UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM CLÍNICA INTEGRADA
ANA MARLY ARAÚJO MAIA
APLICAÇÃO DE TÉCNICAS ÓPTICAS PARA ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DE PERDAS
MINERAIS DO TECIDO DENTÁRIO
RECIFE - PE 2013
ANA MARLY ARAÚJO MAIA
APLICAÇÃO DE TÉCNICAS ÓPTICAS PARA ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DE PERDAS
MINERAIS DO TECIDO DENTÁRIO
Tese apresentada ao Colegiado da Pós Graduação em Clínica Integrada do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito para obtenção do grau de doutora em Odontologia. Orientador: Prof. Dr. Anderson S. L. Gomes
Co-orientador: Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente
RECIFE - PE 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO REITOR
Prof. Dr. Anísio Brasileiro de Freitas Dourado VICE-REITOR
Prof. Dr. Sílvio Romero de Barros Marques PRÓ-REITOR DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof. Dr. Francisco de Sousa Ramos CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DIRETOR
Prof. Dr. Nicodemos Teles de Pontes Filho
COORDENADOR DA PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA MESTRADO EM CLÍNICA INTEGRADA
COLEGIADO MEMBROS PERMANENTES
Profa. Dra. Alessandra Albuquerque Tavares Carvalho Prof. Dr. Anderson Stevens Leônidas Gomes
Prof. Dr. Arnaldo de França Caldas Júnior Prof. Dr. Carlos Menezes Aguiar Prof. Dr. Danyel Elias da Cruz Perez Prof. Dr. Edvaldo Rodrigues de Almeida Profa. Dra. Flávia Maria de Moraes Ramos Perez
Prof. Dr. Jair Carneiro Leão Profa. Dra. Jurema Freire Lisboa de Castro
Profa. Dra. Liriane Baratela Evêncio Prof. Dr.Luiz Alcino Monteiro Gueiros Prof.Dra. Maria Luiza dos Anjos Pontual
Prof.Dr. Paulo Sávio Angeiras Goes Profa. Dra. Renata Cimões Jovino Silveira
Dra. Simone Guimaraes Farias Gomes Dr. Tibério César Uchoa Matheus
MEMBRO COLABORADOR Profa. Dra. Lúcia Carneiro de Souza Beatrice
Prof. Dr. Cláudio Heliomar Vicente da Silva SECRETARIA
APLICAÇÃO DE TÉCNICAS ÓPTICAS PARA ANÁLISE QUALITATIVA E QUANTITATIVA DE PERDAS
MINERAIS DO TECIDO DENTÁRIO
ANA MARLY ARAÚJO MAIA
Tese defendida e aprovada em: _17_/_01_/_2013__
MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. John Michael Girkin __________________________________
Professor Titular Biophysics Durham University – UK
Prof. Dra. Denise Maria Zezell __________________________________
Pesquisadora e professora do Instituto de Energia Nuclear IPEN – CLA/ USP
Prof. Dr. Gustavo Pina Godoy __________________________________
Professor Adjunto Odontologia da Universidade Estadual da Paraíba - UEPB
Profª. Dra. Maria Luiza dos A. Pontual ____________________________________
Professora Adjunto Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco- UFPE
Prof. Dr. Danyel E. da C. Perez ____________________________________
Professor Adjunto Odontologia da Universidade Federal de Pernambuco- UFPE
RECIFE - PE 2013
DEDICATÓRIA
... a Deus pelo dom da vida, por ter me proporcionado nascer em uma família abençoada por Seus ensinamentos.
... aos meus pais José Maia e Maria Zilda pela dedicação e doação aos filhos, no sentido mais puro e verdadeiro existe. É uma honra ter pai e mãe cheios de amor, saúde, familiares incríveis, com princípios éticos e exemplares em vários aspectos. Nesse contexto de família, estendo minha gratidão a minha irmã Maria Rosa e meu irmão José Neto, pela cumplicidade eterna, depois de casados e morando distante.
AGRADECIMENTOS
A defesa de uma tese é similar a uma despedida. Para mim uma despedida saudosa de uma companhia e motivação diária de quase quatro anos. A transformação do gerúndio (doutoranda), em infinitivo (doutora), foi moldada ao longo dos anos, através da mais íntima busca pelo conhecimento e questionamento contínuo.
Durante os anos de formação, a compreensão de como o conhecimento continua sendo descoberto, questionado, provado e relatado, faz o doutorando sentir-se numa fronteira buscando pontos ou vírgulas ausentes em bilhões de palavras. Uma tese escrita é como uma peneira, que filtra alguns % dos testes e aprendizados para serem organizadamente relatados com inicio e fim, infelizmente excluindo um meio que incluiria folhas e folhas de cadernos de laboratório. Um meio cheio de personagens, de tentativas, de insucessos, de trabalhos incompletos, mas de extrema aprendizagem. Um meio sem qualis, sem pontuação, sem direito a ser relatado, mas de grande riqueza para o que se forma doutor. Nesse meio tempo vivido, inúmero personagens se fizeram presentes e importantes nessa caminhada, alguns participantes efetivos na construção dos artigos que a compõem, outros colaboradores de experimentos laboratoriais, que foram também fundamentais.
Relembrando o primeiro ano de doutorado, agradeço a heterogênea primeira turma de doutorado do Programa de Odontologia UFPE, da qual tive a honra de fazer parte, com anseios e experiências diferentes, que tornaram nossas aulas mais interessantes;
Aos professores do colegiado de Odontologia, que tiveram cada um sua contribuição através de disciplinas ou através de exemplos fora de sala de aula. Ressaltando os coordenadores do Programa, Professor Jair Leão e Professora Jurema Lisboa, pelo empenho em aperfeiçoar a Pós Graduação, e ao Professor Cláudio Heliomar, pelos momentos de escuta enquanto coorientador; Aos funcionários da pós-graduação de Odontologia da UFPE, especialmente Oziclere e Tânia, sempre disponíveis para ajudar; A secretaria Ieda pela disponibilidade e dedicação de representar o Programa de Pós no dia da minha defesa de tese;
Aos companheiros de formação do CEPLO, partilhando informações e atividades práticas para aplicações do laser, em especial ao Prof. Jair Leão, Prof. Luiz Alcino, Luiz Mário, Cláudia e Igor; A funcionária Rita pelos cuidados com o CEPLO, além da disponibilidade para aguardar a utilização do laser em horários extras;
Apesar de aluna de um programa de odontologia, passei 85% do tempo em Departamentos de Física, vivendo uma realidade divergente, que fez crescer e visualizar a construção do conhecimento de uma forma ampla. Sou grata:
Ao meu orientador Professor Anderson, por mesmo acreditando e confiando em minhas atividades, estava sempre motivando um desafio a ser vencido. Grata pelas inúmeras oportunidades oferecidas, pelo incentivo e recursos sempre disponíveis;
Aos professores Cid Araújo e Renato Araújo, pelo exemplo de busca do conhecimento em família, fontes de inspiração. Além das colaborações com equipamentos e instrumentais óticos entre Laboratórios;
Aos funcionários da Secretaria e Setor Financeiro do Departamento de Física pelo exemplo de dedicação ao bem público, em especial a Claudésio pelo esforço e disponibilidade; Aos técnicos dos laboratórios de Física, Marcos, Sérgio, João, Virgínia e Tarsila pela disponibilidade e confiança; Além dos funcionários terceirizados da limpeza e segurança, pela disponibilidade em ajudar;
Ao meu amor, Bebeto Amorim, que disfarçado de melhor amigo conquistou meu coração no Laboratório de Física. Acreditando mais em meu potencial do que eu mesma, uma motivação intensa e verdadeira, cheia de amor e companheirismo. A sua paixão e curiosidade pela eletrônica foi também fonte de inspiração; Grata a sua família pelo carinho. Aos companheiros do Laboratório de Optoeletrônica e Fotônica, importantes em diferentes fases dos últimos 4 anos;
A Patrícia Cassimiro, que numa relação doutoranda-mestranda, tornou-se uma grande amiga pra vida toda, com quem eu espero dar continuidade na nossa “eficiente” parceria; A Sérgio Campello pelos debates de conceitos físicos, parceria em trabalhos, além da amizade construída;
A Cláudia Brainer, que mesmo da Odontologia, foi sempre uma companhia de laboratório, com quem desenvolvi estudos também importantes;
A Gabriela Monteiro, pela colaboração nos meses que esteve presente nessa caminhada; A Monica Schaffer pela agradável companhia, com quem vivi a primeira experiência informal de co-orientação enquanto doutoranda;
A Marco Sacilotti e Kátia Calligaris pela atenção e disponibilidade em ajudar quando solicitados;
A Eusébio, do DPQ, pela paciência em ceder espaço para os primeiros testes de diluições de dentifrícios;
A Daene Tenório e Angelinne Ângelo pela amizade, e colaboração em diferentes pesquisas; A Jamil Saade pelas inúmeras tentativas de praticar os conceitos da espectroscopia Raman; Aos fomentos de bolsista de doutorado e Processo AMD cedidos pela Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco que me permitiram dedicação exclusiva e a experiência de estágio na Inglaterra por seis meses, em 2010; I would like to especially thank:
To Professor John Girkin for the lovely example of how to be a master. You are worthy of all respect, with unique simplicity. A nature researcher, who makes optical physics something magical;
To Dr. Chris Longbottom for all attention and discussions, for supplying me with articles that are true relics and always have a sincere sympathy;
To Lena Karlsson for the friendship and all contributions and discussions about paper I. To my “hinny” friend Laura Fleming, who welcomed me as a sister, and lent me his mother and grandparents as my family in England. Six months of a friendship that will last a lifetime; To Brazilian friends, Tarsila Burity and Rafael Vilar, for all tips to uncover the best way to solve the silliest things;
To my roommates (125b) Jonny Taylor, James Osborn, Luke Tyas who respected my shyness and have always been available to help me;
To the other housemates that made my experience more fun and enjoyable, with different cultures, and methodological discussions of the simplest household chores, Rachel Sedman, Nuria Polo and Federico Casari;
Ao voltar ao Brasil, em 2011, uma nova experiência me aguardava para ser vivida, a experiência docente na Faculdade Mauricio de Nassau, sou grata: A coordenadora Regina que me acolheu com carinho e serenidade da experiência; E a coordenadora Patrícia Leiming pela motivação em continuar, e compreensão quando chegou a necessidade de deixar a faculdade;
Aos professores companheiros de trabalhos, como Igor, Amanda, Paulinho, Daiane, Eduardo, Gabriela, Conceição; Em especial ao amigo Pierre Andrade, companheiro de graduação e de trabalho como professor na Nassau, e hoje na UEPB – Campus IV;
Aos meus alunos pela motivação constante de descobrir a melhor forma de guiar a busca pelo conhecimento; Aos funcionários técnicos de laboratório, por toda a disponibilidade e auxílio nas aulas práticas;
Além do Departamento de Física, outros centros como o CETENE e o CLA/IPEN, e as pessoas que o compõem, foram fundamentais para o desenvolvimento dessa tese;
Ao professor Anderson Zanardi CLA/IPEN, pela atenção nas discussões de processamentos de imagens via Skype;
A professora Denise Zezell CLA/IPEN, pelas diversas colaborações e pelo acolhimento em seu laboratório; e a Patrícia da Ana, por desmistificar e concretizar metodologias descritas em artigos publicados;
Aos funcionários e pesquisadores do CETENE, pela disponibilidade e prontidão em ajudar a pesquisa ser realizada da melhor forma, especialmente para Edwin, Francisco, Maurício, Josie, Gabriela, Hans, Conceição e Juliet;
Dentre os agradecimentos indiretos:
Aos meus avós paternos e maternos, tios, tias, primos, primas, com quem partilho as intimas e divertidas reuniões familiares aos finais de semana, e que direta ou indiretamente ajudaram a finalização desse sonho;
As moradoras do apartamento Andrezza, Ana Cristina, Thayze e Marcela, que em diferentes fases partilharam momentos inesquecíveis;
As minhas cadelinhas (Sammy 15 anos, Blubby 10 anos, e Nina 1 ano) que me recebem com tanta festividade;
Aos estudantes companheiros de viagem Campina Grande <> Recife <> Maceió, pela partilha de experiências de pesquisas com as mais diversas áreas do conhecimento.
A TODOS que contribuíram para meu crescimento pessoal e profissional durante esses anos de doutoranda.
RESUMO
A detectação precoce e monitoramento de perdas minerais da estrutura do tecido dentário requerem técnicas conservativas, não invasiva ou minimamente invasivas, como os métodos ópticos, baseados nos propriedades físicas da luz. Esta tese demonstra a aplicabilidade de três técnicas ópticas qualitativas e quantivativas para perda mineral por cárie ou erosão dentária. Uma das técnicas é comercialmente estabelecida, a Quantificação de fluorescência por luz-laser induzida (QLF), e outros dois métodos vem sendo aplicados para estudos experimentais, a Tomografia por coerência óptica (OCT) e a Microscopia confocal por escaneamento a laser (CLSM). Objetivo geral: Avaliar e caracterizar a aplicabilidade de técnicas ópticas para qualificar e quantificar a perda mineral por cárie ou erosão dentária, elucidando a importância do conhecimento integrado das propriedades ópticas da interação laser-tecido (in vitro). Materiais e Métodos: No artigo I, um modelo de cárie artificial desenvolvido em 6 amostras de esmalte dentário humano, foi quantificado quanto a perda de fluorescência quantificada pelo QLF e correlacionado com as alterações no coeficiente de atenuação (A-Scan) detectada pelo OCT. Cerca de 200 cortes tomográficos (B-Scan) por amostra foram processados para formação de um novo mapa da lesão (C-Scan) com informações da curva de decaimento da luz em tecido sadio e cariado. No artigo II, a microscopia confocal com escaneamento a laser (CLSM), analisou e comparou amostras de esmalte dentário humano submetidos a ciclagem erosiva e tratados com dentifrícios com diferentes mecanismos de flúor, o fluoreto de estanho e a caseína fosfopeptídea com cálcio amorfo. O artigo III através de quatro protocolos de ciclagens erosivas múltiplas em esmalte bovino demonstrou a aplicação da Tomografia por Coerência Óptica, similar a análise de perfilometria, como um meio de quantificação de perda mineral, comparando as interfaces entre a região sadia de referência e a região erodida. Resultados: O processamento do valor de coeficiente de decaimento exponencial da luz em
lesão de atenuação gerado através da técnica de OCT. No artigo II, a análise das imagens 3D e secções transversais da microscopia confocal permitiu comparar áreas sadias e erodidas, visualizar detalhes morfológicos como a irregularidade do esmalte com exposição dos cristais de esmalte, além de mensurar o desnível entre as áreas de interface, e a deposição da camada protetora de fluoreto de estanho. O artigo III demonstrou a viabilidade de utilizar a OCT para comparar as médias dos batentes de perda minerais decorrente de múltiplas imersões em solução de ácido cítrico ou refrigerante coca-cola sob protocolos erosivos variados. Tanto o OCT como a perfilometria mostraram maior perda mineral promovida pela solução de ácido cítrico, e diretamente proporcional ao maior tempo de exposição. Conclusões: Em geral, concluiu-se que as técnicas ópticas tem alto potencial para quantificação da perda mineral, seja por cárie ou erosão dentária, além da possibilidade de monitorar a evolução da lesão dentária visto que são não destrutivas.
ABSTRACT
The early detection and monitoration of mineral loss of dental tissue structure needs conservative techniques, non-invasive or minimally invasive, as optical methods, based on physics properties of the light. This Thesis describes application of three Optical Techniques qualitative and quantitative of mineral loss from dental caries and erosion. One of the techniques is commercial established, Quantitative Light Induced Fluorescence (QLF), and the other two techniques has been applied on experimental studies, the Optical Coherence Tomography (OCT) and the Confocal Scanning Laser Microscope (CLSM). General Aim: Analyze and characterize the application of optical techniques to qualify and quantify mineral loss for dental caries and erosion, highlighting the importance of integrated knowledge of optical techniques of laser material interacts (in vitro). Materials and Methods: On paper I, an arthificial carie model was developed in 6 samples of human enamel dental, and loss of fluorescence was quantified through QLF and correlated with the attenuation coefficient alterations (A-Scan) detected by OCT. Almost 200 tomographic sections (B-Scan) from each sample were processed to plot a new map of caries lesion (C-Scan) with information of decay curve of light interacts with health and carious tissue. On paper II, the Confocal Laser Scanning Microscope, was used to analyze and compare samples of human enamel structure submitted to erosive cycle and treated with dentifrices with different fluoride mechanism, stannous fluoride and phosphor-peptide casein with amorphous calcium phosphate. Using four protocols of multiple exposure erosive cycles and bovine enamel samples, the paper III demonstrated an application of OCT as a quantitative method, similar to profilometry, comparing interface between sound reference and eroded regions. Results: The value of exponential decay coefficient of each A-Scan (paper I) resulted in one C-Scan map quantifying caries lesion with better efficiency. On paper II, images 3D and transversal sections obtained by Confocal Microscopy allowed: comparison between sound and eroded areas with interface levels measurements, visualization of morphological details as the
irregularity of enamel rods exposition, and deposition of the stannous fluoride protective layer. The paper III demonstrated the feasibility of using OCT to compare the means of mineral loss steps caused by multiple immersions in erosive solution of citric acid or coca-cola, under various protocols. Both techniques, OCT and profilometry, showed greater mineral loss promoted by citric acid solution, and also proportional to the exposure time. Conclusions: In general, it was found that optical techniques have high potential for
quantification of mineral loss, either by caries or dental erosion, besides the possibility to monitor the progress of dental lesions as they are not destructive.
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DA LITERATURA
Figura 1: Micrografia por microscopia eletrônica de varredura evidenciando os danos causados pela ponta de diamante da perfilometria de contato em região de esmalte dentário
previamente erodido. Micrografia MEV CETENE. 34
Figura 2: Espectro eletromagnético, com ênfase para os comprimentos de onda da física óptica. Incluindo o ultravioleta e infravermelho. Ilustração adaptada por Ana Marly A. Maia.
35 Figura 3: Esquema de propriedades ópticas na interação laser-tecido. Ilustracão adaptada
por Ana Marly A. Maia. 36
Figura 4: (a) Imagem da superfície lingual dos dentes superiores refletida no espelho bucal; (b) Imagem da superfície lingual dos dentes infeirores após luz transmitida, observar translucidez do esmalte. Fotografia arquivo pessoal. 37
Figura 5: (a) Aparência do contraste da superfície sadia e desmineralizada (MB) com luz branca refletida, com reflexos de saturação (R) e baixo contraste; (b) Aparência do contraste na mesma região, através da luz transmitida de dentro da amostra para o detector óptico, logo sem reflexos (R). Fotografia arquivo pessoal. 38
Figura 6: Secção dentária transiluminada. (a) Laser infravermelho 1300nm; (b) Luz branca.
Fotografia arquivo pessoal. 39
Artigo I
Figure 1: The commercial SR-OCT, OCP930SR, schematic diagram (adapted from Thorlabs
New Jersey, USA). 50
Figure 2: a) The handheld scanning probe from the OCT system (Thorlabs) and the tooth in a micrometer translation stage controlled by a Motor Move system, about 0.5mm/s; b) off-axis images, A-Scan, B-Scan and C-Scan images. 51
Figure 3: Diagram of the whole sequence processing. 52
Figure 4: a) Image obtained by reflection visible light; b) Image obtained by transilluminated visible light; c) Image from QLF software; d)The C S-can image processed. 54
Figure 5: Image reference and A-scan showing the decrease of light in evaluated by exponential decay, illustrating the alterations of attenuation coefficient on carious signal. Fitting in decay signal curve of sound tooth (green line) and carious region (blue line). 55 Figure 6: (a) Enamel surface and dentine enamel junction (DEJ); (b) same region after arthificial demineralization, not possible to see DEJ below carious surface. 56 Figure 7: (a) Polarized optical microscope image of 200um section; (b) Tomographic B-Scan
image of the caries lesion. 56
Artigo II
Figure 1: CLSM typical images of sound enamel surface (a); soft eroded surface (b); and areas of aggressive eroded surface (c). Figures (d), (e) and (f) show XZ sections taken from the reconstructed images from samples a, b and c, respectively. 71 Figure 2: CLSM of typical enamel surfaces treated with solutions; a) G2: CPP-ACP NaF Solution; b) G4: Oral B SnF2 Solution; c) G3: CPP-ACP NaF Tooth-brushed; and d) G5: Oral B SnF2 tooth-brushed effects. Below each image XZ sections taken from the reconstructed
images. 72
Figure 3: CLSM image on XZ section representative interface of each tested group at the
end of cycle regime. 73
Artigo III
Figure 1: Example of an OCT image profile analyzed. The total distance used as reference to get value of step was 3mm, meaning 1,5 mm of each surface. For measurement of tissue loss, the box tool helps to identify the distance between both superficial face. 89
Figure 2: Comparison of OCT images of the enamel surface reference and eroded are for different solution and time periods. Images identified with lowercase represent 3D OCT; and
images by uppercase cross-sectional. (A/a) Citric Acid, 10d:6x5min; (B/b) Citric Acid, 7d:5x3min; (C/c) Coca-Cola®, 7d: 5x3min; and (D/d) Coca-Cola®, 5d:4x90sec. 90
Figure 3: Scanning electron micrographs (all in the same magnification level of 10.000X) of the surface of groups (A) sound enamel; (B) Citric Acid, 10d:6 x 5min; (C) Citric Acid, 7d:5x3min; (D) Coca-Cola® 7d:5x 3min and (E) Coca-Cola® 5d:4x90sec. 92
LISTA DE TABELAS
Revisão da Literatura
Tabela 1: Parâmetros de pesquisa utilizados em ensaios in vitro de erosão em esmalte
(adaptado de WIEGAND, ATTIN, 2011). 31
Artigo I
Table 1: Data of fluorescence Intensity reduction (%) and attenuation coefficient increase (%)
of each sample. 55
Artigo II
Table 1: Tissue loss (µm) in all groups (mean + SD) after three days of in vitro demineralization and relative mineral loss (percentage of control group). 74
Artigo III
Table 1: Mean of tissue loss (µm) in all groups and by Profilometry and OCT techniques. Mean roughness values and standard deviations of reference and eroded surfaces. 91
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACP - amorphous calcium phosphate/ fosfato de cálcio amorfo AFM - atomic force microscopy/ microscopia de força atômica APF - acidulated phosphate fluoride/ flúor fosfato acidulado
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CCD - Charge-Coupled device/ Dispositivo de câmera acoplada
CETENE - Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste
CLSM - confocal laser scanning microscopy/ microscopia confocal por escaneamento a laser
CPP - casein phosphor-peptide/ caseína fosfopeptídea DEJ - Dentine enamel junction/Junção esmalte dentina
DES-RE - Demineralization and Remineralization/ Desmineralização e Remineralização
DIFOTI - Digital Imaging fibre-optic trans-illumination
EDS - Energy-dispersive X-ray spectroscopy/ Espectroscopia de energia dispersiva
FACEPE - Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco
IR - Infrared/ infravermelho
Laser - Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation LUT - Lookup tables
MB - Mancha branca/ White spot
MET - Microscopia eletrônica de transmissão MEV - Microscopia eletrônica de varredura MHDP - methanehydroxydiphosphonate
MO - Microscópio Optico
NA - numeric aperture/abertura numérica NIR - Near Infra-Red/ Infravermelho próximo OCT - Optical Coherence Tomography
OM - Optical Microscope
PC - Personal computer
PS OCT - Polarization Sensitive Optical Coherence Tomography QLF - Quantitative Light-induced fluorescence
Ra - Roughness average/ Rugosidade média SA - Saliva artificial
SD-OCT - Spectral Domain Optical Coherence Tomography/ Tomografia por coerência óptica no domínio espectral
SLD - superluminescent diode/Diodo superluminescente SPSS - Statistical Package for the Social Sciences
SEM - Scanning Electron Microscope
SE - Elétron Secundário/Secondary electron
STM - Scanning Tunneling Microscope/microscopia de tunelamento com varredura
TCO - Tomografia por coerência óptica UV - Ultraviolet / Ultra-violeta
UFPE - Universidade Federal de Pernambuco ∆F - average change in fluorescence ∆Q - área x ∆F
LISTA DE SÍMBOLOS ºC - graus Celcius ~ - Aproximadamente % - Porcentagem g - Gramas ml - Mililitros mm - Milímetros nm - Nanômetro µm - Micrômetro pH - Potencial de hidrogênio
ppm - Partes por milhão
qsp - Quantidade suficiente para
mW - Miliwatts
kV - Quilovolts
N - Newton
CaF2 - Fluoreto de Cálcio
NaF - Fluoreto de Sódio
F - Flúor
AmF - Amino fluoreto SnF2 - Fluoreto de estanho
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE QUADROS E TABELAS LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS LISTA DE SÍMBOLOS
1.0 INTRODUÇÃO 23
2.0 REVISÃO DA LITERATURA 25
2.1 Perda Mineral por Cárie e Erosão Dentária 25
2.2 Mecanismos de prevenção para erosão dentária 27
2.3 Metodologia de Ensaios Erosivos 29
2.4 Métodos Ópticos para detecção de perda mineral 32 2.4.1 Princípios Físicos dos Métodos Ópticos para detecção de perda mineral 34 2.4.2 Quantificação da Fluorescência induzida por Luz (QLF) 40
2.4.3 Tomografia por Coerência Óptica (OCT) 40
2.4.4 Microscopia por Confocal de escaneamento a laser (CLSM) 42
3.0 OBJETIVOS
ARTIGO I
43
Abstract 45
Introduction 46
Materials and Methods 48
Results 54
Discussion 57
Conclusions 59
ARTIGO II
Abstract 64
Introduction 65
Materials and Methods 68
Results 71 Discussion 74 Conclusions 77 References 77 ARTIGO III Abstract 83 Introduction 84
Materials and Methods 86
Results 90 Discussion 93 Conclusions 96 References 96 CONSIDERACOES FINAIS 100 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 101
1 INTRODUÇÃO
O panorama atual da saúde bucal no Brasil apresenta um cenário de declínio de doenças orais de maior prevalência, como a cárie dental. No entanto, a prevalência da cárie ainda é alta, em torno de 57%, entre crianças aos 12 anos (SBBrasil, 2010). Paralelamente a abordagem de diagnóstico precoce da lesão de cárie, há uma maior preocupação com a perda de tecido dental não decorrente da doença cárie, isto é, sem a presença de bactérias cariogênicas. A perda mineral por erosão química, podendo estar associada à abrasão, tem se tornado um fator de risco para danos a estrutura dentária (JAEGGI, LUSSI, 2006), com registros de prevalência de 64% em jovens adultos (MULIC et al., 2012). O alto consumo de bebidas ácidas, como refrigerantes e sucos de frutas cítricas, torna o esmalte poroso, dissolvendo cristais de esmalte camada por camada, até uma perda volumétrica do esmalte e possível exposição de dentina. Este processo tem o potencial de tornar o esmalte ainda mais vulnerável à abrasão durante a escovação dentária.
Dessa forma, mesmo diante de uma população com altos índices de perda dentária, pesquisas vêm ganhado espaço em buscas da prevenção para as mínimas perdas dentárias por cárie ou erosão, visto que a ultima é decorrente de hábitos comuns difíceis de serem excluídos da rotina diária. Nesse contexto, inúmeras pesquisas buscam elucidar métodos de diagnóstico para detectar a perda mineral mínima, interceptar o processo com meios reparadores, e conscientizar o paciente de sua responsabilidade. O diagnóstico precoce é unânime em vantagens para o tratamento de doenças em todas as áreas da saúde, e os métodos diagnósticos buscam cada vez mais, melhor qualidade e objetividade, sem promover danos ao paciente.
Dentre os meios diagnósticos, além dos recursos imaginológicos por meio dos raios X, pesquisas nas áreas de interface multidisciplinar buscam utilizar outras faixas do espectro eletromagnético, como o infravermelho e ultravioleta, para aplicações em diagnóstico. A utilização dos raios infravermelho e ultravioleta foi expandida com a emissão em forma de laser, que significa uma amplificação do sinal por emissão estimulada da radiação eletromagnética, e detém características
peculiares que permitem diferentes aplicações na área biológica. Para aplicações em diagnóstico, a tecnologia óptica lança mão de lasers com baixa potência, o que permite explorar tecidos vivos de forma não destrutiva, além de exigir mínimo preparo da amostra a ser analisada. Através da quantificação das variadas interações da luz com o tecido, como a reflexão, absorção, fluorescência e espalhamento, o laser tem sido utilizado principalmente como uma ferramenta de diagnóstico precoce associados a diferentes detectores ópticos.
Dentre as técnicas ópticas, algumas são fundamentadas em diferentes propriedades da interação luz - tecido biológico, como o QLF (Quantitative Light Induced Fluorescence) que quantifica alterações da fluorescência dentária (JOSSELIN de JONG et al., 1995), o CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope) que também quantifica a fluorescência, permitindo analisar em melhor resolução através de cortes transversais em profundidade, e o OCT (Optical Coherence Tomography) que analisa alterações ópticas a partir da reflexão e retroespalhamento do tecido biológico (OTIS et al., 2000). As referidas técnicas foram avaliadas em diferentes experimentos de simulação de cárie e erosão dentária visando estabelecer novos parâmetros para caracterização qualitativa e quantitativa da perda mineral mínima da estrutura dentária.
A inovação de técnicas biomédicas ressalta a importância de interação entre as mais diversas linhas de pesquisa, tornando-se multiplicador de opções e soluções. Resgatando a evolução das técnicas, encontra-se razão para acreditar na importância da busca pelo diagnóstico precoce e prevenção, visando evitar o surgimento de novos doentes. O desenvolvimento de pesquisas experimentais, quanto às mínimas perdas minerais do tecido dentário, visa migrar além das lentes de microscópios e bancadas de laboratório para as páginas das revistas científicas, tornando-se realidade social aplicável clinicamente, modificando o alto índice de perdas dentárias na sociedade, particularmente das camadas sociais menos favorecidas.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Perda Mineral por Cárie e Erosão Dentária
O processo carioso é contínuo sempre em busca de um equilíbrio iônico que se desloca de acordo com a variação de reagentes e produtos presentes na cavidade oral. É passível de regressão quando detectado precocemente, com intervenção apenas de agentes preventivos, como o fluoreto, que pode interferir na superfície dente-biofilme-cálculo, remineralizando a integridade do esmalte, como mostrado em diversos trabalhos (TENUTA et al., 2009; CURY, TENUTA, 2008). A doença cárie em seu estágio inicial manifesta-se como mancha branca discreta no esmalte, resultante da desmineralização parcial do tecido mineralizado (BESIC, WIEMANN, 1972).
O processo de diagnóstico da lesão de cárie iniciou com importantes técnicas como a visual e tátil, com espelho e sonda, e vem sendo usada ao longo dos anos até hoje, após limpeza e secagem da superfície como preconizado por Black, (1908). A radiografia intrabucal interproximal foi um marco no diagnóstico complementar desde 1925, preconizada por Raper. Entretanto, essas técnicas atualmente consideradas convencionais, detectam principalmente lesões cavitadas, demonstrando baixa sensibilidade e especificidade para detectar precocemente lesões cariosas (ISMAIL, 2004).
Como exemplo, radiografias interproximais são excelentes para diagnosticar lesões extensas, avançadas e possivelmente cavitadas, mas tem resolução limitada e baixo contraste radiográfico para lesões de mancha branca. Além dos fatores limitantes descritos, é importante ressaltar que a técnica de raios X interproximal, mesmo com as doses mínimas necessárias, trata-se de uma radiação eletromagnética ionizante, portanto formadora de radicais livres, e consequentemente não indicada para análises de monitoramento para proservação de uma lesão de cárie (KO et al., 2008).
Nos dias atuais, principalmente em centros urbanos desenvolvidos, a incidência da cárie dental tem declinado (LUSSI et al., 2011). Entretanto, a manutenção dos dentes, os predispõe a outras lesões dentárias, tal como a erosão. A erosão dental é definida como a perda progressiva de tecido duro dental por um processo químico que não envolve bactérias (AMAECHI; HIGHAM, 2005; DUGMORE; ROCK, 2004; LEVITCH et al., 1994; LUSSI; JAEGGI; SCHARER, 1993) podendo ocorrer em qualquer superfície do dente. A erosão se diferencia de outras lesões tais como abrasão, atrição e abfração (IMFELD, 1996; TEN CATE, IMFELD, 1996), bem como da cárie dentária, por não haver envolvimento bacteriano na perda do tecido dentário, no entanto dificilmente estes fenômenos ocorrem, simultaneamente, no mesmo sítio (IMFELD, 1996; TEN CATE, IMFELD, 1996).
Há vários fatores comportamentais que influenciam no processo de erosão, como o consumo frequente e excessivo de bebidas dietéticas específicas, bem como alcoólicas. Hábitos não usuais de beber e deglutir – por exemplo, reter um refresco ácido na boca antes de deglutir ou fazer um bochecho - podem também aumentar o tempo de contato de uma substancia ácida com o dente, consequentemente aumentando o risco de erosão (MILLWARD et al., 1997; EDWARDS et al., 1998; JOHANSSON et al., 2004). Sucos de frutas, refrigerantes, vinagre e chá gelado são bebidas conhecidas como altamente erosivas, pois são compostas por ácidos, como o cítrico, fosfórico, acético, e por apresentar pH abaixo de 4.5 (LUSSI, JAEGGI, ZERO, 2004).
A desmineralização por erosão depende do tipo de ácido e do tempo que o esmalte fica exposto, o que pode deixá-lo poroso, dissolvendo cristais de hidroxiapatita camada por camada, até uma perda volumétrica do esmalte e possível exposição de dentina (LUSSI et al., 2011). O ácido pode ser de fontes intrínsecas como refluxo gástrico, ou extrínsecas, a depender da frequência de consumo de bebidas ácidas, o que pode ser um hábito comum, difícil de ser excluído, o que leva a ciência a buscar estratégias preventivas e visar o diagnóstico precoce (PARKER, 2009). Vários estudos mostram que o esmalte amolecido é muito susceptível a riscos e danos (EISENBURGER et al., 2003; JAEGGI, LUSSI, 1999; LIPPERT et al., 2004), altamente instável e facilmente removido mesmo com delicado ato físico (EISENBURGER et al., 2003). Portanto, a escovação dentária do esmalte erodido lidera as menores alterações na morfologia de superfície e propriedades mecânicas
(LIPPERT et al., 2004), e foi ainda comprovado que a perda de esmalte causada pela escovação depende do tempo decorrente entre o desafio erosivo e a escovação dentária (JAEGGI, LUSSI, 1999).
Com o aumento da prevalência de erosão dental (JAEGGI, LUSSI, 2006), o manejo clínico deste quadro vem se tornando um importante aspecto de saúde dentária, junto aos cuidados da cárie e da doença periodontal. Neste contexto, acredita-se que além do atendimento clínico, o contato com o profissional de saúde bucal, deve ser um momento de motivação e conscientização para que o paciente compreenda que é o principal agente responsável por fornecer flúor a cavidade oral, através de 90% dos dentifrícios. É extremamente válido que o paciente seja conscientizado do estágio inicial de sua condição oral, para avaliar possíveis danos provocados ao esmalte por hábitos prévios.
2.2 Mecanismos de prevenção para erosão dentária
O impacto do tratamento com fluoretos na progressão da erosão do esmalte e dentina vem sendo analisado em vários estudos. Tem sido demostrado in vitro que tratamentos com fluoretos, como fluoreto de sódio, amino fluoreto ou flúor fosfato acidulado, forma a precipitação do CaF2 na superfície erodida (GANSS, et al., 2004;
GANSS, KLIMEK, STARCK, 2004). A formação da camada de CaF2 e seu efeito
protetor na desmineralização depende do pH, da concentração de F, e do tipo de sal do agente fluoreto (SAXEGAARD, ROLLA, 1988). Entretanto, todo o processo de aplicação do fluoreto na prevenção da erosão continua em discussão repleta de controvérsias (WIEGAND, ATTIN, 2003), desde que o depósito de CaF2 a partir de
aplicações de fluoretos tópicos parece ser dissolvido pela maioria das bebidas ácidas (GANSS, et al. 2007), removendo traços de um prévio tratamento de flúor tópico (LARSEN, RICHARDS, 2002).
A eficácia dos fluoretos no processo de desmineralização e remineralização é relacionada com a concentração e o pH do agente fluoreto. Além de que, a alta concentração de agentes fluoretantes como enxaguantes orais, géis e vernizes, tem demonstrado aumento na resistência à abrasão e diminuição do desenvolvimento
dos processos erosivos no esmalte e dentina em ensaios in vitro e in situ (GANSS, et al. 2004). Dependendo do desenho do estudo, a aplicação de altas concentrações do agente flúor pode resultar em redução completa do processo de erosão dentária.
A maioria dos estudos focando o efeito preventivo do fluoreto na erosão, avalia compostos de flúor indicados na prevenção da cárie, como o NaF, AmF, SnF2
e o flúor fosfato acidulado (APF) (de 12,300 a 22,600 ppmF, pH 1.0 para 7.0). Várias estratégias têm sido testadas para controlar a erosão no esmalte, como a aplicação tópica de formulações de fluoreto ou de fosfato de cálcio. Outras opções consistem na adição de cálcio, fosfato, ferro, sulfato ferroso, ions de estanho e/ou hexametafosfato de sódio a enxaguantes orais ou dentifrícios (LUSSI, 2009).
Dentre esses, um agente que tem se mostrado também promissor sob condições médias e severas de erosão é o íon estanho (TINANOFF, 1995, GANSS et al, 2004). Pouco se sabe sobre a interação entre o íon estanho e a dureza do tecido dentário; razão pela qual seu potencial anti-erosivo continua não descrito. A aplicação de soluções contendo estanho é direcionada a depositar-se na superfície do dente (WILLUMSEN, 2004; HOVE, 2008) e há indicações que esta deposição é relativamente resistente a dissolução ácida (MOAZZEZ, 2004; HJORTSJO, 2008). É sabido que o íon de estanho reage com a hidroxiapatita pura (YOUNG, 2006; SCHLUETER, 2007) na superfície do tecido dentário, (WILLUMSEN, 2004; BIRKHED, HEINTZE, 1989) resultando na redução da solubilidade da hidroxiapatita ou do esmalte (MOAZZEZ, 2004; SREEBNY, 1996; GANSS, 2004).
Em um novo conceito de remineralização dentária, baseado na molécula da fluorpatita Ca10(PO4)6F2, foi questionado se a disponibilidade de cálcio e fosfato pode
ser um fator limitante, visto que a molécula da hidroxiapatita é formada por dez elementos de Ca, e seis de fosfato (REYNOLDS, 2008). No entanto, a maioria dos tratamentos visa à aplicação tópica apenas de flúor, o qual representa o mínimo de elementos químicos na hidroxiapatita.
Alguns testes com aplicações clínicas de cálcio e fosfato mostraram insucesso devido à baixa solubilidade do fosfato de cálcio, principalmente na presença do flúor. Dessa forma, foi necessário associar leve acidez para aumentar a solubilidade e difusão desses íons na lesão de subsuperfície do esmalte. Por outro lado, visto que os íons de cálcio e fosfato tem alta tendência de precipitar e não se
manter disponível na cavidade oral, a aplicação torna-se limitada a baixas concentrações (REYNOLDS, 2008). Diante dessas limitações, sistemas remineralizadores baseados em fosfato de cálcio vêm sendo desenvolvidos e comercializados, com o principal intuito de aumentar a biodisponibilidade dos íons cálcio e fosfato para o processo de remineralização dentária. A aplicação dessas técnicas vem ganhando espaço em diferentes produtos de higiene oral, com a prosposta de ampliar o uso para chicletes e outros alimentos.
O sistema conhecido como CPP-ACP (Recaldent™) foi desenvolvido por E.C. Reynolds, professor da Universidade de Melbourne, Austrália, com estudos desde 1997. Consiste em nanocomplexos de fosfato de cálcio amorfo (ACP) estabilizada pela caseína fosfopeptídea (CPP), impedindo que nano aglomerados de ACP cresçam para tamanhos críticos e se transformem. Dessa forma, consegue manter altas concentrações de íons cálcio e fosfato, junto com íons flúor, na superfície do dente seja através da película ou do biofilme dental em estado biodisponível. Em estudo clínico com enxaguante oral, a tecnologia CPP-ACP apresentou-se superior a não estabilizada ACP (REYNOLDS, 1999), mostrando a importância da CPP para estabilizar altos níveis, estado supersaturado, de ions cálcio e fosfato, e disponibilizá-los à superfície dental, fazendo possível a remineralização (RAHIOTIS, VOUGIOUKLAKIS, 2007). Fundamentalmente a tecnologia CPP-ACP promete remineralizacao sem adição de flúor, no entanto foi demonstrado em estudos que o fosfato de cálcio amorfo pode interagir com o flúor, formando a fase ACFP (REYNOLDS, 2008).
2.3 Metodologia de Ensaios Erosivos
Com o aumento da prevalência da erosão, muitas pesquisas passaram a ser desenvolvidas para avaliar o potencial erosivo de algumas bebidas ou produtos, ou mesmo para testar meios de prevenção. Essas pesquisas deveriam ser idealmente conduzidas clinicamente in vivo, utilizando técnicas não destrutivas e de alta resolução para quantificação intra-oral. Entretanto muitas das técnicas disponíveis para clínica não dispõem de resolução e acurácia suficientes para mensurar a perda
mineral (HUYSMANS et al., 2011). Portanto, os modelos in situ e in vitro ainda são predominantes, permitindo controles estritos de testes de variáveis específicas e tempo de exposição, além de permitir o uso de tecnologias padrões para mensurar o desgaste do tecido dentário (WEST, DAVIES, AMAECHI, 2011).
A diferença quantitativa de perda mineral entre estudos in situ e in vitro, ocorre provavelmente devido aos efeitos naturais de proteção como a presença de proteínas na saliva e a película adquirida nos estudos in situ (WEST et al., 1999; YOUNG et al., 2006). Ressalta-se ainda que a simplicidade das pesquisas in vitro é fundamental para se definir a trajetória inicial, e as tendências de novos estudos, visto o controle e o maior número de variáveis que pode ser testado (WEST, DAVIES, AMAECHI, 2011). No entanto, os estudos in vitro devem buscar mimetizar os reais desafios erosivos observados no dia-a-dia, através de modelos representativos como a ciclagem erosiva com múltiplas exposições ao ácido. Essa metodologia de ciclagem por utilizar múltiplas imersões durante minutos é também viável para reavaliações em estudos in situ, os quais simulam condição oral mais efetiva.
No entanto, mesmo considerando apenas pesquisas que utilizaram ciclagem erosiva com múltiplas exposições, observa-se ainda grande variedade quanto ao número de dias, número de ciclagens por dia, duração de cada ciclo, e tipo de solução erosiva e amarzenamento intermediário, como pode ser constatado na tabela 1 abaixo.
Tabela 1: Parâmetros de pesquisa utilizados em ensaios in vitro de erosão em esmalte (adaptado de WIEGAND, ATTIN, 2011).
Estudo
Esmalte Ciclagem Erosão
Meio intermediário armazenamento Origem Dias, ciclos/dia Duração/
ciclo Meio Duração Meio HARA et al. [2009] Humano 3 d, 3x/dia 2 min Ácido cítrico,
pH 3.75 60 min SA LAGERWEIJ et al. [2006] Bovino 14 d, 6x/dia 30 s Ácido cítrico, pH 2.3 Alguns minutos SA MORETTO et al.
[2010] Bovino 7 d, 4x/dia 5 min
Sprite, pH
2.8 Nenhum
YU et al. [2009] Humano 10 d, 6x/dia 1 min Ácido cítrico 30 min SA ROCHEL et al.
(2011) Bovino 7d, 4x/dia 2 min Coca-Cola 2 hs SA
WEGEHAUPT,
ATTIN, (2010) Bovino 20d, 6x/dia 20 s
Ácido
clorídrico 1h SA GANSS et al., 2008 Humano 10d, 6x/dia 2 min Ácido Cítrico 1,5hs SA SCHLUETER., 2009 Humano 10d, 6x/dia 2 e 5 min Ácido Cítrico 1h SA MAGALHAES et al.,
2012 Bovino 5d, 4x/dia 90s Coca-Cola 1h SA
LEVY et al., 2011 Bovino 5d, 4x/dia 90s Coca-Cola 1h SA
SA: Saliva artificial.
Como observado, modelos de estudos erosivos in vitro têm sido extremamente reproduzidos, pois podem ser realizados em curto período de tempo, requerem menor número de participantes, além de menor custo. No entanto, os resultados não podem representar a realidade da condição oral, visto que outros fatores estariam envolvidos. Considerando que os estudos in vitro podem ter variáveis da ciclagem erosiva controladas, como a temperatura, o pH e a concentração da solução ácida, o uso e tipo de saliva artificial, bem como a agitação e o tempo de exposição da amostra na solução, torna-se indispensável que esses fatores sejam descritos na publicação dos resultados, visto que são cruciais para a comparação dos métodos erosivos e preventivos (WEST, DAVIES, AMAECHI, 2011).
A diversidade de soluções e modelos erosivos dificulta a comparação dentre as pesquisas desenvolvidas, logo se busca padronizar ciclagens erosivas para estabelecer um desafio erosivo suficiente para visualizar os possíveis danos da solução ácida, bem como quantificar o efeito protetor dos fluoretos. Como demonstrado posteriormente por Ganss et al. (2012), o protocolo erosivo pode não ser suficiente para quantificar o efeito preventivo do produto testado. Além disso, é indispensável que a técnica de caracterização a ser utilizada para comparação dos métodos disponha de resolução suficiente para visualizar as diferenças entre os efeitos erosivos e preventivos.
2.4 Métodos Ópticos para detecção de perda mineral
Visando possibilitar uma melhor comunicação no diálogo de motivação entre profissionais e pacientes, métodos diagnósticos vêm sendo desenvolvidos para a detecção de lesões precocemente, e monitoramento da lesão pelo profissional e pelo paciente. Acredita-se que ao visualizar a lesão através de imagens diagnósticas, o paciente terá maior compromisso em proporcionar meios de higiene, como escovação e fio dental, para regressão da lesão, além de retornar para a próxima consulta para verificar se os procedimentos estão sendo efetivos.
Na última década, novas técnicas ópticas para detecção precoce de cárie foram desenvolvidas, dentre as tecnologias, algumas se encontram comercializadas em âmbito clínico, e outras estão em fase experimental em laboratório de pesquisas. Dentre as mais populares e comercializadas clinicamente em alguns países, enumeramos: a DIFOTI (Digital Imaging fibre-optic trans-illumination) (SCHNEIDERMAN et al., 1997), a qual se baseia em transiluminação com luz visível comercializada pela Electro-Optical Sciences, Inc. (Irvington, NY, EUA); o QLF (Quantitative Light-induced fluorescence) (JOSSELIN de JONG et al., 1995) baseia-se na quantificação da fluorescência excitada com luz azul em torno de 380nm, desenvolvido e comercializado por grupo holandês, Inspecktor Research System (Amsterdam, Holanda); e o DIAGNOdent baseado no sinal fluorescência apos
excitação com vermelho, em torno de 680nm, sendo o mais popular no Brasil, comercializado pela KaVo (Charlotte, Carolina do Norte, EUA).
Outras técnicas de maior complexidade tecnológica mostram bons resultados laboratoriais in vitro, e estão em fase de desenvolvimento para maior aproximação entre as quantificações matemáticas e o diagnóstico clínico. Dentre as diversas técnicas, destaca-se: a NIR Transillumination imaging baseada em transiluminação com laser no infravermelho (JONES et al., 2003; BUHLER et al., 2005; KARLSSON et al., 2010); a OCT - Tomografia por coerência óptica (OTIS et al., 2000) baseada em secções internas da amostra através da analise do sinal de retroespalhamento da luz, usando laser no infravermelho, em torno de 830nm a 1300nm; e a espectroscopia Raman associada a OCT (KO et al., 2005), que analisa a amostra bioquimicamente através da vibração molecular, e detecta perda mineral na estrutura.
Para estudos in vitro, e desenvolvimento metodológico para quantificação de perda mineral decorrente também de lesões erosivas, outros métodos qualitativos laboratoriais, maioria de formas de microscopia, tem sido aplicados de forma independente ou combinados a resultados quantitativos. Dentre estes métodos, cita-se: a microscopia de luz transmitida, a microscopia confocal de varredura a laser (CLSM – confocal laser scanning microscopy), microscopia eletrônica de transmissão (MET), microscopia eletrônica de varredura (MEV/SEM – scanning
eletronic microscope), espectroscopia de energia dispersiva (EDS - energy-dispersive X-ray spectroscopy), microscopia de força atômica (AFM - atomic force microscopy) e microscopia de tunelamento com varredura (STM - scanning tunneling microscope), e a espectrometria de massa de íon secundário (SCHLUETER, HARA,
SHELLIS, GANNS, 2011).
Cada um dos métodos existentes apresentam vantagens, desvantagens e limitações. Como exemplo a perfilometria de contato, que apesar da ampla utilização por pesquisadores e boa reprodutibilidade, apresenta a desvantagem de ser destrutiva, como observado na figura 1. Entretanto, a utilização conjunta dos resultados de diversos métodos pode preencher adequadamente a maior parte das necessidades das pesquisas envolvendo perda mineral dentária. Não obstante, ainda há grande necessidade para o desenvolvimento, avaliação e, principalmente,
validação de novos métodos que podem vir a melhorar sobremaneira o estudo da perda mineral em todas as fases e nos diversos modelos de estudo, in vitro, in situ, bem como em ensaios clínicos (SCHLUETER, et al., 2011).
Figura 1: Micrografia por microscopia eletrônica de varredura evidenciando os danos causados pela ponta de diamante da perfilometria de contato em região de esmalte dentário previamente erodido. Micrografia MEV CETENE.
2.4.1 Princípios Físicos dos Métodos Ópticos para detecção de perda mineral
Em geral, as técnicas ópticas por apresentarem a vantagem de serem não destrutivas, tem ganhado espaço dentre as técnicas desenvolvidas para detectar perda mineral dentária. Baseado nos conceitos de interação da energia aplicada ao dente, ou na observação da energia que é emitida a partir do dente (HALL, GIRKIN, 2004), os métodos ópticos usam a energia da luz visível, incluindo ainda o ultravioleta e infra-vermenlho (figura 2).
Figura 2: Espectro eletromagnético, com ênfase para os comprimentos de onda da física óptica. Incluindo o ultravioleta e infravermelho. Ilustração adaptada por Ana
Marly A. Maia.
Ao interagir com a estrutura dentária, essa energia pode interagir enquanto onda eletromagnética, de acordo com os conceitos de reflexão, absorção que pode ser seguida de fluorescência, transiluminação, espalhamento e retroespalhamento (HALL, GIRKIN, 2004). Por ser de fundamental importância conhecer as propriedades da onda eletromagnética e da estrutura observada, buscou-se relembrar os conceitos de interação luz com a matéria. Em geral, a área desmineralizada torna-se porosa, o que aumenta o espalhamento da luz incidente, levando essa região a parecer mais esbranquiçada, portanto nomeada de mancha branca. Na figura 3, por meio de um desenho esquemático, são demonstradas as interações ópticas entre o elemento dentário e a onda eletromagnética. Estas diferentes propriedades ópticas podem ser quantificadas de diferentes formas, a depender do comprimento de onda e dos detectores ópticos.
Figura 3: Esquema de propriedades ópticas na interação laser-tecido. Ilustracão
adaptada por Ana Marly A. Maia.
A propriedade da reflexão é a mais popularmente conhecida no meio clínico odontológico, obtida macroscopicamente através do uso do espelho oral plano ou convexo. É um fenômeno de superfície que resulta na mudança de direção da onda, um exemplo clássico dessa propriedade na clínica odontológica é quando o espelho bucal proporciona a iluminação e visualização das superfícies linguais ou palatinas dos dentes, como mostrado na figura 4 (a), sendo nossos olhos os detectores óticos naturais. A estrutura cristalina do esmalte permite a passagem da luz, propriedade chamada de transmissão, neste caso difusa. A figura 4 (b) demontra a observação da luz transmitida da face vestibular para a lingual dos incisivos inferiores.
Figura 4: (a) Imagem da superfície lingual dos dentes superiores refletida no espelho bucal; (b) Imagem da superfície lingual dos dentes infeirores após luz transmitida, observar translucidez do esmalte. Fotografia arquivo pessoal.
O espalhamento consiste na mudança de direção do feixe de luz sem perda de energia, visto que a luz é forçada a desviar quando interage com partículas menores ou objetos que provoquem essa propriedade. A intensidade do espalhamento da luz depende também do comprimento de onda e do material, podendo levar a dissipação de energia. A cárie dentária inicial, devido a maior porosidade estrutural e grande número de obstáculos difusores, é um meio espalhador, e por provocar maior espalhamento da luz apresenta-se como uma mancha branca (ANGMAR-MANSSON, TEN BOSCH, 1993). O espalhamento é dependente do comprimento de onda, de forma que ondas menores apresentam maior espalhamento (HALL, GIRKIN, 2004). E vários métodos ópticos quantificam a quantidade de luz espalhada por transiluminação ou por retroespalhamento.
Os efeitos do espalhamento podem ser ressaltados ao comparar a luz refletida e transmitida do dente cariado, como demonstrado nas figuras 5 a e b. A luz branca refeletida sofre maior espalhamento no tecido demineralizado, processo chamado também de retroespalhamento, apresentando-se como mancha branca, figura 5 (a). No entanto, observando a luz transmitida através do dente, observa-se que o tecido sadio que apresenta cristais translúcidos e organizados, permite a passagem efetiva da luz, no entanto, na região do tecido cariado, ou mancha branca
(MB) que sofreu modificações estruturais com presença de poros, bactérias, e outros constituintes, a luz é pouco transmitida, como pode ser observada na figura 5 (b). Observar como o contraste entre a mancha branca e o esmalte sadio é maior na amostra com luz branca transiluminada 5 (b).
Figura 5: (a) Aparência do contraste da superfície sadia e desmineralizada (MB) com luz branca refletida, com reflexos de saturação (R) e baixo contraste; (b) Aparência do contraste na mesma região, através da luz transmitida de dentro da amostra para
o detector óptico, logo sem reflexos (R). Fotografia arquivo pessoal.
Devido à diminuição do espalhamento com o aumento do comprimento de onda, o infravermelho próximo mostra-se como eficiente fonte de luz para iluminar a estrutura dentária como meio de diagnóstico. Visto que o esmalte sadio promove baixa atenuação na faixa do infravermelho, e a cárie é um meio espalhador, observa-se um aumento do contraste óptico entre o sadio e o cariado. Métodos de detecção de cárie são baseados nas diferenças de espalhamento entre o sadio e cariado, através da quantificação da onda eletromagnética no infravermelho transmitida, como publicado em Maia et al., 2011, figura 6 (a) e (b).
Figura 6: Secção dentária transiluminada. (a) Laser infravermelho 1300nm; (b) Luz branca. Fotografia arquivo pessoal.
A absorção é o processo de interação da luz em que o fóton é interrompido por um objeto e sua energia dissipada para a estrutura. A energia perdida pode ser convertida e posteriormente transformada em calor, ou em outros comprimentos de onda de menor energia e maior comprimento de onda. Dentre exemplos na Odontologia observamos a propriedade de absorção da luz durante a fotopolimerização da resina composta contendo canforquinona, no clareamento com géis fotoabsorvedores e na terapia fotodinâmica.
Após a absorção, a energia pode ser emitida em maior comprimento de onda, através do processo de fluorescência, decorrente da interação da luz com os fluoróforos da estrutura dentária. A energia é convertida para um nível mais alto de energia, no qual o elétron permanece por pequeno intervalo de tempo. Em seguida, o elétron pode decair para um estágio energético menor e liberar a energia acumulada em um comprimento de onda maior, resultando na emissão da fluorescência. A estrutura dentária dispõe de autofluorescência, sem necessitar da adição de substância luminescente (BENEDICT, 1928), e a desmineralização resulta em perda da referida autofluorescência (BORISOVA et al., 2006), a qual pode ser quantificada por métodos ópticos.
2.4.2 Quantificação da Fluorescência induzida por Luz (QLF)
A aplicação clínica do QLF, traduzido como quantificação da fluorescência induzida por luz, promove imagens por fluorescência da lesão de cárie, podendo esta ser quantificada em extensão e perda mineral. Um dos meios de se obter fluorescência do elemento dentário, é usar uma fonte de luz fluorescente, que para o QLF foi escolhido azul visível e ultra-violeta, com comprimento de onda em torno de 380nm, visto que o dente quando excitado com ultra violeta, emite fluorescência no azul, e quando excitado com verde e azul, emite fluorescência no amarelo e laranja em diferentes intensidades (ANGMAR-MANSSON, TEN BOSCH, 2001).
Como meio de bloquear a reflexão da luz azul, utiliza-se um filtro amarelo, que proporciona apenas a observação do comprimento de onda emitido como fluorescência. No entanto, nas regiões cariadas há diminuição da emissão da fluorescência, ressaltando o contraste entre a região sadia e cariada. A diminuição da fluorescência da região de cárie ocorre devido a alguns mecanismos: como o alto espalhamento da luz que impede a penetração da luz para que seja absorvida e convertida, emitindo consequentemente pouca fluorescência; além do espalhamento atuar como uma barreira impedindo que a luz penetre até a dentina, responsável por grande parte da fluorescência; e ainda devido a possíveis alterações moleculares nas proteínas cromóforas responsáveis pela fluorescência natural do elemento dentário (ANGMAR MASSON, TEN BOSCH, 2001).
Dessa forma a imagem captada por uma câmera CCD, apresenta-se com um maior contraste entre o tecido sadio (fluorescente), e o meio cariado espalhador e com menor fluorescência. Imagem esta que evidencia a lesão cariosa podendo ser observada facilmente pelo paciente durante o exame clínico, e assim motivá-lo para melhorar a higiene oral. O sistema permite repetidas análises, sem danos ao paciente, o que proporciona um monitoramento da lesão ao longo do tempo.
2.4.3 Tomografia por Coerência Òptica (TCO)
A Tomografia por Coerência Óptica (TCO), no entanto mais conhecida pela sigla em inglês OCT, é também considerada não invasiva e não destrutiva. Baseada na propriedade do retroespalhamento da luz laser após interação com o material
analisado, a TCO utiliza laser no infravermelho 850 nm a 1300nm, sendo o maior comprimento de onda aplicado para obter maior penetração nas amostras dentárias, como demonstrado anteriormente (FONSECA et al, 2008). As imagens da TCO são obtidas através de uma série de processamentos decorridos da interação óptica básica de interferência entre um feixe retroespalhado com um feixe de referencia. Por se tratar de um tomógrafo fornece imagens seccionadas de estruturas internas, em tempo real, e com alto poder de resolução espacial (FUJIMOTO, 2003). Enquanto imagem tomográfica, a TCO tem sido utilizada para diversos fins, como avaliação da interface de restaurações (MELO et al., 2005; MONTEIRO et al., 2011), para o diagnóstico de cárie (FREITAS et al., 2006; MAIA et al., 2010), para análise de materiais dentários (KYOTOKU et al., 2007; BRAZ et al., 2008), detecção precoce de câncer oral (JUNG et al., 2005), detecção de cáries recorrentes e adaptação marginal de restaurações (OTIS et al., 2000) e caracterização de estruturas periodontais (COLSTON et al., 1998; OTIS et al. 2000).
A configuração óptica da TCO consiste em um interferômetro de Michelson, o qual requer uma fonte de luz de banda larga de baixa coerência, podendo ser laser ou diodo superluminescente. Os fundamentos da interferometria avaliam a sobreposição de ondas eletromagnética em um sistema, com um divisor de feixes de radiação que pode ser um prisma ou através de fibras ópticas, que divide a radiação da fonte em duas direções com 50% cada. Metade da intensidade da luz interage com a amostra estudada, e a outra metade é totalmente refletida por um espelho móvel, tendo suas características preservadas. A radiação retroespalhada da amostra estudada carrega os sinais de alterações, e se recombina com a radiação refletida 100% pelo espelho de referência, sendo então comparadas quanto aos padrões de interferência quando analisadas pelo espectrômetro. Para melhor resolução da imagem a ser formada, a radiação passa por uma grade de difração que divide o feixe de luz para que o sinal seja analisado pontualmente. Deste modo, diferentes graus de interferência da radiação advindos da estrutura estudada podem ser observados, dando origem a uma imagem de corte tomográfico, conhecida como B Scan, a qual é formada por sinais de interferência pontual, conhecida como A Scan (FUJIMOTO, 2003).
A análise do sinal óptico pode ser quantificada através de processamentos da intensidade ou do decaimento da luz no tecido analisado. A análise matemática do
comportamento da luz observado deve permitir mínima influência das habilidades do operador, e compensar qualquer deficiência do mesmo (ANGMAR MASSON, TEN BOSCH, 2001). Considerando a necessidade de proporcionar sistemas cada vez mais independentes do subjetivismo clínico, buscou-se processar imagens para calcular alterações do tecido dentário com maior precisão. No caso do esmalte dentário, observa-se que regiões cariadas que são meio espalhadores, apresentam um coeficiente de atenuação maior, não permitindo a passagem da luz através da estrutura.
2.4.4 Microscopia por Confocal de escaneamento a laser (CLSM)
A técnica baseia-se na redução da detecção da quantidade de luz espalhada através do isolamento do sinal de resposta do foco do scanner. Um microscópio convencional de fluorescência de amplo espectro coleta luz de todo o volume do espécime, resultando na aquisição de fluorescência por partes do espécime que não se encontram exatamente no plano focal que está sendo examinado, o que leva a uma perda severa dos detalhes da imagem. Um microscópio confocal tem a habilidade de remover a fluorescência de quase toda a extensão do espécime que não se encontra no plano focal, resultando em uma imagem mais clara e definida (SHEPPARD, SHOTTON, 1997).
Como o ponto de foco encontra-se escaneando em torno do tecido, o sinal detectado deste é usado para construir uma alta resolução (<1micron) de imagem do tecido (BOYDE, 1985). O foco de luz visível no tecido não pode ser mantido em profundidades maiores de 300 micrometros, visto que o desafio do espalhamento torna-se bem maior. Portanto, imagem 3D de alta resolução pode ser obtida por escaneamento de posições profundas com pontos focais sequenciados, até uma profundidade limítrofe em torno de 300µm (HILLMAN, BURGESS, 2009).
OBJETIVO GERAL
Avaliar e caracterizar a aplicabilidade de técnicas ópticas para qualificar e quantificar a perda mineral por cárie ou erosão dentária, elucidando a importância do conhecimento integrado das propriedades ópticas da interação laser-tecido (in vitro).
Objetivos Específicos
Estabelecer comparações quanto aos métodos de QLF, com a diminuição de fluorescência, e da OCT, com o aumento do coeficiente de atenuação, na análise de detecção de cárie precoce no esmalte dentário (artigo I);
Analisar o sinal de decaimento da luz (A-Scan) segundo o coeficiente de decaimento da luz para diferenciar o comportamento da luz em áreas sadias e cariadas quando analisadas pela Tomografia por coerência optica (artigo I);
Caracterizar a superfície erodida de esmalte através da microscopia confocal com escaneamento a laser (artigo II);
Quantificar o efeito protetor do fluoreto de estanho e o fluoreto de sódio, e da caseína fosfopeptidea associada ao fluoreto de sódio, contra a erosão dentária através de mensurações de batentes entre a área sadia e erodida, utilizando as imagens seccionais da microscopia confocal com escaneamento a laser (artigo II);
Aplicar a tomografia por coerência optica como método para análise de perfil ótico, a ser comparado com a perfilometria de contato, na mensuração de perda mineral entre região sadia e erodida (artigo III);
Comparar protocolos de múltipla exposição previamente realizados em ensaios erosivos para estabelecer parâmetros de julgamento quanto ao protocolo adequado para visualizar o dano real e o efeito protetor do fluoreto testado (artigo III);
