína. Estes inibidores são classificados de acordo com os seus mecanismos de catalise e aminoácidos presentes no sítio ativo: (1) serino proteinases, com serina e histidina; (2) cisteino proteinases, com a cisteinas; (3) proteinases aspárticas, com o grupo aspartato e (4) metaloproteinases, com íons metálicos (Zn 2+, Ca 2+ , Mn 2+) (Neurath, 1984).
Um grande número de inibidores de proteinases já foram descritos em animais, plantas e microorganismos e suas estruturas e propriedades funcionais têm sido extensivamente estudadas e elucidadas (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).
Em plantas, diferentes papéis para inibidores de proteinases tem sido sugeridos, inclusive sua ação como proteínas de reserva, como reguladores da atividade proteolítica endógena (Ryan, 1990), como participantes em diversos processos de desenvolvimento, incluindo a morte celular programada (Solomon et al., 1999), e como componentes associados à resistência de plantas à insetos e patógenos . Eles podem ser sintetizados durante o desenvolvimento normal ou podem ser induzidos por resposta ao ataque de insetos e patógenos. (Ryan, 1990;
Ryan e Pearce, 1998).
O mecanismo pelo qual os inibidores de proteinases interferem no processo digestivo dos insetos se deve à diminuição da assimilação de nutrientes. Quando insetos são submetidos a uma dieta artificial que contenha inibidores específicos para a principal classe de proteases de seus intestinos, estes têm seu crescimento e desenvolvimento retardados, bem como podem apresentar índices de mortalidade bastante significantes (Sales et al., 2000; Macedo et al., 2000).
1.4. Metabólitos Secundários
O metabolismo primário refere-se aos processos responsáveis pela produção de aminoácidos, carboidratos, ácidos graxos, proteínas e ácidos nucléicos, todos essenciais para a sobrevivência e bem estar do organismo. Já os metabólicos secundários não são essenciais para a vida, mas contribuem para uma melhor adaptação do organismo as condições impostas e uma maior sobrevivência. Estes são produzidos utilizando-se outras rotas metabólicas daquelas utilizadas pelo metabolismo primário (Torsell, 1997).
Durante algum tempo, os metabólitos secundários foram considerados como produtos de excreção do vegetal, entretanto, atualmente, sabe-se que muitas dessas estruturas estão diretamente envolvidas nos mecanismos de adequação do produtor a seu meio. Já foram reconhecidas funções de várias substâncias pertencentes a essa classe de metabólitos, por exemplo, a defesa contra herbívoros e microrganismos, a proteção contra os raios UV, a atração de polinizadores ou animais dispersores de sementes (WinK, 1990).
As plantas possuem a capacidade de se defender contra ataque de herbívoros, produzindo uma variedade de metabólitos secundários. Elas podem, por exemplo, produzir compostos com alta toxidade ou compostos que imitam aqueles normalmente produzidos por herbívoros, como hormônios de crescimento e ferormônios, ou ainda produzir substâncias que interferem na digestibilidade dos herbívoros, diminuindo sua assimilação de nutrientes. Um exemplo de composto produzido por plantas que interfere na digestão dos herbívoros é a azadiractina (figura 3), produzida pela Azadirachta Indica (Mittal et al., 1995).
Outro repelente de insetos bem conhecido é a piretrina (figura 3) ela repele uma grande variedade de insetos, análogos sintéticos desse composto são extensivamente usados como inseticidas (Harborne, 1983).
A diversidade de fitoquímicos encontrados no reino vegetal é alta e milhares de estruturas são conhecidas (Luckner, 1990; Dey e Harborne, 1997). Embora os fitoquímicos tenham outras funções ecológicas além de defesa, a co-evolução de plantas com os insetos, provavelmente, contribuiu para a sua diversidade química (Harborne, 1993). Os metabólitos secundários têm sido amplamente investigados
como defesa constitutiva contra herbívoros, mas demonstrações de sua síntese e acúmulo como resultado de herbivoria e ferimento são ainda limitados.
Durante o século XX, alguns desses compostos, como nicotina, rotenona e piretrinas, foram usados comercialmente como inseticidas (Ware, 1998). As plantas produzem milhares de outros compostos inseticidas que têm modos de ação diversos, como hormonal, neurológico, nutricional e enzimático (Rosenthal e Jansen, 1979).
As principais plantas das quais são obtidas substâncias com atividade inseticida pertencem aos gêneros Nicotiana (Solanaceae), produtoras de nicotina e nornicotina; Derris, Lonchocarpus, Tephrosia e Mundulea (Leguminosae), produtoras de rotenóides; Chrysanthemun (Asteraceae), produtoras de piretrinas e Azadirachita (Meliaceae), produtoras de azadiractina que promove indigestibilidade em alguns grupos de insetos (Mittal et al., 1995) .Além dessas, outras plantas apresentam atividade inseticida e um grande número de metabólito secundário está sendo estudado visando a produção de biopesticidas eficazes e ecologicamente seguros (Rey et al., 1991). Assim, a busca por novos inseticidas em plantas constitui-se um campo de investigação aberto, amplo e contínuo, principalmente levando-se em consideração que apenas uma pequena parcela dessas plantas foi investigada para tal finalidade.
Figura 3. Estrutura química de alguns compostos com atividade inseticida.
A, piretrina; B, rotenona; C, azadiractina; D, nicotina. Adaptado de http://www.sbq.org.br/PN-NET/texto1/agricultura.htm.
1.5. Ervas-de-passarinho
Poradendron quadrangulare comumente conhecida como ervas-de- passarinho pertence ao filo Magnoliophyta, classe magnoliopsida, ordem Santalales, família Viscaceae. As ervas-de-passarinho constituem um grupo de plantas parasitas que são capazes de realizar fotossíntese, mas não obtêm água do solo ou da chuva (Fig. 4). Elas têm raízes especiais que retiram água e alguns nutrientes diretamente de outros vegetais. Algumas espécies de ervas-de- passarinho têm importância econômica por conta dos prejuízos que causam às plantações, ao parasitar inúmeros arbustos e árvores frutíferas ou árvores usadas em reflorestamentos para produção de madeira (Gazetta e Galetti, 2003).
Existem cerca de 700 espécies que dividem-se em 24 gêneros, pertencentes a quatro famílias (Eremolepidaceae, Loranthaceae, Misodendraceae e Viscaceae). O termo erva-de-passarinho é usado para designar essas plantas porque a maioria delas depende das aves para a dispersão de suas sementes (Gazetta e Galetti, 2003).
A erva-de-passarinho produz hastes de até 1 m de comprimento e 1 cm espessura. As hastes são bastante ramificadas, suas partes mais inferiores possuem um inchamento no ponto de em que se prende ao hospedeiro. As inflorescencias são pontos pequenos, de um a três no número nos axis da folha, e suportam flores pequenas. As frutas são de coloração amarela e globulosas medindo de 3 a 4 milímetros de diâmetro (Howard 1988). A erva-de-passarinho é nativa da América central, da América sul, e das Índias ocidentais (Howard 1988).
Figura 4. Erva-de-passarinho Phoradendron quadrangulare coletada em Campos dos Goytacazes.
1.6. Líquens
O líquen é uma associação simbiótica entre um fungo e um microrganismo fotossintetizante. O componente fúngico de um líquen (o micobionte) é, na grande maioria, dos casos um fungo do Filo Ascomycota e, mais raramente, Basidiomycota. O componente fotossintetizante (fotobionte, também chamado de ficobionte em alusão à alga) é, em geral, uma Chlorophyta ou uma cianobactéria (ou, muito raramente, uma bactéria autotrófica). O líquen é, portanto uma associação geralmente de dois componentes- o heterótrofo (sempre em número de um) e o fotoautótrofo (geralmente em número de um, e ocasionalmente dois ou até mais (Oliveira, et al., 2002).
Os líquens apresentam diferentes aspectos morfológicos: filamentosos, foliáceos e incrustantes. O fungo é geralmente, responsável não só pela forma como também pela estrutura do líquen, as hifas contribuem para a maior parte da sua massa. O fungo proporciona o ambiente físico para o crescimento da alga, conferindo-lhe também proteção contra a intensa luz solar.
Líquens são freqüentemente os primeiros colonizadores. A maioria das espécies de fungos constituintes dos líquens são encontrados apenas em regiões com baixos índices de poluição (Dayan, 2001).
O talo de T. flavicans é composto por estruturas ligeiramente arredondadas como lóbulos (Fig. 5). As estruturas formadas tem em torno de 8 cm de diâmetro e entre 2-4 cm de altura. Os lóbulos são divididos regularmente em pares. São de coloração amarelada . Os lóbulos são dispersados através de estruturas proeminentes que são a mesma cor que os lóbulos ou pretos
( Filson 1969). Teloschistes favicans espécie estudada neste trabalho pertence ao filo Ascomycota, classe Ascomycetes, ordem Teloschistales, família Teloschistaceae.
Figura 5. Líquen Teloschistes flavicans coletado na restinga de Iquiparí, município de São João da Barra, RJ.
2. Objetivo Geral
Identificar substâncias tóxicas nos extratos aquosos e orgânicos da planta Phoradendron quadrangulare e do líquen Teloschistes flavicans.
2.1 Objetivos específicos
• Purificar uma proteína tóxica contra as larvas do mosquito Aedes aegypti a partir do extrato aquoso da planta Phoradendron quadrangulare.
• Purificar e identificar um metabólito secundário tóxico para as larvas de Aedes aegypti a partir do extrato metanólico do líquen Teloschistes flavicans.
3. Materiais e métodos
3.1. Manutenção dos mosquitos
Os mosquitos A. aegypti da linhagem Rockfeller foram obtidos da colônia do Setor de Entomologia do Instituto de Biologia do Exército (IBEX-RJ).
As larvas utilizadas nos experimentos foram mantidas no insetário do Laboratório de Biotecnologia da UENF, sendo criadas em bandejas com água destilada a temperatura ambiente. A dieta das larvas consistiu de ração de camundongo. Os mosquitos adultos foram mantidos a temperatura ambiente em gaiolas umidificadas contendo uma solução de sacarose 10%. As fêmeas adultas foram alimentadas com sangue de camundongo para que houvesse a maturação e postura dos ovos.
3.2. Coleta e identificação das plantas e líquen estudados
As amostras vegetais foram coletadas na Região Norte Fluminense. Parte do material foi utilizado para preparação dos extratos aquosos ou orgânicos. O restante do material foi prensado e seco em estufa a 40 ºC com aeração, para a confecção das excicatas, a fim de serem catalogadas e identificadas. Para realização da identificação das espécies tivemos a colaboração do pesquisador João Marcelo Alvarenga Braga do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro e da Profª Sionara Eliasaro do Departamento de Botânica/UFPR.
3.3. Ensaios de atividade larvicida contra Aedes aegypti
Grupos de 30 larvas, do quarto estádio, foram mantidas em concentrações fixas ou crescentes dos extratos aquosos ou orgânicos. A mortalidade larval foi registrada após 24 h de exposição. Os extratos orgânicos foram solubilizados em DMSO 1%. O grupo controle foi mantido em água
destilada (nos ensaios com extratos aquosos), ou em DMSO 1% (nos ensaios com extratos orgânicos), sem acréscimo do extrato.
Nos testes larvicidas utilizando-se a proteína tóxica, usou-se 10 larvas do quarto estádio. Os resultados dos experimentos, feitos com diferentes concentrações dos extratos, foram analisados pelo método de log-Probit, para a obtenção das dosagens letais de 50% da população testada (DL50) (Armitage e Berry, 1987).
3.4. Preparação dos extratos aquosos e orgânicos de Phoradendron quadrangulare
Os extratos aquosos foram preparados macerando-se 1g do material vegetal fresco em 10 mL de água destilada, com o auxílio de um liquidificador comum. Os homogenatos obtidos foram utilizados para os ensaios de atividade larvicida preliminares.
Para os outros ensaios, as amostras foram centrifugadas a 10000 g por 10 min, a 4 °C. Em seguida, os sobrenadantes foram tratados com 80% de acetona gelada, durante 10 min, para a precipitação das proteínas que, posteriormente, foram ressuspensas em água ou tampão apropriado.
Os extratos orgânicos de P. quadrangulare foram preparados utilizando-se 800 g de folhas secas e trituradas em moinho. Após esta etapa, o material obtido foi imersa em metanol, ou em uma solução de metanol/água (1:1, v/v), durante 3 dias. Após este tempo, a fração líquida foi recuperada e novas adições (2 X) de metanol ou metanol/água foram feitas. As soluções obtidas foram reunidas e os solventes foram retirados utilizando-se um evaporador rotativo Büchi (modelo R - 114) a 40 °C (Fig. 6).
Figura 6. Extrações com solventes orgânicos realizados com a erva-de-passarinho Phoradendron quadrangulare.
3.5. Determinação de proteína e eletroforese das amostras dos extratos vegetais
As proteínas foram dosadas pelo Método de Folin Ciocalteu (Lowry et al., 1951), utilizando-se albumina sérica bovina (BSA) para obter a curva padrão.
Eletroforeses desnaturantes, conforme Laemmli (1970), e semi- desnaturantes foram feitas em gel de poliacrilamida a 10% e 15% a 0,75 mm de espessura. O gel foi corado com uma solução de Coomassie Blue R 0,25% em metanol, ácido acético e água destilada (4:1:5, v/v/v) e descorado com uma solução de metanol 35% e ácido acético 10%.
3.6. Eluição de proteínas de gel de poliacrilamida
As bandas de interesse foram cortadas do gel de poliacrilamida, maceradas em tampão Tris-HCl 0.03M pH 8,0, e em seguida sonicadas 10 X (30 segundos cada), intercalando com intervalos de 30 segundos em gelo. Depois das proteínas serem sonicadas foram centrifugadas a 10000 G por 5 min e o sobrenadante, após a precipatação com acetona, foi utilizado para os ensaios larvicidas.
3.7. Cromatografias de troca iônica DEAE e CM-Sepharose
O precipitado com 80% de acetona (10 mg) (item 3.4) foi ressuspenso em 2 mL de tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8.0, uréia 4 M, benzamidina 1 mM e EDTA 1 mM (DEAE Sepharose) e em tampão acetato de sódio 20mM pH 4.8 contendo uréia 4 M e benzamidina 1 mM e 1 EDTA 1 mM (CM Sepharose). A coluna foi eluída com 20 mL de NaCl 0,25 M, 20mL de NaCl 0,5 M e 20mL de NaCl 1M. O fluxo da coluna foi de 1mL/ min e foram coletadas frações de 2,0 mL. As frações dos picos obtidos foram testadas contra as larvas de A. aegypti.
3.8. Cromatografia de troca iônica em Hitrap Q (sistema FPLC)
O precipitado com 80% de acetona (50 mg) (item 3.4) foi ressuspenso em 2 mL de tampão acetato de sódio 20mM pH 4.8 contendo uréia 4 M e benzamidina 1 mM e 1 EDTA 1 mM e cromatografado em coluna HiTrap Q em sistema FPLC. A coluna foi equilibrada com o tampão acima sob o fluxo de 0,5ml/min. A eluição foi realizada seguindo gradiente linear (Tab. 1) com o tampão de equilíbrio contendo de 0 a 0,7M de NaCl.
Tabela 1. Gradiente de eluição da cromatografia de troca iônica em coluna HiTrap Q.
Tampão A: tampão acetado de sódio 20mM pH 4.8 contendo uréia 4 M e benzamidina 1 mM, EDTA 1 mM.
Tampão B: tampão acetado de sódio 20mM pH 4.8 contendo uréia 4 M e benzamidina 1 mM, EDTA 1 mM, NaCl 0.7M.
3.9. Cromatografia de fase reversa (sistema HPLC) Tempo
(min)
Tampão A (%)
Tampão B (%)
0 100 0
12 100 0
70 0 100
75 0 100
76 100 0
80 100 0
O material obtido da troca iônica em HiTrap Q (fração 3) foi analisado por cromatografia de fase reversa em um sistema cromatográfico ÄKTA (Uppsala, Pharmacia). A amostra foi aplicada em coluna C8 (Ultrasphere – 15 cm x 0.46 cm), com gradiente de acetonitrila (0-90%) em ácido trifluoracético 0,1%. A eluição foi realizada utilizando-se gradiente de ácido trifluoracético 0,1% e acetonitrila 90%, como mostra a Tabela 2, sob fluxo constante de 1,0 mL/min.
Tabela 2. Gradiente de eluição de cromatografia de fase reversa coluna C8.
Tempo (min) Solvente B (%)
0,1 0
60 100
68 0
Tampão A: ácido trifluoracético 0,1%
Tampão B. ácido trifluoracético 0,1% em acetonitrila 90%.
3.10. Sequenciamento da região N-terminal da proteína tóxica
O sequenciamento automático da proteína foi realizado no Departamento de Bioquímica da Unifesp utilizando o sequenciador automático Shimadzu modelo PPSQ-23 segundo instruções do fabricante, empregando-se a técnica da degradação de Edman (1956).
3.11. Preparação dos extratos orgânicos de Telochistes flavicans
Para a preparação do extrato de T. flavicans foram moídos 800 g do líquen e imersos em metanol durante 3 dias. Após este tempo, a fração líquida foi recuperada e novas adições (2 X) de metanol foram feitas. As soluções obtidas foram reunidas e os solventes foram retirados utilizando-se um evaporador rotativo Büchi (modelo R -114) a 40 °C Após essa extração inicial, processou-se uma partição sucessiva, utilizando-se solventes com diferentes polaridades.
Posteriormente, os extratos semi-puros foram testados e aqueles que apresentaram atividade larvicida, foram submetidos aos procedimentos cromatográficos visando o isolamento do metabólito ativo (Fig. 7).
3.12. Purificação do metabólito secundário do líquen Telochistes flavicans
Para o fracionamento da fase diclorometano (item 3.10) do líquen T.
flavicans, foi realizada uma cromatografia de adsorção em coluna, empacotada com sílica gel Merck Darmstadt 60 (0,063 – 0,200mm). No processo de purificação foi adicionado diclorometano até que fosse possível a visualização de um padrão de bandas de diferentes cores ao longo da coluna cromatográfica. Após a passagem de diclorometano, adicionou-se pequenas quantidades de metanol nas seguintes porcentagens: 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30% e 50%. A coluna foi esgotada com uma mistura dos solventes diclorometano 50% e metanol 50%.
Para a escolha do solvente utilizado na eluição da coluna, foi realizada uma cromatografia em camada delgada analítica em cromatofolhas de alúmínio com sílica gel 60 F254 Merck.
3.13. Avaliação do grau de pureza das frações e identificação do metabólito secundário purificado.
Após cada cromatografia de adsorção, usou-se a cromatografia de camada delgada em cromatofolhas de alúmínio com sílica gel 60 F254 Merck, foi utilizada, para analisar a semelhança entre as frações coletadas e o grau de pureza através
do perfil de manchas. Estas manchas foram reveladas por uma solução de vanilina a 2% em ácido sulfúrico concentrado e lâmpada ultravioleta (Aldrich) a 254nm e 365nm.
A pureza das substâncias isoladas nas frações foi também acompanhadas e identificada através de análises de espectrometria de massa do modelo CG/MS – QP – 5050 e espectrômetro de ressonância magnética modelo Elipse (400 MHz para
1H e 100 MHz para 13C).
Figura 7. Passos de extração com solventes orgânicos realizados com o líquen Telochistes flavicans.
4. Resultados
4.1. Atividade larvicida dos homogenatos aquosos de plantas e líquen
A tabela 3 mostra as atividades larvicidas contra A. aegypti de homogenatos de plantas e líquen coletados na região Norte Fluminense. Observa- se que a planta P. quadrangulare e o líquen T. flavicans apresentaram as atividades tóxicas mais elevadas, matando 100% das larvas de A. aegypti.
4.2. Purificação da proteína tóxica de Phoradrendron quadrangulare
O extrato aquoso de P. quadrangulare foi submetido a uma cromatografia de troca iônica utilizando a resina DEAE-Sepharose. O perfil cromatográfico pode ser observado na Figura 8 onde são mostrados dois picos de proteína: um maior, das proteínas não retidas à coluna, e um bem menor, que inclui as proteínas retidas na resina de separação. A atividade larvicida foi detectada no primeiro pico, frações 1 e 2. A fração 1 causou 80% de mortalidade das larvas de A.
aegypti enquanto que a fração 2 causou 20% de mortalidade. As frações 3, 4 e 5, do pico 2, não causaram mortalidade.
Uma outra resina de troca iônica foi utilizadada (CM-Sepharose) como fase estacionária (Fig. 9). Os picos 1 e 2 referem-se às proteínas não retidas, visto que o extrato bruto de P. quadrangulare foi aplicado duas vezes (2 x 4 ml) na coluna.
Observou-se que as frações 3 e 4, presentes no primeiro pico das proteínas retidas, apresentaram atividade larvicida de 80 e 100%, respectivamente. Por sua vez, as frações 1 e 2 (pico não retido) e 5 (pico retido) não apresentaram atividade larvicida. Este procedimento cromatográfico foi repetido várias vezes para verificar a sua reprodutibilidade e acumular material para os próximos passos cromatográficos (Fig. 10) e constatou-se que o segundo pico das proteínas retidas não é sempre observado.
Tabela 3. Atividade larvicida contra Aedes aegypti de homogenatos de 6 plantas e 1 líquen coletados na região Norte Fluminense.
Nome da planta Parte utilizada Atividade larvicida
*
(%)
Telochistes flavicans talos 100
Phoradendron quadrangulare folhas 100
Dalbergia ecastophyllum semente 90
Phoradendron affine folhas 75
Phoradendron crassifolium folhas 15
Sideroxilon obtusifolium folhas 10
Maytenus obtusifolia fruto 05
Dalbergia ecastophyllum folhas 05
*
A atividade larvicida foi observada, na concentração de 7 mg/mL, após 24 h de ensaioFigura 8. Perfil cromatográfico em DEAE-Sepharose do extrato aquoso de Phorandedron quadrangulare. Foram aplicados 10 mg do extrato bruto. A coluna foi equilibrada em tampão Tris-HCl 0.02 M, pH 8.4 contendo uréia 4M, benzamidina 0,01 M e EDTA 0,01 M. A eluição das proteínas foi feita utilizando NaCl 0,25 M (tubos 21-34), 0,5 M (tubos 35-45) e NaCl 1M (tubos 46-55). As frações assinaladas foram testadas nos ensaios larvicidas.
0 1 2 3 4 5
0 10 20 30 40 50 60
Número de frações
Abs a 280 nm
1
2
3
4
5
Figura 9. Perfil cromatográfico de uma CM-Sepharose de extrato aquoso de Phoradendron quadrangulare. Foram aplicados 20 mg do extrato bruto . A coluna foi equilibrada em tampão acetato de sódio 20 mM, pH 4,8, uréia 4 M, benzamidina 0,01 M e EDTA 0,01 M. A eluição foi feita com NaCl 0,25M (tubos 31 ao 45), 0,5M (tubos 46 ao 60), 1M (tubos 61 ao 76). As frações assinaladas foram testadas nos ensaios larvicidas.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Número de frações
Abs a 280 nm
1
3
4
5 2
Figura 10. Perfil cromatográfico de uma CM-Sepharose de extrato aquoso de Phoradendron quadrangulare. Foram aplicados 20 mg do extrato bruto de P.
quadrangulare. A coluna foi equilibrada em tampão acetato de sódio 20 mM pH- 4,8, uréia 4M, benzamidina 0,01 M e EDTA 0,01 M. A eluição foi feita com NaCl 0,25M (tubos 31 ao 45), 0,5M (tubos 46 ao 60), 1M (tubos 61 ao 76). As frações assinaladas foram testadas nos ensaios larvicidas.
0 0,5 1 1,5 2 2,5
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Número de frações
Abs a 280 nm
As frações obtidas da cromatografia de troca iônica foram submetidas à eletroforese. Na Fig. 11 é possível observar uma proteína de aproximadamente 20 kDa (raia 2, pico não retido), e cinco proteínas na raia 3 do pico das proteínas retidas à resina , no qual foi possível detectar a atividade larvicida .
Após a realização da CM-Sepharose, através de dosagens protéicas pode- se observar baixa concentração de proteína no pico 3 (60 µg/mL) no qual foi observada a atividade larvicida, impossibilitando passos posteriores de purificação.
Realizou-se 5 corridas em coluna HiTrap Q, sistema FPLC e foram aplicadas 50 mg de proteína em cada corrida. No perfil cromatográfico pode-se notar a presença de 4 picos, sendo um não retido e três retidos à resina (Fig. 12) . Houve reprodutibilidade dos resultados obtidos nas diferentes repetições (dados não mostrados). Após a reunião dos picos das diferentes corridas, uma alíquota de cada pico foi analisada por eletroforese (Fig. 13). Constatou-se a presença da proteína tóxica na raia 4 referente ao pico 3 da troca iônica.
O pico 3 da cromatrografia de troca iônica (HiTrap Q) foi aplicado a uma resina de fase reversa em coluna C8 (sistema HPLC) (Fig. 14). As frações de cada pico foram reunidas, liofilizadas e analisadas por eletroforese. O perfil protéico pode ser observado na Figura 15. Pode-se notar a proteína de interesse na raia 4.
Figura 11. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 10%, corado com Coomassie, das frações de CM-Sepharose do extrato de Phoradendron quadrangulare. Raia M, Padrão de massa molecular; raia 1, extrato aquoso (100 µg), raia 2, proteína não retida à CM Sepharose (50 µg); raia 3, proteínas eluidas com solução salina da CM Sepharose (50 µg).
Figura 12. Cromatografia de troca-iônica em coluna HiTrap Q (sistema FPLC).
Foram aplicadas 50 mg de amostra precipitada com acetona. A coluna foi equilibrada em tampão acetato de sódio 0,02 M, pH 4,8 , uréia 4M, benzamidina 0,01 M e EDTA 0,01 M, e eluida com gradiente de NaCl (0-0.7M).
0 200 400 600 800
0 20 40 60 80
Número de tubos
mAu
0 20 40 60 80 100
Eluente (%)
2
4 3
1
Figura 13. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 15%, corado com Coomassie, das frações obtidas de troca iônica de extrato bruto Phoradendron quadrangulare. Raia P, padrão de massa molecular; raias 1 e 2, proteínas eluidas do pico 2 (20 µg) da troca iônica (condições desnaturantes e semi-desnaturantes, respectivamente); raias 3 e 4, proteínas eluidas do pico 3 (30 µg) da troca iônica (condições desnaturantes e semi-desnaturantes, respectivamente); raias 5 e 6, proteínas eluidas do pico 3 (10 µg) da troca iônica (condições desnaturantes e semi-desnaturantes, respectivamente); raia 7, proteína de extrato bruto de P. quadrangulare (30 µg). A seta indica a proteína tóxica.
Figura 14. Cromatografia de fase reversa da amostra oriunda da coluna HiTrap. A cromatografia foi realizada em coluna C8 conectada ao sistema ÄKTA.
O eluente foi ácido trifluoracetico 0,01% em acetonitrila 90%.
Figura 15. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 10%
corado com Coomassie das frações obtidas da fase reversa. Raia P, Padrão de massa molecular; raia 1, proteínas correspondentes ao pico 1; raia 2, proteínas correspondentes ao pico 2; raia 3, proteínas correspondentes ao pico 3; raia 4, proteínas correspondentes ao pico 4; raia 5, proteínas correspondentes ao pico 5;
raia 6, proteínas correspondentes ao pico 6.
O extrato bruto de P. quadrangulare foi submetido a uma eletroforese semi- desnaturante em gel de poliacrilamida (Fig. 16) e as 6 bandas majoritárias foram cortadas e eluídas do gel. Após precipitação com acetona e suspensão em água destilada, as proteínas foram utilizadas para a realização do ensaio larvicida.
Apenas a proteína de mais baixa massa molecular, aproximadamente 20 kDa, foi tóxica para o A. aegypti, matando 100% das larvas.
Quatro bandas de proteínas (bandas 3, 4, 5 e 6) foram reaplicadas em gel de poliacrilamida (Fig. 17). Observa-se a presença de várias proteínas em cada uma das raias. O experimento foi repetido em condições desnaturantes (Fig. 18) e novamente mais de uma proteína foi observada no gel.
A banda protéica tóxica, eluída do gel, foi submetida à cromatografia de alta performance em coluna C18. Vê-se a presença de somente um pico majoritário e bem definido, indicativo da pureza da amostra (Fig. 19).
Proteína de 4 géis de poço único foram eluídas e submetidas à cromatografia de fase reversa C18. A proteína do pico majoritário foi seqüênciada na sua região N-terminal. A seqüência obtida foi a seguinte: Ala-Pro-Pro-Gly-Pro- Pro-Gly-X-Pro-Pro. A análise no banco de dados Blast não mostrou homologia da seqüência encontrada com outras proteínas.
Uma curva de atividade larvicida da proteína eluída de oito géis foi obtida (Fig. 20). A DL50 da proteína calculada foi de 6,77 µg/mL.
1 2
4
5 6
Figura 16. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 10% de poço único corado com Coomassie. Foram aplicados 10 mg de proteína de P.
quadrangulare precipitados com acetona. As setas indicam as proteínas eluidas do gel, a proteína com atividade larvicida está indicada pelo número 6.
3
Figura 17. Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida 15%
corado com Coomassie. As bandas protéicas 3 (raia 1), 4 (raia 2), 5 (raia 3) e 6 (raia 4) eluídas do gel da figura 14 foram aplicadas neste gel. Raia M, padrão de massa molecular.
