Nesta secção descreve-se o procedimento utilizado para efetuar o processo de lise alcalina. Para tentar manter a reprodutibilidade entre ensaios usou-se sempre a mesma concentração mássica de células na suspensão a ser lisada. Esta concentração foi escolhida com base num estudo prévio de estabili- dade dos lisados, apresentado no apêndice A.
2É importante notar que a convenção de nomenclatura adotada para os contaminantes presentes no lisado
serve apenas o propósito de os identificar, não procurando efetuar uma análise profunda do grau de hidrofobici- dade dos mesmos.
Na realização do presente trabalho efetuou-se o processo de lise alcalina de forma manual3. O
procedimento usado é uma modificação do método originalmente proposto por Birnboim e Doly[24], e consiste nos seguintes três passos:
1. Ressuspender o pellet de E. coli num volume de tampão de ressuspensão apropriado para obter uma suspensão com uma concentração mássica de 120 g/L (peso húmido). Regra geral, foram ressuspendidas 480 mg de células em 4 mL de tampão de ressuspensão.
2. Adicionar um volume de tampão de lise, agitar de forma suave e incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
3. Adicionar um volume de tampão de neutralização, agitar de forma suave e incubar em gelo du- rante 15 min.
A constituição dos três tampões enunciados, bem como o modo de preparação e de manutenção dos mesmos, foi a seguinte:
Tampão de resuspensão Solução de 50 mM de Tris e 10 mM de EDTA. Ajustar pH para 8.00 através da
adição de HCl. Conservar a temperatura ambiente. Verificar o pH do tampão antes de utilizar.
Tampão de lise Solução de 0.2 M de NaOH e 1 % (w/w) de SDS. Conservar a temperatura ambiente.
Antes de utilizar deve-se verificar a existência de uma possível precipitação de SDS, o que pode acontecer se a temperatura ambiente for reduzida. Em caso de ter ocorrido precipitação deve-se incubar o tampão num banho termostatizado a 37◦C até se verificar a completa dissolução de SDS.
Tampão de neutralização Solução de 3 M de acetato de potássio. Ajustar pH para 5.50 através da adi-
ção de ácido acético glacial. Conservar a 4◦C. Verificar o pH antes de utilizar.
É importante notar que o tampão de ressuspensão não contém RNase, que é por vezes usada para degradar o RNA[91]. Esta opção, como referido no capítulo 1, apresenta algumas limitações do ponto de vista de aplicação industrial e é assim desaconselhável. Para além do estudo prévio anteriormente referido, foi ainda realizado um estudo de caracterização dos lisados centrifugados por cromatografia de exclusão molecular (SEC), eletroforese em gel de agarose (AGE), cromatografia de interação hidro- fóbica (HIC) e de análise ao conteúdo proteico (BCA). Este estudo é descrito apêndice B.
3Naturalmente, de um ponto de vista de aplicação industrial, o processo de lise terá que ser efetuado de forma
automática e de preferência em modo contínuo, sendo relevantes os estudos desenvolvidos por Urthaler et al[26], Meacle et al[27] e Chamsart e Karnjanasorn [90] sobre esta matéria.
Capítulo 4
Desenvolvimento de um modelo para a filtração de
moléculas longas e flexíveis.
O trabalho descrito neste capítulo foi publicado na revista Journal of Membrane Science[64].
4.1
Introdução
O desenvolvimento de modelos de transporte restringido que descrevem a permeação de solutos atra- vés de matrizes porosas tem especial importância na caracterização de membranas e na previsão da seletividade. Modelos em que os solutos são vistos como tendo um comportamento semelhante ao de esferas rígidas (HS), têm vindo a ser utilizados com sucesso para este efeito em operações de microfil- tração, ultrafiltração e nanofiltração. A vantagem da abordagem HS é que para poros com geometria cilíndrica, é possível estimar os coeficientes hidrodinâmicos que contabilizam os efeitos da difusão e convecção restringida no interior dos mesmos[43, 56, 44]. Para os casos em que os efeitos de carga po- dem ser desprezados, isto é, se os solutos forem neutros ou a força iónica da solução for elevada, esta abordagem é suficiente para se obterem previsões satisfatórias das permeações intrínsecas dos solu- tos, com base unicamente em efeitos de exclusão geométricos. Por este motivo, este tipo de modelos têm vindo a ser muito adotados para obter informação sobre a membrana, nomeadamente o tama- nho ou a distribuição de tamanhos de poro[56, 92, 93, 71], e mais recentemente o grau de assimetria [47]. Feita a caracterização da membrana, a abordagem HS permite obter previsões da permeação de solutos a partir dos seus raios hidrodinâmicos. Esta informação é de especial importância para guiar a escolha da membrana a usar em cada aplicação, para interpretar resultados experimentais e para as fases de desenvolvimento, otimização e controlo do processo.
No entanto, a aplicação destes modelos para o estudo da permeação de moléculas lineares de ele- vada massa molecular apresenta severas limitações devido ao desvio do comportamento deste tipo de moléculas à abordagem de esferas rígidas. De facto, sabe-se que macromoléculas lineares apresentam uma elevada permeação através de poros com dimensões muito inferiores. As dimensões deste tipo de solutos são geralmente representadas quer pelo raio hidrodinâmico, rs, quer pelo raio de giração,
rg. É importante notar que estas quantidades devem ser vistas como valores médios, uma vez que a
estrutura deste tipo de moléculas em solução se encontra em constante variação. Uma revisão recente sobre este assunto pode ser encontrada em[59]. A existência de uma elevada permeação deste tipo de solutos em poros com menores dimensões indica com clareza que a abordagem HS é insuficiente para descrever com exatidão as suas permeações em matrizes porosas, o que é especialmente ver- dade para massas moleculares superiores a∼ 1 MDa, e rgna ordem dos 10 nm. Assim, é necessário
desenvolver modelos mais adequados que possam incluir a possibilidade do soluto adotar diferentes conformações ao longo do tempo, e se necessário, os efeitos da deformação molecular induzida pelo fluxo convectivo do solvente através dos poros.
No procedimento convencional para modelar a permeação de moléculas longas e flexíveis, podem ser distinguidas três situações: a permeação na ausência de convecção (transporte exclusivamente por difusão), permeação a fluxos moderados sem existência de deformação molecular e permeação a flu- xos elevados, onde a deformação molecular pode ser significativa[43]. De entre os estudos publicados
nesta temática, é igualmente importante distinguir aqueles em que o rácio entre o raio do soluto e o raio do poro (λs) é inferior a 1, dos estudos em queλs> 1. Para o caso de moléculas lineares, para
valores deλsaté 0.87 existem modelos teóricos disponíveis para prever o transporte restringido de
macromoléculas lineares em poros[94]. No entanto, para valores superiores de λsa modelação das
permeações é mais difícil, especialmente para o caso em queλs> 1 onde a deformação molecular tem
que ser considerada.
Para além do desenvolvimento do modelo de transporte de massa, é necessário igualmente es- timar os coeficientes de partição à entrada do poro. Para isso, foram desenvolvidos métodos esto- cásticos, envolvendo simulações computacionais[79, 81, 80], para evitar a excessiva complexidade de obter uma solução analítica. Nestes algoritmos é estimada a probabilidade de um determinado evento ocorrer, por exemplo, a probabilidade de uma molécula entrar no interior de um poro, testando esse evento um elevado número de vezes (tipicamente, pelo menos 105simulações são necessárias para
obter uma aproximação satisfatória da probabilidade real do evento). A forma como o evento é tes- tado pode ser variada, dependendo do método usado, assim como a estrutura da molécula pode ser representada com um maior ou menor grau de realismo, com importantes consequências em ter- mos do tempo computacional. Para evitar excessivos esforços computacionais, para a representação da estrutura de moléculas flexíveis, podem ser considerados protótipos moleculares que imitam essa mesma estrutura, retendo as características essenciais que determinam a sua permeação através de poros.
A abordagem mais simples para representar a estrutura de uma molécula linear flexível é a re- presentação de cadeias de ligação livre (FJC)[78, 95, 96]. Esta abordagem, assim como outras mais sofisticadas, têm vindo a ser usadas para estudar a possibilidade de macromoléculas adotarem con- formações que lhes permitem entrar em regiões confinadas[79, 81, 80], no entanto nunca para λs 1.
Coeficientes de partição podem ser determinados estimando a probabilidade da molécula adotar tais conformações, assumindo que não ocorre deformação induzida pelo fluxo de solvente. No entanto, em processos de membranas onde a força motriz é a pressão, esta abordagem não deve ser utilizada e é possível provar que as estimativas dela resultantes não estão de acordo com os resultados expe- rimentais. De facto, na área da tecnologia de membranas, esta abordagem tem vindo apenas a ser aplicada no estudo de processos de difusão restringida. No presente capítulo considera-se que os co- eficientes de partição são influenciados pelo fluxo convectivo, sendo a sucção à entrada do poro e a conformação espacial da molécula os fatores que determinam a permeação.
Assim, o objetivo neste capítulo passa por desenvolver um modelo simples, baseado em modelos prévios de transporte restringido em membranas porosas, e por estimar os coeficientes de partição para o caso em queλs 1. O modelo desenvolvido pode assim ser aplicado para a previsão das per-
meações de macromoléculas lineares, representadas por FJCs. A validade do modelo foi testada pelo estudo da permeação de duas moléculas longas através de diferentes membranas. Os solutos testa- dos foram o dextrano T2000 (que tem uma massa molecular de cerca de 2 MDa) e o plasmídeo pUC19 (que tem 2686 pares de bases, e uma correspondente massa molecular de 1.773 MDa) tratado com uma enzima de restrição, que corta a dupla cadeia originando um plasmídeo na isoforma linear.