Métodos Analíticos para o Estudo de Interações Proteína-DNA

A existência de interações do tipo proteína-DNA em muitos processos biológicos essenciais, bem como durante a ocorrência de diversas doenças, remete à necessidade do desenvolvimento de métodos analíticos que sejam simples e de baixo custo e que sejam capazes de fornecer respostas rápidas a fim de se investigar tais eventos de interação. Neste sentido, diversos métodos têm sido propostos [26] para este fim, entre os quais podem ser citados os ensaios de desvio de mobilidade eletroforética [107], calorimetria de titulação isotérmica [108], ensaios pull-down [109], ressonância plasmon de superfície (SPR) [110], ressonância magnética nuclear [111] e cristalografia de raios X [112]. Apesar de seu desempenho satisfatório, tais técnicas são geralmente lentas, de alto custo, envolvem procedimentos complexos e muitas vezes trabalhosos, além do fato de requererem marcadores fluorescentes ou radioativos [113], os quais podem ser tóxicos tanto à saúde humana quanto ao meio ambiente.

Neste contexto, técnicas eletroquímicas tais como a VPD e a EIE aliadas a dispositivos eletroquímicos baseados em DNA emergem como alternativas promissoras aos métodos previamente mencionados devido a características como análise rápida, relativo baixo custo e redução no uso de reagentes tóxicos. Consequentemente, o emprego de tais métodos para se monitorar e investigar interações do tipo proteína-DNA tem sido cada vez mais frequente e é

reportado em um crescente número de publicações [81,82,114–119]. Por exemplo, Machini; Marques e Oliveira-Brett (2019) [82] empregaram um ECV modificado com dupla-fita de DNA (via adsorção física) a fim de avaliar a interação de tais biomoléculas com o anticorpo monoclonal Nivolumab® (utilizado em imunoterapia para tratamento de melanoma metastático, linfoma de Hodgkin, câncer renal e câncer de pulmão). Por meio das técnicas de VPD, EIE e microbalança de cristal de quartzo, os autores verificaram que o anticorpo se liga ao DNA com elevada afinidade e promove alterações estruturais, sobretudo a partir da liberação de moléculas de adenina da cadeia, o que justifica sua atividade terapêutica. Os resultados obtidos com a plataforma foram validados a partir da realização de ensaios de interação empregando-se eletroforese em gel.

Macazo; Karpel e White (2015) [117] reportaram a modificação de um AuE com simples-fitas de DNA conjugadas ao marcador redox azul de metileno para o estudo do mecanismo de ligação da proteína g32p (isolada do vírus bacteriófago T4 e conhecida por interagir com a simples-fita do DNA) a tais sequências. A partir de variações na corrente de oxidação do azul metileno induzidas pela interação da proteína estudada com a sequência imobilizada e monitoradas por VOQ, os autores puderam comprovar que a ligação da cadeia polipeptídica completa da proteína g32p à hélice simples do DNA ocorre cooperativamente, enquanto que a interação do domínio *III (core) demonstrou ocorrer de maneira não- cooperativa. Além disso, os autores observaram que o evento de ligação DNA-g32p foi dependente da força iônica do meio e também do número de oligonucleotídeos que compõe a sequência.

Li e colaboradores (2017) [119] recentemente desenvolveram um ensaio para se detectar por VOQ a interação de três fatores de transcrição (NF-κB, SP6 RNA polimerase e HNF-4α) com sequências específicas de DNA. O sistema desenvolvido foi baseado na hibridização de cadeias bifuncionais de DNA (contendo uma desoxiribozima na extremidade 5’e uma sequência de ligação aos fatores de transcrição na extremidade 3’) com oligonucleotídeos funcionalizados com azul de metileno e imobilizados em AuEs. Na ausência dos fatores de transcrição estudados, a desoxirribozima foi capaz de clivar o DNA inicialmente imobilizado, liberando a molécula de azul de metileno, o que conduziu a uma diminuição do sinal de corrente observado. Por outro lado, na presença das proteínas investigadas, a desoxirribozima apresentou uma redução em sua atividade catalítica, de modo que a molécula do marcador redox permaneceu ligada aos oligonucleotídeos, resultando em maiores valores de corrente (Figura 1.9). O sistema desenvolvido apresentou elevada especificidade e versatilidade, podendo ser facilmente adaptado para a detecção de outras proteínas.

Figura 1.9 – Princípio de funcionamento do biossensor reportado por Li e colaboradores [119] para a detecção da interação dos fatores de transcrição NF-κB, SP6 RNA polimerase e HNF-4α com sequências de DNA.

Fonte: Adaptado da referência [119].

No estudo desenvolvido por Dai e colaboradores (2019) [81], eletrodos impressos contendo AuNPs foram modificados com a proteína hnRNP H1 (ribonucleoproteína nuclear heterogênea H1), a qual reconhece especificamente sequências de DNA ricas em guanina. A detecção da presença de tais sequências por meio de sua ligação a proteínas específicas apresenta relevância clínica, uma vez que sequências com uma quantidade elevada de guanina podem favorecer a formação de triplex e quadruplex de DNA. Estes, por sua vez, podem afetar processos de replicação e transcrição e desta forma favorecer o desenvolvimento de doenças como câncer e desordens neurodegenerativas. A formação dos complexos hnRNP H1-DNA na superfície dos eletrodos foi monitorada a partir de variações de corrente medidas por VPD na presença do marcador redox [Fe(CN)6]3-/4-. A plataforma desenvolvida foi ainda capaz de diferenciar oligonucleotídeos com diferenças estruturais pontuais (AGGGG, AGGGC, AGGGA e AAAAA), o que denotou a elevada especificidade do dispositivo desenvolvido.

A partir dos trabalhos mencionados, é possível considerar que técnicas e dispositivos eletroquímicos podem apresentar aplicações promissoras tanto na detecção de interações proteína-DNA quanto no estudo das mesmas. A versatilidade apresentada por tais sistemas, somada à rapidez de resposta, alta sensibilidade, relativo baixo custo e possibilidade de miniaturização, favorece que os mesmos sejam cada vez mais estudados e aperfeiçoados, aumentando seu potencial de utilização na investigação de eventos de interação entre as biomoléculas mencionadas.

E (V)

I (

A