Resposta Inflamatória Mecanismos da Resposta Imune

Em indivíduos saudáveis a proteção contra a invasão de microorganismos ocorre através da ativação simultânea e inter-relacionada do sistema imune, que compreende a resposta natural (inata ou inespecífica) que é inespecífica e indiferente à natureza antigênica do microorganismo e a resposta adquirida (adaptativa ou específica) (Heeg, Dalpke, 2003).

O sistema imune inato é compreendido por substâncias solúveis como a resposta humoral que inclui o sistema complemento, proteínas de fase aguda e citocinas e, também por elementos celulares, incluindo monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e células natural “killer”. O sistema imune inato é o responsável por deflagrar a resposta imune adquirida (Bochud, Calandra, 2003).

Agindo de forma integrada e auto-regulada as respostas imunes inata e adquirida promovem o combate à invasão de microorganismos, limpeza de restos teciduais, remodelagem tecidual com proliferação celular e ação angiogênica para o restabelecimento da matriz lesada, promovendo a recuperação do hospedeiro e reduzindo a probabilidade de infecção secundária ou oportunista (Oberholzer et al., 2000; Ayala et al., 2003). A inabilidade na auto-regulação ou desequilíbrio na reação inflamatória pode resultar em crescimento bacteriano incontrolável promovendo episódios de infecções recorrentes ou resposta inflamatória intensa com lesão tecidual, colapso vascular ou falência de múltiplos órgãos ou mesmo reposta hipoinflamatória promovendo a supressão imunológica (Ayala et al., 2003).

Os macrófagos e neutrófilos do sistema imunológico inato formam a primeira linha de defesa contra microrganismos comuns e são essenciais para o controle das infecções bacterianas habituais. Estas células desempenham papel crucial na iniciação e no posterior direcionamento da resposta imune adaptativa (Janeway et al., 2002).

Constantemente, um alto número de polimorfonucleares é liberado da medula óssea para a corrente sangüínea (Shi et al., 2001). Esse número, associado ao poder citotóxico destas células, requer controle preciso para que não ocorram danos teciduais por auto-agressão. Essas células apresentam vida média na circulação de seis horas e, depois deste período, migram para os tecidos ou locais de infecção (Ogura et al., 1999; Shi et al., 2001). O processo de morte celular dos polimorfonucleares, por apoptose e

posterior fagocitose pelos macrófagos, impede que haja liberação de substâncias citotóxicas contidas nessas células, evitando lesões orgânicas (Ogura et al., 1999).

Além da fagocitose, os macrófagos e neutrófilos também produzem uma variedade de ERO´s em resposta a substâncias estimulantes de membrana destes leucócitos por meio da atividade da enzima Nicotinamida-Adenina Dinucleotídeo Fosfato Oxidase (NADPH oxidase). Os mais importantes são o peróxido de hidrogênio (H2O2), o ânion superóxido (O2-), oxigênio singlet (1O2) e o radical hidroxila (OH-).

Estes produtos são resultantes de uma seqüência de reações bioquímicas de alto consumo de oxigênio denominado burst oxidativo (Figura 1) (Massoco, 2005). Uma vez estimulados, a maior parte do oxigênio consumido pelos neutrófilos é convertido em ânion superóxido pela enzima NADPH oxidase (Park, Babior, 1997).

A produção das espécies reativas de oxigênio inicia-se com a redução do oxigênio a superóxido, com a NADPH atuando como doador de elétrons. Desta maneira, a produção de NADPH constitui etapa limitante do processo de produção de espécies reativas de oxigênio pelo neutrófilo (Park, Babior, 1997; Park et al., 1997). O ânion superóxido produzido sob estímulo dos neutrófilos é rapidamente convertido em H2O2 e

radical hidroxil, que contribuem para a atividade microbicida dentro do fagolissomo e no meio extracelular. A quantidade de H2O2 não é suficiente para eliminar totalmente as

bactérias e outros microorganismos. Contudo, a enzima mieloperoxidase produzida nos grânulos azurofílicos dos neutrófilos, quando combinada ao H2O2 gera hipoclorito, que

apresenta atividade antimicrobiana mais eficaz. O ânion superóxido também pode ser produzido pela ciclooxigenase como parte do metabolismo do ácido aracdônico (Magder, 2006).

Em baixos níveis, os radicais livres podem atuar amplificando a cascata da resposta inflamatória, favorecendo assim a reparação das lesões. No entanto, quando

presentes em níveis muito elevados, podem induzir a lesão de células endoteliais e de outros tipos celulares agravando o dano e a lesão inicial (Janeway et al., 2002). As espécies reativas de oxigênio têm a capacidade de influenciarem várias vias de sinalização intercelular, fundamentais para o crescimento celular normal e para a resposta inflamatória, sob condições fisiológicas e patofisiológicas, sendo que a liberação exacerbada destes radicais pode causar dano tecidual e morte celular (Finkel, 1998; Thannickal, Fanburg, 2000; Finkel, Holbrook, 2000; Forman et al., 2002; Droge, 2002). Apesar das EROs serem potencialmente tóxicas, são fatores essenciais no metabolismo normal (Magder, 2006).

Figura 1: Reação representativa do burst oxidativo. Fonte: Adaptado de Magder, 2006.

Através da produção de enzimas anti-oxidantes como a superóxido desmutase, catalase e glutationa peroxidase-desmutase, os neutrófilos protegem-se dos efeitos nocivos das espécies reativas de oxigênio. A superóxido desmutase catalisa a reação de dois ânions superóxido e dois H+ para H2O2 (reduzido) e O2 (oxidado) (Magder, 2006).

O peróxido de hidrogênio não é por si só considerado um radical, mas é considerado uma espécie reativa de oxigênio. É considerado mais estável que o ânion superóxido e pode difundir-se através das membranas. Na presença do íon Ferro, o H2O2 pode ser

reduzido para o radical reativo OH-.

Trabalhos demonstram que as ERO´s participam dos processos de inflamação, morte celular e tecidual, transformação neoplásica, aterosclerose e envelhecimento (Ley, Arfors, 1982; Hammond, Hess, 1985). As espécies reativas de oxigênio geradas pelos neutrófilos desempenham um papel importante como oxidantes microbicidas, ou como mediadores da inflamação e da lesão tecidual (Babior et al., 1995).

Neutrófilo

O2 ânion superóxido H2O2 e radical hidroxil

Um dos maiores efeitos tóxicos da produção excessiva de ERO´s é o dano na membrana celular pelo processo de peroxidação lipídica. As ERO´s atacam os grupos de carbono das moléculas lipídica, criando uma reação que altera a forma da membrana. O resultado é a desregulação do cálcio, essencial para a sinalização intercelular. A peroxidação lipídica também pode alterar o DNA e as proteínas celulares (Magder, 2006). A regulação dos níveis intra e extracelulares de O2- e H2O2 promove a

sinalização dos mecanismos celulares. Nesta situação, as ERO´s não são espécies destrutivas, mas reguladores do processo metabólico normal (Finkel, 1998; Finkel, Holbrook, 2000). As ERO´s também possuem importante função na sinalização intracelular do TNF-α, que ocorre através da produção do ânion superóxido produzido pela NADPH oxidase e envolve a regulação da atividade transcricional do NF-kB (Ferro et al., 1997; Lum, Roebuck, 2001).

A porcentagem de células que realizam fagocitose, a quantidade de bactérias internalizadas, além dos derivados ativos de oxigênio gerados durante a fagocitose e o

burst oxidativo são de grande interesse no estudo da atividade microbicida e do metabolismo oxidativo dos leucócitos (Massoco, 2005).

A citometria de fluxo é um método conveniente e prático para estudar o burst oxidativo celular quando comparado com outras técnicas bioquímicas. O burst oxidativo expresso na geração de peróxido de hidrogênio, pode ser monitorado quantitativamente por citometria de fluxo usando-se como reagente o 2´7´diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA), o Staphylococcus aureus marcado com iodeto de propídeo e o miristato-acetato de forbol (PMA) (Hasui et al., 1989; Raidal et al., 1998). O método fluorométrico para mensuração do peróxido de hidrogênio é baseado na oxidação do DCFH-DA não fluorescente, pelo peróxido de hidrogênio e pela peroxidase, que o transforma em um composto fluorescente, o 2´7´diclorofluoresceína.

Este composto é polar e não pode se difundir para fora da célula. Por este motivo, é possível detectar a oxidação do DCFH-DA nos neutrófilos e macrófagos utilizando-se análises unicelulares pela citometria de fluxo (Caldwell, Taylor, 1986). O PMA é um estímulo extremamente forte para os neutrófilos, pois atua na enzima fosfoquinase C (PKC). O PMA entra no neutrófilo, liga-se a Proteína Kinase C (PKC) no citoplasma e estimula o sistema NADPH oxidase (Zhao et al., 2003).