MATERIAS E MÉTODOS
4.1 Local de realização do experimento
O presente estudo foi realizado no Laboratório de Investigação Médica – LIM08 – Laboratório de Anestesiologia Experimental da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por meio do processo auxílio pesquisa 05/58987-9.
As mensurações de citocinas, assim como a realização do ensaio do burst oxidativo foram efetuados no Laboratório de Farmacologia e Toxicologia do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP.
A técnica de imunoistoquímica foi realizada no Genoa Laboratório de Patologia Molecular e Celular Veterinária.
O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de ética para análise de projeto de pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas e Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
4.2 Animais
Foram utilizados 39 suínos, jovens, fêmeas, pesando entre 30 a 35 Kg, provenientes de granjas de produção comercial e alto padrão sanitário. Antes da inclusão no estudo, realizou-se hemograma completo dos animais na própria granja, sendo descartados aqueles que apresentassem qualquer anomalia.
Destes 39 animais, 9 foram utilizados em estudos pilotos e 30 durante a fase experimental, dos quais em apenas 28 foram coletados todos os parâmetros propostos. Um animal foi descartado após o final do experimento, por apresentar ativação neutrofílica intensa em todos os momentos do estudo. Outro animal apresentou fibrilação ventricular seguido de óbito durante o experimento.
4.3 Procedimentos
Jejum
Os animais foram submetidos a jejum alimentar de 12 horas e hídrico de 3 horas antes do procedimento anestésico.
Procedimento Anestésico
Todos os animais foram pré-medicados com cetamina1 na dose de 5 mg.Kg-1 e midazolam2 na dose de 0,25 mg.Kg-1 via intramuscular. Decorridos 15 minutos, a veia marginal da orelha foi cateterizada com cateter3 20G para administração de fluidoterapia de acordo com o grupo estabelecido. A indução anestésica foi efetuada por meio da administração de propofol4 na dose de 5 mg.Kg-1 pela via intravenosa. Após a intubação orotraqueal dos animais com sonda de diâmetro apropriado, realizou-se a manutenção anestésica com o fornecimento de isofluorano5 na concentração de 1V% administrado por meio de vaporizador calibrado6. Logo após a indução anestésica, foi estabelecida a ventilação controlada na modalidade volume controlado, com volume corrente de 8-10 ml/Kg, fração inspirada de oxigênio de 50% e manutenção da EtCO2
entre 35 e 45 mmHg. O bloqueio neuromuscular foi obtido com a administração de pancurônio7 em bolus na dose de 0,1 mg.Kg-1 IV seguida de infusão contínua deste agente na dose de 5 mcg/Kg.min-1 utilizando-se bomba de infusão para seringas8. A temperatura corporal foi mantida entre 37oC e 38oC por meio da utilização de colchões térmicos9.
1 Cetamina 50mg/ml - Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda 2 Dormonid 5mg/ml - ROCHE Químicos e Farmacêuticos S/A
3 Cateter intravenoso Nipro – Nipro Medical LTDA.
4 Propovan 10mg/ml - Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda 5 Forane 100mg/ml – Abbott Laboratórios do Brasil
6 Cícero; Dräger, Lübeck, Alemanha 7 Pavulon 4mg/ml – Akzo Organon
8 Bomba de Infusão Volumétrica de Seringa ST 690 – Samtronic Infusion Systems 9 Medi-therm II, Gaymar Industries, Orchard Park, NY, USA
Monitoração e Instrumentação
Uma vez que os animais se encontravam em plano de anestesia e, após a infiltração de 5 ml de lidocaína 2% sem vasoconstrictor,10 realizou-se a dissecação da veia jugular direita para introdução de um cateter de artéria pulmonar11 acoplado ao monitor de débito cardíaco. Para isso, os animais foram posicionados em decúbito dorsal e procedeu-se a dissecação da referida veia e introdução do cateter. O cateter de artéria pulmonar foi preenchido com solução salina previamente heparinizada, sendo o transdutor de pressão posicionado ao nível da linha axilar média e zerado à pressão atmosférica. Após observação da curva característica de átrio direito, procedeu-se a insuflação do balão com 1,5 ml de ar, continuando a introdução do cateter no ventrículo direito e artéria pulmonar. O cateter foi fixado quando observou-se o “achatamento da curva” e, portanto a pressão de oclusão da artéria pulmonar foi considerada.
Após a infiltração local de 5 ml de lidocaína 2% sem vasoconstrictor, uma sonda uretral12 no 8 foi introduzida na artéria femoral direita após prévia dissecação sendo acoplada a um transdutor de pressão para obtenção da pressão arterial sistêmica. Para obtenção das pressões foi utilizado monitor multiparamétrico com dois canais de pressão13. A veia femoral direita foi dissecada com subseqüente introdução de uma sonda uretral no 8 para infusão das soluções de reposição durante a hemodiluição. A veia e a artéria femoral do membro contra-lateral foram dissecadas para introdução de sonda uretral no 8 para a retirada do sangue e infusão de fluido durante a hemodiluição.
A bexiga do animal foi acessada por sondagem uretral e um equipo14 foi conectado a sonda para drenagem da urina.
10 Lidoston sem vaso 20mg/ml – Ariston Indústria Química e Farmacêutica Ltda 11 Cateter de Artéria Pulmonar 7.5F, Baxter, Irvine, CA, USA
12 Sonda uretral 08 - Embramed
13 Viridia Modelo 885 – Hewlett-Packard, Andover, MA, USA 14 Equipo macrogotas – Compojet Biomédica Ltda
Para avaliação da ventilação foram mensuradas continuamente a pressão parcial de dióxido de carbono no ar expirado (EtCO2) através do capnógrafo6 e a saturação
periférica da hemoglobina através do oxímetro de pulso posicionado na língua do animal13.
Procedimento de Hemodiluição
Após a instrumentação do animal, procedeu-se a um período de estabilização durante 30 minutos e, então, foram coletados os parâmetros hemodinâmicos e de ventilação, além de amostras de sangue para o estudo da resposta inflamatória. À partir deste ponto, os animais foram randomizados da seguinte maneira:
Grupo I – Controle (C, n = 7): os animais deste grupo não foram submetidos ao procedimento de HNA, sendo apenas anestesiados e instrumentados utilizando como fluidoterapia solução de cloreto de sódio 0,9%15 na taxa de infusão de 5ml/Kg.h-1.
Grupo II – Amido Hemodiluição (HNA + Amido, n = 7): os animais foram submetidos ao procedimento de hemodiluição normovolêmica aguda e a reposição volêmica foi realizada com a solução de amido hidroxietílico 6%16 com peso molecular de 130.000 daltons e grau de substituição de 0,4 na proporção de 1 ml de amido para cada 1 ml de sangue retirado.
Grupo III – NaCl 0,9% Hemodiluição (HNA + NaCl, n = 7): os animais deste grupo foram submetidos ao procedimento de hemodiluição normovolêmica aguda e a reposição volêmica foi realizada por meio de infusão da solução de cloreto de sódio 0,9% na proporção de 3 ml de NaCl 0,9% para cada 1 ml de sangue retirado.
Grupo IV – Gelatina Hemodiluição – (HNA + GEL, n = 7): os animais foram submetidos ao procedimento de hemodiluição normovolêmica aguda e a reposição
15 Cloreto de sódio 0,9% 500 ml - Baxter
volêmica foi realizada por meio da infusão de solução de gelatina fluida modificada 4%17 na proporção de 1 ml de gelatina para cada 1 ml de sangue retirado.
O volume de sangue a ser retirado foi calculado por meio da seguinte fórmula estabelecida por Gross (1983):
V = VES X (Hi – Hd)/ Hm, onde: V = volume de sangue a ser retirado;
VES = volume estimado de sangue (80ml/kg para o suíno adulto); Hi = hematócrito inicial do paciente;
Hd= hematócrito desejado; Hm = média entre Hd e Hi.
Por amostragem sangüínea foi determinado o valor do hematócrito inicial, sendo o valor do hematócrito desejado fixado em 15% (em média 50% do valor inicial).
A retirada de sangue foi realizada em 30 minutos. Simultaneamente a retirada do sangue, foi infundido pelas veias femorais dos animais, amido hidroxietílico 6% (HNA + Amido) ou solução de cloreto de sódio 0,9% (HNA + naCl) ou gelatina (HNA + GEL), todos pré-aquecidos à temperatura de 38oC. Após 15 minutos do início da hemodiluição e no final do procedimento, foi coletado sangue para realização de exame de hematócrito.
O sangue retirado foi acondicionado em bolsa de sangue18 de PVC estéril contendo 63 ml de anticoagulante CPDA-1 com capacidade de 450 ml. Durante a retirada do sangue, a bolsa permaneceu sobre uma balança digital para assegurar a retirada exata do volume calculado. A bolsa foi mantida em temperatura ambiente por um período de até 4 horas. No momento pré-estabelecido, o sangue previamente
17 Gelafundin, BBraun, Melsungen, Germany
coletado foi infundido no animal, completando assim, a técnica de hemodiluição normovolêmica aguda.
Independente do grupo, a fluidoterapia de manutenção foi realizada por meio da administração da solução de cloreto de sódio 0,9% na taxa de 5 ml/Kg.h-1 utilizando bomba de infusão.
Quando a pressão arterial média atingiu valores inferiores a 60 mmHg, procedeu- se a utilização da solução de cloreto de sódio 0,9% na taxa de 10 ml/Kg/hora durante 10 minutos com posterior aumento para 20 ml/Kg/hora por mais 10 minutos, caso não houvesse o restabelecimento da pressão arterial.