Métodos Ópticos para detecção de perda mineral

Visando possibilitar uma melhor comunicação no diálogo de motivação entre profissionais e pacientes, métodos diagnósticos vêm sendo desenvolvidos para a detecção de lesões precocemente, e monitoramento da lesão pelo profissional e pelo paciente. Acredita-se que ao visualizar a lesão através de imagens diagnósticas, o paciente terá maior compromisso em proporcionar meios de higiene, como escovação e fio dental, para regressão da lesão, além de retornar para a próxima consulta para verificar se os procedimentos estão sendo efetivos.

Na última década, novas técnicas ópticas para detecção precoce de cárie foram desenvolvidas, dentre as tecnologias, algumas se encontram comercializadas em âmbito clínico, e outras estão em fase experimental em laboratório de pesquisas. Dentre as mais populares e comercializadas clinicamente em alguns países, enumeramos: a DIFOTI (Digital Imaging fibre-optic trans-illumination) (SCHNEIDERMAN et al., 1997), a qual se baseia em transiluminação com luz visível comercializada pela Electro-Optical Sciences, Inc. (Irvington, NY, EUA); o QLF (Quantitative Light-induced fluorescence) (JOSSELIN de JONG et al., 1995) baseia- se na quantificação da fluorescência excitada com luz azul em torno de 380nm, desenvolvido e comercializado por grupo holandês, Inspecktor Research System (Amsterdam, Holanda); e o DIAGNOdent baseado no sinal fluorescência apos

excitação com vermelho, em torno de 680nm, sendo o mais popular no Brasil, comercializado pela KaVo (Charlotte, Carolina do Norte, EUA).

Outras técnicas de maior complexidade tecnológica mostram bons resultados laboratoriais in vitro, e estão em fase de desenvolvimento para maior aproximação entre as quantificações matemáticas e o diagnóstico clínico. Dentre as diversas técnicas, destaca-se: a NIR Transillumination imaging baseada em transiluminação com laser no infravermelho (JONES et al., 2003; BUHLER et al., 2005; KARLSSON et al., 2010); a OCT - Tomografia por coerência óptica (OTIS et al., 2000) baseada em secções internas da amostra através da analise do sinal de retroespalhamento da luz, usando laser no infravermelho, em torno de 830nm a 1300nm; e a espectroscopia Raman associada a OCT (KO et al., 2005), que analisa a amostra bioquimicamente através da vibração molecular, e detecta perda mineral na estrutura.

Para estudos in vitro, e desenvolvimento metodológico para quantificação de perda mineral decorrente também de lesões erosivas, outros métodos qualitativos laboratoriais, maioria de formas de microscopia, tem sido aplicados de forma independente ou combinados a resultados quantitativos. Dentre estes métodos, cita- se: a microscopia de luz transmitida, a microscopia confocal de varredura a laser (CLSM – confocal laser scanning microscopy), microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura (MEV/SEM – scanning

eletronic microscope), espectroscopia de energia dispersiva (EDS - energy- dispersive X-ray spectroscopy), microscopia de força atômica (AFM - atomic force microscopy) e microscopia de tunelamento com varredura (STM - scanning tunneling microscope), e a espectrometria de massa de íon secundário (SCHLUETER, HARA,

SHELLIS, GANNS, 2011).

Cada um dos métodos existentes apresentam vantagens, desvantagens e limitações. Como exemplo a perfilometria de contato, que apesar da ampla utilização por pesquisadores e boa reprodutibilidade, apresenta a desvantagem de ser destrutiva, como observado na figura 1. Entretanto, a utilização conjunta dos resultados de diversos métodos pode preencher adequadamente a maior parte das necessidades das pesquisas envolvendo perda mineral dentária. Não obstante, ainda há grande necessidade para o desenvolvimento, avaliação e, principalmente,

validação de novos métodos que podem vir a melhorar sobremaneira o estudo da perda mineral em todas as fases e nos diversos modelos de estudo, in vitro, in situ, bem como em ensaios clínicos (SCHLUETER, et al., 2011).

Figura 1: Micrografia por microscopia eletrônica de varredura evidenciando os danos causados pela ponta de diamante da perfilometria de contato em região de esmalte dentário previamente erodido. Micrografia MEV CETENE.

2.4.1 Princípios Físicos dos Métodos Ópticos para detecção de perda mineral

Em geral, as técnicas ópticas por apresentarem a vantagem de serem não destrutivas, tem ganhado espaço dentre as técnicas desenvolvidas para detectar perda mineral dentária. Baseado nos conceitos de interação da energia aplicada ao dente, ou na observação da energia que é emitida a partir do dente (HALL, GIRKIN, 2004), os métodos ópticos usam a energia da luz visível, incluindo ainda o ultravioleta e infra-vermenlho (figura 2).

Figura 2: Espectro eletromagnético, com ênfase para os comprimentos de onda da física óptica. Incluindo o ultravioleta e infravermelho. Ilustração adaptada por Ana

Marly A. Maia.

Ao interagir com a estrutura dentária, essa energia pode interagir enquanto onda eletromagnética, de acordo com os conceitos de reflexão, absorção que pode ser seguida de fluorescência, transiluminação, espalhamento e retroespalhamento (HALL, GIRKIN, 2004). Por ser de fundamental importância conhecer as propriedades da onda eletromagnética e da estrutura observada, buscou-se relembrar os conceitos de interação luz com a matéria. Em geral, a área desmineralizada torna-se porosa, o que aumenta o espalhamento da luz incidente, levando essa região a parecer mais esbranquiçada, portanto nomeada de mancha branca. Na figura 3, por meio de um desenho esquemático, são demonstradas as interações ópticas entre o elemento dentário e a onda eletromagnética. Estas diferentes propriedades ópticas podem ser quantificadas de diferentes formas, a depender do comprimento de onda e dos detectores ópticos.

Figura 3: Esquema de propriedades ópticas na interação laser-tecido. Ilustracão

adaptada por Ana Marly A. Maia.

A propriedade da reflexão é a mais popularmente conhecida no meio clínico odontológico, obtida macroscopicamente através do uso do espelho oral plano ou convexo. É um fenômeno de superfície que resulta na mudança de direção da onda, um exemplo clássico dessa propriedade na clínica odontológica é quando o espelho bucal proporciona a iluminação e visualização das superfícies linguais ou palatinas dos dentes, como mostrado na figura 4 (a), sendo nossos olhos os detectores óticos naturais. A estrutura cristalina do esmalte permite a passagem da luz, propriedade chamada de transmissão, neste caso difusa. A figura 4 (b) demontra a observação da luz transmitida da face vestibular para a lingual dos incisivos inferiores.

Figura 4: (a) Imagem da superfície lingual dos dentes superiores refletida no espelho bucal; (b) Imagem da superfície lingual dos dentes infeirores após luz transmitida, observar translucidez do esmalte. Fotografia arquivo pessoal.

O espalhamento consiste na mudança de direção do feixe de luz sem perda de energia, visto que a luz é forçada a desviar quando interage com partículas menores ou objetos que provoquem essa propriedade. A intensidade do espalhamento da luz depende também do comprimento de onda e do material, podendo levar a dissipação de energia. A cárie dentária inicial, devido a maior porosidade estrutural e grande número de obstáculos difusores, é um meio espalhador, e por provocar maior espalhamento da luz apresenta-se como uma mancha branca (ANGMAR-MANSSON, TEN BOSCH, 1993). O espalhamento é dependente do comprimento de onda, de forma que ondas menores apresentam maior espalhamento (HALL, GIRKIN, 2004). E vários métodos ópticos quantificam a quantidade de luz espalhada por transiluminação ou por retroespalhamento.

Os efeitos do espalhamento podem ser ressaltados ao comparar a luz refletida e transmitida do dente cariado, como demonstrado nas figuras 5 a e b. A luz branca refeletida sofre maior espalhamento no tecido demineralizado, processo chamado também de retroespalhamento, apresentando-se como mancha branca, figura 5 (a). No entanto, observando a luz transmitida através do dente, observa-se que o tecido sadio que apresenta cristais translúcidos e organizados, permite a passagem efetiva da luz, no entanto, na região do tecido cariado, ou mancha branca

(MB) que sofreu modificações estruturais com presença de poros, bactérias, e outros constituintes, a luz é pouco transmitida, como pode ser observada na figura 5 (b). Observar como o contraste entre a mancha branca e o esmalte sadio é maior na amostra com luz branca transiluminada 5 (b).

Figura 5: (a) Aparência do contraste da superfície sadia e desmineralizada (MB) com luz branca refletida, com reflexos de saturação (R) e baixo contraste; (b) Aparência do contraste na mesma região, através da luz transmitida de dentro da amostra para

o detector óptico, logo sem reflexos (R). Fotografia arquivo pessoal.

Devido à diminuição do espalhamento com o aumento do comprimento de onda, o infravermelho próximo mostra-se como eficiente fonte de luz para iluminar a estrutura dentária como meio de diagnóstico. Visto que o esmalte sadio promove baixa atenuação na faixa do infravermelho, e a cárie é um meio espalhador, observa-se um aumento do contraste óptico entre o sadio e o cariado. Métodos de detecção de cárie são baseados nas diferenças de espalhamento entre o sadio e cariado, através da quantificação da onda eletromagnética no infravermelho transmitida, como publicado em Maia et al., 2011, figura 6 (a) e (b).

Figura 6: Secção dentária transiluminada. (a) Laser infravermelho 1300nm; (b) Luz branca. Fotografia arquivo pessoal.

A absorção é o processo de interação da luz em que o fóton é interrompido por um objeto e sua energia dissipada para a estrutura. A energia perdida pode ser convertida e posteriormente transformada em calor, ou em outros comprimentos de onda de menor energia e maior comprimento de onda. Dentre exemplos na Odontologia observamos a propriedade de absorção da luz durante a fotopolimerização da resina composta contendo canforquinona, no clareamento com géis fotoabsorvedores e na terapia fotodinâmica.

Após a absorção, a energia pode ser emitida em maior comprimento de onda, através do processo de fluorescência, decorrente da interação da luz com os fluoróforos da estrutura dentária. A energia é convertida para um nível mais alto de energia, no qual o elétron permanece por pequeno intervalo de tempo. Em seguida, o elétron pode decair para um estágio energético menor e liberar a energia acumulada em um comprimento de onda maior, resultando na emissão da fluorescência. A estrutura dentária dispõe de autofluorescência, sem necessitar da adição de substância luminescente (BENEDICT, 1928), e a desmineralização resulta em perda da referida autofluorescência (BORISOVA et al., 2006), a qual pode ser quantificada por métodos ópticos.

2.4.2 Quantificação da Fluorescência induzida por Luz (QLF)

A aplicação clínica do QLF, traduzido como quantificação da fluorescência induzida por luz, promove imagens por fluorescência da lesão de cárie, podendo esta ser quantificada em extensão e perda mineral. Um dos meios de se obter fluorescência do elemento dentário, é usar uma fonte de luz fluorescente, que para o QLF foi escolhido azul visível e ultra-violeta, com comprimento de onda em torno de 380nm, visto que o dente quando excitado com ultra violeta, emite fluorescência no azul, e quando excitado com verde e azul, emite fluorescência no amarelo e laranja em diferentes intensidades (ANGMAR-MANSSON, TEN BOSCH, 2001).

Como meio de bloquear a reflexão da luz azul, utiliza-se um filtro amarelo, que proporciona apenas a observação do comprimento de onda emitido como fluorescência. No entanto, nas regiões cariadas há diminuição da emissão da fluorescência, ressaltando o contraste entre a região sadia e cariada. A diminuição da fluorescência da região de cárie ocorre devido a alguns mecanismos: como o alto espalhamento da luz que impede a penetração da luz para que seja absorvida e convertida, emitindo consequentemente pouca fluorescência; além do espalhamento atuar como uma barreira impedindo que a luz penetre até a dentina, responsável por grande parte da fluorescência; e ainda devido a possíveis alterações moleculares nas proteínas cromóforas responsáveis pela fluorescência natural do elemento dentário (ANGMAR MASSON, TEN BOSCH, 2001).

Dessa forma a imagem captada por uma câmera CCD, apresenta-se com um maior contraste entre o tecido sadio (fluorescente), e o meio cariado espalhador e com menor fluorescência. Imagem esta que evidencia a lesão cariosa podendo ser observada facilmente pelo paciente durante o exame clínico, e assim motivá-lo para melhorar a higiene oral. O sistema permite repetidas análises, sem danos ao paciente, o que proporciona um monitoramento da lesão ao longo do tempo.

2.4.3 Tomografia por Coerência Òptica (TCO)

A Tomografia por Coerência Óptica (TCO), no entanto mais conhecida pela sigla em inglês OCT, é também considerada não invasiva e não destrutiva. Baseada na propriedade do retroespalhamento da luz laser após interação com o material

analisado, a TCO utiliza laser no infravermelho 850 nm a 1300nm, sendo o maior comprimento de onda aplicado para obter maior penetração nas amostras dentárias, como demonstrado anteriormente (FONSECA et al, 2008). As imagens da TCO são obtidas através de uma série de processamentos decorridos da interação óptica básica de interferência entre um feixe retroespalhado com um feixe de referencia. Por se tratar de um tomógrafo fornece imagens seccionadas de estruturas internas, em tempo real, e com alto poder de resolução espacial (FUJIMOTO, 2003). Enquanto imagem tomográfica, a TCO tem sido utilizada para diversos fins, como avaliação da interface de restaurações (MELO et al., 2005; MONTEIRO et al., 2011), para o diagnóstico de cárie (FREITAS et al., 2006; MAIA et al., 2010), para análise de materiais dentários (KYOTOKU et al., 2007; BRAZ et al., 2008), detecção precoce de câncer oral (JUNG et al., 2005), detecção de cáries recorrentes e adaptação marginal de restaurações (OTIS et al., 2000) e caracterização de estruturas periodontais (COLSTON et al., 1998; OTIS et al. 2000).

A configuração óptica da TCO consiste em um interferômetro de Michelson, o qual requer uma fonte de luz de banda larga de baixa coerência, podendo ser laser ou diodo superluminescente. Os fundamentos da interferometria avaliam a sobreposição de ondas eletromagnética em um sistema, com um divisor de feixes de radiação que pode ser um prisma ou através de fibras ópticas, que divide a radiação da fonte em duas direções com 50% cada. Metade da intensidade da luz interage com a amostra estudada, e a outra metade é totalmente refletida por um espelho móvel, tendo suas características preservadas. A radiação retroespalhada da amostra estudada carrega os sinais de alterações, e se recombina com a radiação refletida 100% pelo espelho de referência, sendo então comparadas quanto aos padrões de interferência quando analisadas pelo espectrômetro. Para melhor resolução da imagem a ser formada, a radiação passa por uma grade de difração que divide o feixe de luz para que o sinal seja analisado pontualmente. Deste modo, diferentes graus de interferência da radiação advindos da estrutura estudada podem ser observados, dando origem a uma imagem de corte tomográfico, conhecida como B Scan, a qual é formada por sinais de interferência pontual, conhecida como A Scan (FUJIMOTO, 2003).

A análise do sinal óptico pode ser quantificada através de processamentos da intensidade ou do decaimento da luz no tecido analisado. A análise matemática do

comportamento da luz observado deve permitir mínima influência das habilidades do operador, e compensar qualquer deficiência do mesmo (ANGMAR MASSON, TEN BOSCH, 2001). Considerando a necessidade de proporcionar sistemas cada vez mais independentes do subjetivismo clínico, buscou-se processar imagens para calcular alterações do tecido dentário com maior precisão. No caso do esmalte dentário, observa-se que regiões cariadas que são meio espalhadores, apresentam um coeficiente de atenuação maior, não permitindo a passagem da luz através da estrutura.

2.4.4 Microscopia por Confocal de escaneamento a laser (CLSM)

A técnica baseia-se na redução da detecção da quantidade de luz espalhada através do isolamento do sinal de resposta do foco do scanner. Um microscópio convencional de fluorescência de amplo espectro coleta luz de todo o volume do espécime, resultando na aquisição de fluorescência por partes do espécime que não se encontram exatamente no plano focal que está sendo examinado, o que leva a uma perda severa dos detalhes da imagem. Um microscópio confocal tem a habilidade de remover a fluorescência de quase toda a extensão do espécime que não se encontra no plano focal, resultando em uma imagem mais clara e definida (SHEPPARD, SHOTTON, 1997).

Como o ponto de foco encontra-se escaneando em torno do tecido, o sinal detectado deste é usado para construir uma alta resolução (<1micron) de imagem do tecido (BOYDE, 1985). O foco de luz visível no tecido não pode ser mantido em profundidades maiores de 300 micrometros, visto que o desafio do espalhamento torna-se bem maior. Portanto, imagem 3D de alta resolução pode ser obtida por escaneamento de posições profundas com pontos focais sequenciados, até uma profundidade limítrofe em torno de 300µm (HILLMAN, BURGESS, 2009).