4.2. Experimental
4.2.3. Método de RMN de 1 H
Soluções
Solução estoque de octametilciclotetrasiloxano (OMCTS) em CDCl3 (5,44
mg mL-1) e solução estoque da mistura de citronelal (98,56 mg mL-1), de citronelol
(109,0 mg mL-1) e de geraniol (108,0 mg mL-1) em CDCl
3 foram preparadas para
determinar linearidade, estabilidade de citronelal, de citronelol, de geraniol e de OMCTS em solução, e robustez do método.
Solução de OMCTS em CDCl3 (5,59 mg mL-1) e solução estoque da
mistura de citronelal (104,0 mg mL-1), de citronelol (111,0 mg mL-1) e de geraniol
(107,0 mg mL-1) em CDCl
3 foram preparadas para determinar a repetibilidade e a
exatidão/precisão do método.
Soluções estoque da mistura de citronelal (104,6 mg mL-1), de citronelol
(103,6 mg mL-1) e de geraniol (101,8 mg mL-1) em CDCl3 e do padrão interno
OMCTS em CDCl3 (7,12 mg mL-1) foram preparadas para determinar os limites de
Solução estoque do padrão interno OMCTS em CDCl3 (4,00 mg mL-1) foi
preparada para quantificação de citronelal, de citronelol e de geraniol nos óleos essenciais.
Para preparar todas as soluções, os óleos e reagentes foram pesados diretamente nos frascos e tampados com septos de teflon. Clorofórmio deuterado foi adicionado aos frascos utilizando seringa cromatográfica.
Instrumentação
Todas as análises foram realizadas em um espectrômetro Varian Mercury 300 MHz, equipado com uma sonda de dois canais (1H-13C) de banda larga de 5
mm, unidade geradora de campo e unidade de controle de temperatura.
Condições experimentais
O pulso de 45° (pw45) foi determinado para todas as amostras usando a sequência de calibração implementada pelo programa VnmrJ4.2 da Agilent Technologies. O tempo de relaxação longitudinal (T1) foi determinado pela sequência de inversão recuperação para todos os hidrogênios do citronelal, do citronelol, do geraniol e do padrão OMCTS. O mais longo T1 obtido para validação e para quantificação das amostras de óleos essenciais foi de 7 s. Os experimentos foram realizados utilizando a temperatura da sonda de 25 °C, número de transientes (nt) de 16, número de pontos no FID (np) de 32768, largura do pulso (pw) de 45°, sem rotação de amostra, largura espectral (sw) de 4800,8 Hz, tempo de aquisição (aq) de 4,555 s, tempo de atraso (d1) de 5 vezes T1 entre os pulsos foi usado para garantir a relaxação completa dos átomos de hidrogênio (Caligiani et al., 2007; Parikh e Gadape, 2011; Santos e Colnago, 2013). O
shimming foi realizado no modo automático para todos os experimentos e a
largura a meia altura do sinal do clorofórmio foi sempre inferior a 0,7 Hz.
A robustez do método foi avaliada pela aquisição de espectros com 16 scans (nt) a 25 °C e com 8 scans, sem controle de temperatura.
Os espectros foram processados usando o programa MestReNova 9.0.1. com correção automática de linha de base empregando o ajuste polinomial de Bernstein e ampliação da linha espectral (lb) de 0,3 Hz. Correção de fase e integração dos espectros foram realizadas manualmente. O FID foi processado
usando 64 K e preenchimento com zeros (Forshed et al., 2005; Parikh e Gadape, 2011).
Validação do método de RMN de 1H
Para validação do método de RMN de 1H desenvolvido, foram avaliados os
parâmetros especificidade e seletividade, linearidade, robustez, repetibilidade, exatidão/precisão, estabilidade dos analitos e do padrão interno em solução e limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) (Parikh e Gadape, 2011; INMETRO, 2011; Bharti e Roy, 2012).
Especificidade, seletividade e linearidade
A especificidade e seletividade do método proposto foi avaliada pela ausência de sobreposição de pelo menos um sinal de citronelal, de citronelol e de geraniol com sinais dos outros constituintes do óleo essencial, do CHCl3 (presente
no solvente CDCl3) e do padrão interno OMCTS no espectro de RMN de 1H. A
linearidade foi checada pela adição a 7 tubos de RMN de uma quantidade de citronelal, de citronelol e de geraniol variando de 5,0 a 35,0 mg. Os volumes da mistura de citronelal (98,56 mg mL-1), de citronelol (109,0 mg mL-1) e de geraniol
(108,0 mg mL-1) em CDCl
3 adicionados aos tubos foram de 50, 100, 150, 200,
250, 300 e 350 µL que correspondem às massas de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35 mg de citronelal, de citronelol e de geraniol. A cada um desses tubos, foram adicionados 250 µL (1,36 mg) da solução estoque de OMCTS em CDCl3 a uma concentração de 5,44 mg mL-1 e clorofórmio deuterado a 20 °C para
completar o volume para 600 µL. Todas as transferências de volume foram realizadas usando seringas cromatográficas. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Os sinais em 9,75 e 3,61-3,74 ppm, do citronelal e do citronelol, respectivamente e, os sinais em 5,36-5,42 e 4,13 ppm do geraniol foram integrados e usados para fazer um gráfico no programa OriginPro8. Para cada um destes sinais, foi obtida uma curva de linearidade usando a quantidade de citronelal, de citronelol e de geraniol esperada (mg) versus a quantidade (mg) destes compostos obtida dos espectros de RMN de 1H utilizando a Equação 4.1
(Parikh e Gadape, 2011; Santos e Colnago, 2013; Cerceau et al., 2016a; Cerceau et al., 2016b).
m
x=
Ix IOMCTS×
NOMCTS Nx×
Mx MOMCTS× m
OMCTS (Equação 4.1)Onde, mx = quantidade de citronelal, de citronelol ou de geraniol encontrada; Mx =
massa molecular de citronelal (154,25 g mol-1), de citronelol (156,27 g mol-1) ou de
geraniol (154,25 g mol-1); M
OMCTS = massa molecular do
octametilciclotetrasiloxano (296,62 g mol-1); m
OMCTS = massa do
octametilciclotetrasiloxano, Ix = área da integral do sinal no espectro de RMN de 1H usado para quantificação dos compostos citronelal (δ = 9,75), citronelol (δ =
3,61-3,74) ou geraniol (δ = 5,36-5,42 e δ = 4,13); IOMCTS = 1000; NOMCTS = número
de átomos de hidrogênio presentes no octametilciclotetrasiloxano; Nx = número de
átomos de hidrogênio que correspondem ao sinal no espectro de RMN de 1H
usado para quantificação dos compostos citronelal, citronelol ou geraniol.
Robustez
A robustez foi avaliada pelos espectros de RMN de 1H adquiridos com
número de transiente (nt) de 16 e temperatura controlada a 25 °C e com nt de 8, sem controle de temperatura. A determinação da robustez do método foi realizada usando os tubos de RMN contendo aproximadamente 15 mg de citronelal, de citronelol e de geraniol, preparados para determinação da linearidade.
Os sinais em 9,75 e 3,61-3,74 ppm do citronelal e do citronelol, respectivamente, e os sinais em 5,36-5,42 e 4,13 ppm do geraniol foram integrados e os resultados foram expressos como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV), obtidos pela Equação 4.2 (Parikh e Gadape, 2011; Santos e Colnago, 2013; Cerceau et al., 2016a; Cerceau et al., 2016b).
)*+ = ,- = ./
Onde, DPR = desvio padrão relativo entre as massas, observado nas triplicatas, CV = coeficiente de variação, 31 = média dos valores entre as massas observadas nas triplicatas, DP = desvio padrão entre as massas observadas nas triplicatas.
Os resultados obtidos nos espectros de RMN de 1H adquiridos com nt de
16 e temperatura controlada a 25°C e com nt de 8, sem controle de temperatura foram comparados e a diferença entre eles foi expressa em percentagem (%D), conforme Equação 4.3 (Parikh e Gadape, 2011; Cerceau et al., 2016a; Cerceau et
al., 2016b).
%) = 4 45
$ 100 (Equação 4.3)
Onde, %D = diferença em percentagem entre a massa observada no espectro adquirido usando nt = 16 e temperatura de 25 °C e a massa observada no espectro adquirido usando nt = 8, sem controle de temperatura; mxi = massa
observada no espectro adquirido usando nt = 16 e temperatura de 25 °C e mxt =
massa observada no espectro adquirido usando nt = 8, sem controle de temperatura.
Repetibilidade
A repetibilidade do método foi checada 15 dias após a determinação da linearidade pela realização de um experimento similar, pelo mesmo analista, usando o mesmo laboratório e equipamento. Os sinais em 9,75 e 3,61-3,74 do citronelal e do citronelol, respectivamente, e os sinais em 5,36-5,42 e 4,13 ppm do geraniol foram integrados para avaliação da repetibilidade do método e os resultados foram expressos como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV).
Exatidão e estabilidade
A exatidão foi avaliada no mesmo experimento que a linearidade do método. O método analítico proposto para análise de um composto de pureza conhecida (citronelal 96%, citronelol 95% e geraniol 97%) foi usado. A pureza experimental (PE) foi calculada usando a Equação 4.4 e a exatidão usando a
Equação 4.5 (Parikh e Gadape, 2011; Santos e Colnago, 2013; Cerceau et al., 2016a; Cerceau et al., 2016b).
PE= Ix IOMCTS× NOMCTS Nx × Mx MOMCTS× mOMCTS m ×POMCTS (Equação 4.4)
Onde: MOMCTS = massa molecular de octametilciclotetrasiloxano (296,62 g mol-1); Mx = massa molecular do citronelal (154,25 g mol-1), do citronelol (156,27 g mol-1)
ou do geraniol (154,25 g mol-1); mOMCTS = massa de octametilciclotetrasiloxano
(em g); Ix = área medida pela integração do sinal de interesse no espectro de RMN de 1H do citronelal, do citronelol ou do geraniol; IOMCTS = 1000; NOMCTS = 24
(número de átomos de hidrogênio presentes no octametilciclotetrasiloxano); Nx = número de átomos de hidrogênio do sinal de interesse no espectro de RMN de 1H
do citronelal, do citronelol ou do geraniol; m = massa de citronelal, de citronelol ou de geraniol (em g); POMCTS = pureza do octametilciclotetrasiloxano (98%) informada pelo fabricante; PE = pureza calculada do citronelal, do citronelol ou do geraniol (em %m/m).
Exatidão (%) = PE
PF ×100 (Equação 4.5)
Onde: PE = pureza experimental; PF = pureza informada pelo fabricante.
A estabilidade dos analitos e do padrão interno em solução foi avaliada usando os tubos de RMN contendo aproximadamente 20 mg de citronelal, de citronelol e de geraniol (como descrito na determinação da linearidade). As análises foram realizadas a 25 °C com intervalos de tempo de 0 (inicial), 6, 12, 18 e 24 horas. Os sinais em 9,75 e 3,61-3,74 ppm do citronelal e do citronelol, respectivamente, e os sinais em 5,36-5,42 e 4,13 ppm do geraniol foram integrados para determinação da quantidade destes compostos em cada intervalo de tempo, de acordo com a Equação 4.1. Os resultados foram expressos como coeficiente de variação (CV) e como %D.
Limites de quantificação e de detecção
Os limites de quantificação (LQ) e de detecção (LD) foram determinados experimentalmente. Volumes apropriados da solução contendo uma mistura de citronelal (98,09 mg mL-1), de citronelol (103,6 mg mL-1) e de geraniol (101,8 mg
mL-1) em CDCl
3 correspondendo a 0,10; 0,50; 1,00; 2,50 e 5,00 mg de citronelal,
de citronelol e de geraniol foram adicionados aos tubos de RMN. A cada um desses tubos foram adicionados 250 µL (1,15 mg) da solução estoque de OMCTS
em CDCl3 na concentração de 4,6 mg mL-1, seguido por clorofórmio deuterado a 20
°C para completar o volume para 600 µL. Os espectros de RMN de 1H da mistura
foram obtidos e os sinais em 9,75 e 3,61-3,74 ppm referentes ao citronelal e ao citronelol, respectivamente, e os sinais em 5,36-5,42 e 4,13 ppm correspondentes ao geraniol foram integrados em relação ao sinal do padrão interno (0,10 ppm) e a quantidade de citronelal, de citronelol e de geraniol contidas em cada tubo foi determinada conforme equação 4.1. Para determinação de LQ, a razão sinal ruído superior a 150 foi utilizada para garantir que os resultados fossem obtidos com uma incerteza menor que 1% (Holzgrabe, 2010). Os experimentos foram realizados em triplicata.
Quantificação de citronelal, de citronelol e de geraniol em óleos essenciais comerciais de citronela usando RMN de 1H
Para quantificação, quantidades exatas (54,0 a 61,0 mg) de cada amostra de óleo essencial foi pesada diretamente nos tubos de RMN. A estes tubos foram adicionados 250 µL (1,00 mg) da solução estoque de OMCTS 4,00 mg mL-1 e o
volume foi completado para 600 µL pela adição de CDCl3 a 20 ºC. As amostras
foram quantificadas em triplicata. Os espectros de RMN de 1H foram obtidos e o
sinal do OMCTS (0,10 ppm) foi integrado e arbitrariamente atribuído o valor de 1000 usando o programa MestReNova 9.0.1. Os sinais em 9,75 e 3,61-3,74 ppm do citronelal e do citronelol, respectivamente, e os sinais em 5,36-5,42 e 4,13 ppm do geraniol foram integrados e os valores das integrações foram usados para calcular a quantidade destes compostos de acordo com a Equação 4.1.
4.2.4. Métodos cromatográficos
Soluções
Solução estoque da mistura de citronelal (15,7 mg mL-1), de citronelol (17,5
mg mL-1) e de geraniol (17,2 mg mL-1) em diclorometano e solução estoque do
padrão interno octadecano (32,4 mg mL-1) em diclorometano foram preparadas
para realização dos experimentos de cromatografia gasosa utilizando padronização interna (CG-PI).
Para identificar os constituintes das amostras usando CG-EM, aproximadamente 10 mg de cada amostra foram dissolvidas em 1,00 mL de diclorometano.
Instrumentação
Cromatografia gasosa-espectrometria de massas (CG-EM)
A identificação dos constituintes dos óleos essenciais foi realizada utilizando um cromatógrafo a gás (Shimadzu, modelo 17A) equipado com uma coluna capilar de sílica fundida (RTX-5MS-Restek; 30 m x 0,25 mm d.i e espessura do filme de 0,25 µm) conectado a um detector por espectrometria de massas (Shimadzu, modelo QP5050A).
Cromatografia gasosa com detecção por ionização em chamas (CG-DIC)
A quantificação das amostras pelo método de cromatografia gasosa usando normalização de áreas (CG-N) foi realizada utilizando o cromatógrafo a gás Shimadzu, modelo 17A, conectado ao detector por ionização em chamas (CG-DIC) equipado com uma coluna capilar de sílica fundida (SBP5-Supelco, 30 m x 0,25 mm d.i e 0,25 µm de espessura de filme).
Condições experimentais CG-EM
A temperatura do forno foi programada para variar de 40 °C (2 min) a 200°C a uma taxa de 3 °C min-1. O injetor e o detector foram mantidos a 200 e
240 °C, respectivamente. O gás de arraste utilizado foi o nitrogênio a uma taxa de fluxo de 1,8 mL min-1. A quantidade de 1,0 µL (solução do óleo essencial 1% m/v
Os compostos foram identificados pelo tempo de retenção, pela comparação de seus espectros de massas com os espectros da base de dados do equipamento CG-EM (Willey 7 ed.; Nist 5 ed., Nist 8 ed. e Nist 11 ed.) e também comparando o índice aritmético calculado da injeção da mistura de alcanos lineares (C9 a C40) com os dados descritos na literatura (Martins et al., 2006; Barbosa et al., 2008; Adams, 2012).
CG-DIC
A temperatura da coluna foi programada para variar de 40 °C (4 min) a 200 °C a uma taxa de 3 °C min-1. O injetor e o detector foram mantidos a 200 e 240
°C, respectivamente. O gás de arraste utilizado foi o nitrogênio a uma taxa de fluxo de 1,8 mL mL-1. A quantidade de 1,0 µL (solução do óleo essencial 1% m/v
em diclorometano) foi injetada na razão de split foi de 1:5.
Quantificação de citronelal, de citronelol e de geraniol em óleo essencial usando CG-DIC
A quantificação de citronelal, de citronelol e de geraniol nos óleos essenciais comerciais de citronela usando cromatografia gasosa foi realizada utilizando os métodos de normalização de áreas (CG-N) e de padronização interna (CG-PI).
Normalização (CG-N)
Aproximadamente 10 mg dos óleos essenciais foram pesadas em vials aos quais foi adicionado 1,00 mL de diclorometano. As análises foram realizadas em triplicata nas condições previamente descritas. O conteúdo de citronelal, de citronelol e de geraniol nos óleos esssenciais foi calculado pela percentagem da área do pico destes compostos em relação a área total do cromatograma.
Padronização interna (CG-PI)
Uma curva analítica foi construída para cada constituinte a ser quantificado nos óleos essencias de citronela. Para isso, citronelal (0,39 a 7,84 mg mL-1),
adicionados a 7 balões volumétricos de 2,00 mL. Os volumes da solução contendo a mistura de citronelal (15,7 mg mL-1), de citronelol (17,5 mg mL-1) e de
geraniol (17,2 mg mL-1) em diclorometano adicionados aos tubos foram de 50,
100, 200, 400, 600, 800 e 1000 µL que correspondem à concentrações de 0,39; 0,78; 1,57; 3,14; 4,70; 6,27 e 7,84 mg mL-1 para citronelal, de 0,44; 0,88; 1,75;
3,50; 5,26; 7,01 e 8,76 mg mL-1 para citronelol e de 0,43; 0,86; 1,73; 3,45; 5,18;
6,90 e 8,63 mg mL-1 para geraniol. A cada um desses tubos, foram adicionados
200 µL (3,24 mg mL-1) da solução estoque de octadecano em diclorometano a
uma concentração de 32,40 mg mL-1 e diclorometano a 20 °C para completar o
volume para 2000 µL.
As equações das curvas analíticas (y = 0,1726X + 0,0345, r = 0,9988; y = 0,1951X + 0,0188, r = 0,9995 e y = 0,2053X - 0,0431, r = 0,9997, para citronelal, citronelol e geraniol, respectivamente) foram obtidas pela razão entre a área do pico correspondente ao analito e a área do pico referente ao padrão interno vs. concentração analito (em mg L-1).
Para determinar o teor de citronelal, de citronelol e de geraniol usando CG- PI, aproximadamente 19 a 22 mg dos óleos essenciais foram pesadas diretamente nos balões volumétricos de 2,00 mL aos quais foram adicionados, 200 µL da solução estoque de octadecano (32,40 mg mL-1) e diclorometano até
completar o volume. As amostras foram analisadas em triplicata em condições previamente descritas.
4.3. Comparação entre os métodos de quantificação
Uma comparação entre os métodos (CG-N, CG-PI e RMN de 1H) utilizados
para quantificação de citronelal, de citronelol e de geraniol nos óleos essenciais comerciais de citronela foi realizada, utilizando um delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (8x3), sendo oito óleos e três métodos. Foram realizadas análises de variância (ANOVA) e teste de Tukey de acordo com a significância da interação, usando o Programa R 3.0.3 com intervalo de confiança de 95% (α = 0,05).
4.4. Resultados e discussão
De acordo com a Farmacopeia Britânica (1998) o controle de qualidade dos óleos essenciais de citronela envolve a determinação da densidade relativa, do índice de refração e da rotação óptica desses óleos. Além disso, o conteúdo dos constituintes majoritários citronelal, citronelol e geraniol deve ser determinado pela técnica de cromatografia gasosa acoplada ao detector por ionização em chamas utilizando o procedimento de normalização de áreas (CG-N). Entretanto, o método de CG-N pode levar a erros de integração uma vez que, o teor de um composto é determinado levando em consideração à área do pico referente ao composto de interesse em relação à área de todos os picos do cromatograma. Assim, ao selecionar os parâmetros para integração, alguns picos podem ser incluídos ou excluídos, interferindo nos resultados.
Dessa forma, neste trabalho, um método para determinação simultânea de citronelal, de citronelol e de geraniol em óleos essenciais comerciais de citronela usando RMN de 1H foi desenvolvido e validado e os resultados obtidos foram
comparados aos obtidos pelos métodos cromatográficos usando normalização de áreas (CG-N) e padronização interna (CG-PI).
Para avaliar a eficiência do método de RMN de 1H desenvolvido, oito
amostras de óleos essenciais de citronela puros e três óleos formulados, de diferentes marcas, foram adquiridos no mercado brasileiro. Conforme esperado, a análise dos parâmetros índice de refração (Dados Suplementares 3, Tabela S3.36) e densidade relativa (Dados Suplementares 3, Tabela S3.37) permitiu uma distinção entre os óleos essenciais puros e os formulados, de acordo com os limites estabelecidos da Farmacopeia Britânica (1998), que variam de 1,463 a 1,475 e de 0,881 a 0,895, respectivamente. Isso porque que os valores de índice de refração e de densidade relativa dos óleos puros estavam dentro dos limites estabelecidos pela Farmacopeia, enquanto, nos óleos formulados, os valores obtidos excederam estes limites. Entretanto não foi possível estabelecer uma diferença entre óleos puros e formulados levando em consideração o parâmetro rotação óptica, já que os resultados obtidos para os dois tipos de óleo estão de acordo com a Farmacopéia Britânica (entre -4 ° e +1,5 °), com exceção do óleo puro C6, que apresentou rotação optica de +1,63 ° (Ver Dados Suplementares 3, Tabela S3.35). Esse comportamento provavelmente ocorrerá quando o aditivo
usado nos óleos formulados for opticamente inativo e não afetar a rotação óptica desses óleos essenciais.
4.4.1. Desenvolvimento e validação do método de RMN de 1H
O método de RMN de 1H desenvolvido para determinação simultânea de
citronelal, de citronelol e de geraniol em óleos essenciais comerciais de citronela foi validado de acordo com as recomendações do guia “Orientações sobre Validação de Ensaios Químicos DOQ-CGCRE-008" publicado pelo INMETRO, conforme exigido pela legislação brasileira (INMETRO, 2011). Uma vez que esta resolução não estabelece limites para avaliar os parâmetros de validação, a Resolução RE 899 - Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos, aprovada pelo Conselho da ANVISA (AVISA, 2003) e as recomendações da Associação Brasileira de Normas Técnicas (NBR-14029) Agrotóxicos e afins - Validação de Métodos Analíticos (ABNT, 2005) também foram utilizadas.
Inicialmente, o espectro de RMN de 1H da mistura de citronelal (96%), de
citronelol (95%) e de geraniol (97%), contendo aproximadamente 20 mg de cada constituinte, foi obtido. Como esperado, os sinais dos hidrogênios de alqueno dos três compostos, multipleto em 5,04-5,12 ppm referente aos H-5 do citronelal, do citronelol e do geraniol, apareceram sobrepostos (Figura 4.4). O tripleto em 9,75 ppm referente ao hidrogênio do aldeído (H-10) do citronelal, o multipleto em 3,61- 3,74 ppm (H-10) do citronelol, o multipleto em 5,36-5,42 ppm e o dupleto em 4,13 ppm (H-1 e H10, respectivamente) do geraniol, apareceram em uma região distante dos outros sinais. Os demais sinais no espectro de RMN de 1H dos três
compostos foram observados em uma região propensa à sobreposição com outros sinais no espectro (Figura 4.4). Assim, em princípio, os quatro sinais listados acima podem ser utilizados para fins de quantificação e, portanto, foram utilizados para validar o método.
A especificidade e a seletividade do método de RMN de 1H foram
comprovadas pela ausência de sobreposição dos sinais em δ = 9,75; δ = 3,61- 3,74 do citronelal e do citronelol, respectivamente, e dos sinais δ = 5,36-5,42 e δ = 4,13 do geraniol com os sinais de CDCl3 e de OMCTS (Figura 4.4).
Figura 4.4. Espectro de RMN de 1H da mistura de citronelal, de citronelol e de
geraniol, contendo o padrão interno octametilciclotetrasiloxano (OMCTS) (300 MHz, em CDCl3).
A linearidade do método foi avaliada para os sinais δ = 9,75 do citronelal, δ = 3,61-3,74 do citronelol e δ = 5,36-5,42 e δ = 4,13 do geraniol, obtidos no espectro de RMN de 1H da mistura destes compostos, em diferentes quantidades,
contendo OMCTS (Figura 4.4). Após os espectros serem processados, o sinal referente ao padrão interno OMCTS foi integrado e atribuído o valor de 1000. A seguir, os sinais do citronelal, do citronelol e do geraniol foram integrados em relação ao sinal do OMCTS (Figura 4.5). Pela substituição dos valores obtidos da integração dos sinais destes compostos na Equação 4.1, foi possível determinar a quantidade de citronelal, de citronelol e de geraniol contida em cada um dos tubos de RMN usados para determinação da linearidade. Uma curva de linearidade foi então construída plotando um gráfico da quantidade observada vs. quantidade esperada de citronelal (δ = 9,75), de citronelol (δ = 3,61-3,74) e de geraniol (δ = 5,36-5,42 e δ = 4,13) (Figura 4.6). Para todos estes sinais, os coeficientes de
correlação obtidos foram superiores ao critério mínimo estabelecido pela Resolução RE 899 (r ≥ 0,99) (Figura 4.6).
Figura 4.5. Espectro de RMN de 1H da mistura de citronelal, de citronelol e de
geraniol (19,71; 21,80 e 21,61 mg, respectivamente) (300 MHz, em CDCl3)
contendo o padrão interno OMCTS (1,36 mg) usado para determinação da linearidade do método de RMN de 1H desenvolvido. À área do sinal
correspondente ao OMCTS (em azul) é atribuído o valor de 1000. A área dos demais sinais é integrada em relação à do OMCTS.
Figura 4.6. Curvas de linearidade da quantidade observada vs. quantidade esperada de citronelal ( ), de citronelol ( ) e de geraniol ( e ) obtidas do espectro de RMN de 1H da mistura dos três componentes.
A robustez do método foi avaliada pela obtenção dos espectros de RMN de
1H com 16 varreduras (nt = 16), e temperatura controlada a 25 °C e usando 8
varreduras, sem controle de temperatura.
O coeficiente de variação obtido ao adquirir os espectros sem controle de temperatura e usando 8 varreduras (CV = 2,75 em 9,75 ppm para citronelal; CV = 1,61 em 3,61-3,74 ppm para citronelol e CV = 1,01 em 5,36-5,42 ppm e CV = 1,49 em 4,13 ppm para geraniol) revelou que o método é robusto nas condições avaliadas. Além disso, a diferença em percentagem (%D) entre as massas de citronelal, de citronelol e de geraniol obtidas dos espectros adquiridos com 16 varreduras e temperatura de 25 °C em relação às massas obtidas dos espectros adquiridos usando 8 vareduras, sem controle de temperatura foram significativamente baixas (%D = 2,47% em 9,75 ppm para citronelal; 1,75% em 3,61-3,74 ppm para citronelol e 2,72% em 5,36-5,42 ppm e 2,22% em 4,13 ppm para geraniol). Consulte as Tabelas S3.17 a S3.19, nos Dados Suplementares 3, para dados completos sobre robustez.