Métodos Estatísticos

Todos os dados foram expressos com média ± desvio padrão de triplicatas, e o teste ANOVA foi usado para a análise estatística. Os valores foram considerados significantemente diferentes quando o valor de p foi menor que 0,05 (p<0,05).

4. RESULTADOS

4.1 - Análises Químicas

Os percentuais de açúcares totais, sulfato e proteínas das frações contendo os polissacarídeos analisados estão mostrados na tabela 04.

Os resultados dessas análises demonstraram baixa contaminação protéica no fucoidan (0,80 %) e na fração F0,5 (0,90%), e também nas carragenanas kappa (1,10 %) e iota (1,50 %), enquanto na F1,1 (2,56 %) e na carragenana lambda (2,00%) essa contaminação foi maior. Para a dosagem de açúcares totais o fucoidan (55,20 %), F0,5 (80,24 %) e F1,1 (70,10 %) apresentaram mais de 50% de açúcar na amostra, o mesmo foi observado para as carragenanas lambda (64,26 %), kappa (72,00 %) e iota (65,98 %). A concentração de sulfato determinada pelo método turbidimétrico foi observada em maior quantidade para o fucoidan (44,10 %) e para a carragenana lambda (33,38 %), seguidas da F1,1 (27,57 %) e da carragenana iota (27,60 %). A F0,5 (18,40 %) e a carragenana kappa (17,90 %) apresentaram os graus de sulfatações menores com relação às outras amostras.

Tabela 04. Componentes Químicos dos Polissacarídeos sulfatados (%)

Polissacarídeos Açúcares totaisa _Sulfatob _Proteínasc

Fucoidan 55,20±1,43 44,10±0,16 0,80±0,39 F 0,5 80,24±3.23 18,40±0,28 0,90±0,83 F 1,1 70,10±2,02 27,57±0,18 2,56±0,24 C-lambda 64,26±2,36 33,38±0,06 2,00±0,45 C-kappa 72,00±3,66 17,90±0,05 1.10±0,31 C-iota 65,98±0,52 27,60±0,12 1,50±0,55 a _{Dubois et al (1956)}

b _{Método Turbidimétrico (Dodgson & Price, 1962)} c _{Spector (1978)}

4.2 - Atividade Antioxidante 4.2.1 - Radicais superóxidos

Os radicais superóxidos foram gerados em um sistema metasulfato de fenazina-NADH. As figuras 11 e 12 mostram o efeito de “varredura” de radicais superóxidos por polissacarídeos sulfatados e os seus IC50 estão demonstrados na tabela 05. Todos eles mostraram atividade “varredora” de radicais superóxidos. Dentre as fucanas, o fucoidan foi capaz de inibir a produção de radicais superóxidos em quase 100% já na concentração de 0,133 mg/mL, apresentando uma significante atividade “varredora” para esses radicais (p<0,001), seu IC50 foi atingindo em 0,058 mg/mL, enquanto nas frações F0,5 e F1,1 de P. gymnospora a taxa de inibição ficou em aproximadamente 54 e 50 % na concentração de 0,267 mg/mL, respectivamente, apresentando IC50 de aproximadamente 0,243 mg/mL para as duas frações (figura 11 e tabela 05).

Figura 11. Efeito Inibitório de Radicais Superóxidos por Fucanas de Padina gymnospora (F0,5 e

Tabela 05. Valores dos IC50 dos radicais superóxidos (mg/mL) Polissacarídeos Radicais Superóxidos Fucoidana 0,058±0,011 F 0,5a 0,243±0,014 F 1,1a 0,243±0,013 C-lambdab 0,046±0,001 C-kappab _0,112±0,003 C-iotab 0,332±0,080 a _Fucanas b _Galactanas

Para as galactanas, a carragenana lambda apresentou melhor atividade, atingindo a taxa de inibição de aproximadamente 100% na concentração de 0,133 mg/mL e o IC50de 0,046 mg/mL (p<0.001), enquanto a taxa máxima de inibição das carragenanas kappa e iota foi de aproximadamente 93 e 62%, respectivamente, na concentração de 0,267 mg/mL. Apesar da alta taxa de inibição da kappa o seu IC50 só foi atingindo na concentração de 0,112 mg/mL, já a iota apresentou um IC50 de 0,332mg/mL (figura 12 e tabela 05).

Figura 12.Efeito Inibitório de Radicais superóxidos por Carragenanas lambda (O), Kappa (N) e Iota (L)

4.2.2 - Radicais hidroxilas

Os radicais OH• Por apresentarem pequena capacidade de difusão, são os mais reativos na indução de lesões celulares e por isto merecem especial atenção.

Os resultados obtidos para a inibição da formação de radicais OH. (hidroxilas) demonstraram que todas as amostras analisadas tiveram um moderado efeito na inibição da formação destes radicais (figuras 13 e 14), exceto a F0,5, que apresentou uma curva descendente, possivelmente estimulando a formação desses radicais e não a sua inibição (figura 13). Sugere-se que tal comportamento seja decorrente da presença de ácidos algínicos contaminantes da fração, que são polissacarídeos não sulfatados. Das fucanas, o fucoidan inibiu a formação de radicais OH. (hidroxilas) em 55% na concentração de 0,267 mg/mL e o seu IC50 foi atingindo com 0,157 mg/mL. Na F1,1 observou-se uma taxa de inibição de 34 % na

concentração de 0,267 mg/mL, apresentando o IC50 de 0,353 mg/mL (Figura 13 e tabela 06).

Figura 13. Efeito Inibitório de Radicais Hidroxilas por Fucanas de Padina gymnospora (F0,5 e F1,1) e

fucoidan

Tabela 06. Valores dos IC50 dos radicais hidroxilas (mg/mL)

Polissacarídeos Radicais Hidroxilas Fucoidana 0,157±0,005 F 0,5a n. d. F 1,1a 0,353±0,036 C-lambdab 0,357±0,120 C-kappab _0,335±0,016 C-iotab 0,281±0,072 n. d. (não determinado) a _Fucanas b _Galactanas

Os resultados obtidos com carragenanas lambda, kappa e iota se

apresentaram de forma semelhante aos obtidos com fucanas. Suas taxa de inibição foram de: 41, 36 e 36 % na concentração de 0,267 mg/mL e os IC50 de 0,357; 0,335 e 0,281 mg/mL, respectivamente (figura 14 e tabela 06).

Figura 14. Efeito Inibitório de Radicais Hidroxilas por Carragenanas lambda (O), Kappa (N) e Iota (L)

4.2.3 - Peroxidação lipídica

O ensaio da peroxidação lipídica foi feito em um sistema de Fe2+/vitamina C. A formação de radicais livres nesse sistema foi inibida por todas as amostras de polissacarídeos (figuras 15 e 16). Para a taxa de inibição de fucanas, o fucoidan apresentou uma melhor inibição da peroxidação lipídica (70 % na concentração de 0,572 mg/mL) e seu IC50 foi de 1,250 mg/mL (p<0,001). Já as frações F0,5 e F1,1 as maiores taxas de inibição foram de 40 e 20% na concentração de 1,144 mg/mL,

respectivamente, e seus IC50 2,753 e 2,341 mg/mL, respectivamente (figura 15 e tabela 07).

Figura 15. Inibição da Peroxidação Lipídica de microssomos de fígados de ratos pelos

polissacarídeos de algas: fucoidan e as frações F 0,5 e F 1,1 de P. gymnospora

Tabela 07. Valores dos IC50 da peroxidação lipídica (mg/mL)

Polissacarídeos Peroxidação Lipídica Fucoidana 1,250±0,174 F 0,5a _2,753±0,051 F 1,1a 2,341±5,975 C-lambdab 2,697±0,267 C-kappab 0,323±0,011 C-iotab 0,830±0,063 a _Fucanas b _Galactanas

Para as galactanas a carragenana kappa apresentou melhor atividade, atingindo a taxa de inibição de aproximadamente 100% na concentração de 0,572 mg/mL e o IC50de 0,323 mg/mL (p<0.001) Seguida da kappa, a iota apresentou uma forte atividade inibitória apresentando uma taxa de 94 % de inibição na concentração de 1,144 mg/mL e seu IC50 de 0,830 mg/mL. Já a lambda apresentou um taxa máxima de inibição de 41 % na concentração de 1,144 mg/mL e o IC50 de 2,697 mg/mL (figura 16 e tabela 07).

Figura 16. Inibição da Peroxidação Lipídica de microssomos de fígados de ratos pelos

5. DISCUSSÃO

Nos últimos anos, diversos trabalhos têm dado ênfase ao isolamento e identificação de compostos bioativos, em especial, aos polissacarídeos sulfatados, que ocorrem em uma grande variedade de algas marinhas (ROGER, et al., 2002).

Muitos trabalhos sobre fucanas, que são polissacarideos extraídos de algas marinhas, relatam que tais compostos apresentam, em geral, contaminação com proteínas. Essa contaminação provavelmente é devido aos polissacarideos estarem ligados uns aos outros por proteínas (KLOAREG & QUATRANO, 1988). As análises do teor de proteínas realizadas para todas as amostras neste estudo demonstram que este variou de 0,80 a 2,56%. Esses resultados estão de acordo com os da literatura utilizando a mesma metodologia. Pesquisas realizadas anteriormente com a alga Padina gymnospora mostraram uma contaminação por proteína variando de 1,6 - 7,5% (SILVA et al, 2005). Já as fucanas A e B da alga Spatoglossum

schröederi mostraram uma contaminação da ordem de 5,8 e 1%, respectivamente

(LEITE, et al., 1998, ROCHA, 2002).

Para as atividades biológicas desempenhadas pelas fucanas, a presença de sulfato é uma característica importante, juntamente com a conformação estrutural. As análises de sulfato das fucanas e galactanas obitidas neste trabalho mostraram que o sulfato variou de 17,90 a 44,10%, estando de acordo com os resultados citados na literatura, que estão compreendidos entre 15 e 40% (ROBERTS & QUEMENER, 1999, MEDEIROS, 2003, SILVA, 2005). Haroun-Bouhedja et al (2000), examinaram através dos testes de atividade anticoagulante e antiproliferativa o papel do grupo sulfato presente em fucanas extraídas da alga Ascophyllum

sulfatação. Eles observaram que as duas atividades dependiam do conteúdo de sulfato e que o efeito diminuia com a redução do grau de sulfatação. Em estudos feitos com o polissacarídeos da alga Porphyra yezoensis foi relatado que o grupo sulfato provavelmente contribui para a estimulação de macrófagos (YASHIZAWA et al, 1995).

Os radicais livres são gerados por substâncias oxidantes e são moléculas instáveis, pelo fato de seus átomos possuírem um número ímpar de elétrons. O radical superóxido é uma espécie altamente tóxica, gerado por numerosas reações biológicas e fotoquímicas (YUAN et al. 2005). Nos estudos feitos por Zhang, Li, Zhou, Lu, Xu e Li (2003) com porfirano, polissacarídeo extraído da alga vermelha

Porphyra haitanesis, a fração F3, que teve um maior conteúdo de sulfato,

apresentou uma forte atividade “varredora” de radicais superóxidos, enquanto as frações F1 e F2 tiveram uma fraca atividade, pois apresentaram menos sulfato. Nos estudos feitos por Qi et al (2005), as frações do Ulvan (polissacarídeo extraído da alga verde Ulva pertusa Kjellm), que têm quantidades de sulfato semelhantes entre si, apresentaram forte atividade “varredora” de radicais superóxidos, apresentando um IC50 de 0,0221 mg/mL. Resultado semelhante foi encontrado por Wu et al (2006), onde o IC50 do polissacarídeo de Aloe vera var. chinensis foi de 0,022mg/mL. Em nosso estudo os menores valores para o IC50 foram obtidos com o fucoidan e com a carragenana lambda, 0,058 e 0,046 mg/mL, respectivamente. Isto demonstra que existe uma variabilidade na ação destes compostos e que o teor de sulfato influencia na sua ação. Os nossos resultados também estão de acordo com os encontrados por Yuan et al. (2005), mostrando que o conteúdo de sulfato pode estar influenciando diretamente na inibição da formação de radicais superóxidos já que o fucoidan e a carragenana lambda apresentaram melhor desempenho. Rupérez et al

(2002) obtiveram resultados similares aos nossos utilizando o fucoidan de Fucus vesiculosus. A relação entre estrutura e função de polissacarídeos foi analisada por Yuan et al. (2005). Eles observaram que os polímeros super sulfatados, acetilados e fosforilados tinham diferentes ações, sendo que, os acetilados e os super sulfatados tiveram um forte efeito “varredor” de radicais superóxido, enquanto os polímeros fosforilados apresentaram fraco efeito .

Entre as espécies reativas do metabolismo do oxigênio, o radical hidroxila é o mais reativo e induz danos severos às biomoléculas adjacentes. Yuan et al. (2005), observaram que a inibição de radicais hidroxilas por carragenanas dependia da concentração empregada, e que estas apresentavam forte atividade inativadora de radicais hidroxilas.

Nos estudos feitos por Zhang, Li, Zhou, Lu, Xu e Li (2003) com porfiranos, as frações de polissacarídeos F1 e F2 apresentaram moderada atividade “varredora” de radicais hidroxilas, enquanto F3 apresentou um efeito inativador bastante baixo. Chen et al. (2005) observaram que polissacarídeos extraídos do chá verde tinham habilidade de “varrer” ou inativar os radicais hidroxilas proporcional ao aumento da concentração de polissacarídeos. Wang & Luo (2007) observaram uma taxa de inibição de radicais hidroxilas de 57% para o extrato bruto do polissacarídeo extraído da planta Gynostemma pentaphyllum Makino, numa concentração de 0,8 mg/mL e Luo (2008) estudando polissacarídeos da planta Dioscorea nipponica Makino, obteve uma taxa de inibição de 43,73% utilizando 4 mg. Qi et al (2006) relatou que a taxa de inibição para a vitamina C era de 20% numa concentração de 1 mg/mL. No nosso estudo a taxa de inibição das fucanas e galactanas ficou entre 34 e 55% nas concentrações entre 0,133 e 0,267 mg/mL, demonstrando que esses compostos apresentam taxas de inibições semelhantes ou maiores aos encontrados na

literatura utilizando uma concentração bem menor. Os resultados encontrados neste estudo para essa atividade estão de acordo com Zhang et al. (2003) e Wang & Luo (2007), onde as frações, exceto a F0,5, tem moderado efeito varredor de radicais hidroxilas. A fração F0,5 exibiu uma curva descendente nas concentrações 0,144 e 0,267 mg/mL, sugerindo que houve a formação do radical hidroxila, e não inibição, provavelmente isso ocorre nestas concentrações, devido a essa fração ser rica em alginatos.

A peroxidação lipídica é um processo complexo e quando induzida por radicais livres é a razão principal do dano celular (WEI et al., 2003). Esse processo envolve a formação e propagação de peróxidos lipídicos, e a eventual destruição das membranas lipídicas, produzindo produtos secundários como o malonildialdeído em microssomos (ZHANG et al., 2003). Os resultados deste estudo para essa inibição estão de acordo com os encontrados por Zhang et al. (2003), que observaram forte inibição da produção de MDA in vitro por porfirano de Porphyra haitanesis, utilizando a mesma metodologia. Nos seus resultados o IC50 mais baixo foi de 0,8 mg/mL para F2. Em nossos resultados o IC50 mais relevante foi o da carragenana kappa, que foi de 0,323 mg/mL e a sua taxa de inibição atingiu quase 100% na concentração de 0,572 mg/mL. Dore et al. (2007) observou que ȕ-glucanas extraídas do cogumelo Geastrum saccatum inibiam a peroxidação lipídica em 59 % na concentração de 0,27 mg/mL. Nos estudos feitos por Liu et al (1997) os extratos de polissacarídeos obtidos de oito espécies de cogumelos não foram capazes de inibir a peroxidação lipídica microssomal e duas espécies ainda foram capazes de estimular esse processo. Isso mostra como esses compostos podem ter variabilidade nas suas ações.

Os resultados obtidos para a atividade antioxidante, inibição de radicais superóxidos, hidroxilas e peroxidação lipídica, estão de acordo com os encontrados na literatura (MATSUKAWA et al, 1997, ZHANG, YU, LI, ZHANG, XU, & LI, 2003, WEI et al., 2003, QI et al, 2005).

A utilização desses compostos como agentes antioxidantes podem representar uma possibilidade na busca de compostos aplicados na indústria farmacêutica, alimentícia e de cosméticos, já que estes podem inibir danos provocados pelo excesso de radicais livres no organismo.

6 – CONCLUSÕES

™ As análises químicas demonstraram que as populações de polissacarídeos analisadas são polissacarídeos sulfatados com baixa contaminação protéica. ™ Os polissacarídeos de algas marinhas, tanto as carragenanas, como fucoidan e

heterofucanas (F0,5 e F1,1) possuem propriedades antioxidantes

™ O fucoidan e a carragenana lambda exibiram significante atividade “varredora” de radicais superóxido, sugerindo que o conteúdo de sulfato pode estar relacionado à ação desses compostos com relação a esses radicais, já que estes apresentaram maior conteúdo de sulfato.

™ O fucoidan apresentou melhor atividade varredora de radicais hidroxilas.

™ Para a peroxidação lipídica, a carragenana kappa apresentou uma significante atividade inibitória.

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