Métodos para avaliação da expressão gênica

3.3.1 Extração, quantificação e avaliação da integridade do RNA total

A extração do RNA total foi realizada com o TRIzol® Reagent (Invitrogen), que permite a extração simultânea de RNA e DNA total. Para a extração de RNA total, as biópsias foram dilaceradas e incubadas em um microtubo contendo 1 mL de TRIzol®

Reagent por 5 minutos. Em seguida, foram adicionados 200 µL de clorofórmio, os tubos

foram agitados e incubados em temperatura ambiente por 3 minutos, e após, centrifugados a 12.000 rpm por 15 minutos a 4ºC. Formaram-se uma camada inferior vermelha, uma interfase e uma fase aquosa incolor na porção superior, na qual o RNA está presente. A fase aquosa foi transferida para outro microtubo, enquanto o restante foi reservado a -20ºC para posterior extração de DNA. À fase aquosa foram adicionados 500 µL de álcool isopropílico para precipitação do RNA. As amostras foram incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos e, em seguida, centrifugadas a 12.000 rpm por 10 minutos a 4ºC. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e foi adicionado ao pellet 1 mL de etanol 75%. As amostras foram agitadas e novamente submetidas à centrifugação a 12.000 rpm por 5 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi novamente descartado e as amostras foram mantidas a 37ºC por 10 minutos para secagem. Posteriormente, o pellet foi eluído em 30 µL de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) (Ambion®), os tubos foram agitados, incubados em banho-maria a 55-60ºC por 10 minutos e estocados a -80ºC para uso posterior.

A quantificação de RNA total das amostras foi realizada por

espectrofotometria utilizando-se o equipamento NanoDrop® ND-1000

Spectrophotometer (Uniscience). Para isso, foram utilizados 2 µL de amostra de RNA

total. A razão da absorbância a 260 nm e a 280 nm foi utilizada para determinação da pureza das amostras de RNA. Uma razão próxima do valor 2 é geralmente aceita para classificar uma amostra de RNA como livre de proteínas, consideradas contaminantes nocivos à amplificação in vitro. A mediana da razão 260 nm/280 nm das amostras de AD e ADC foi 1,9 e das amostras de tecido normal foi 1,85. Após a quantificação, as concentrações das amostras foram ajustadas para 100 ng/µ L.

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A avaliação da integridade do RNA total das amostras foi realizada pela detecção das subunidades de RNA ribossômico (rRNA) 18S e 28S por eletroforese em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio, cujo padrão das bandas pode ser visualizado na Figura 7.

Figura 7. Padrão eletroforético das subunidades 18S e 28S do rRNA em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. Colunas 1-2: amostras de adenoma

colorretal; Colunas 3-4: amostras de adenocarcinoma colorretal; Coluna 5: amostra de mucosa normal.

3.3.2 Síntese e avaliação da integridade do cDNA

As amostras de RNA total foram submetidas à transcrição reversa do RNA para síntese de DNA complementar (cDNA) utilizando-se o High Capacity cDNA

Archive Kit (Applied Biosystems) em uma reação com volume final de 20 PL. Para cada

reação foram utilizados 2 µL de tampão RT Buffer 10X, 0,8 µL de desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTP Mix) 100 mM, 2 µL de oligonucleotídeos iniciadores RT Random Primers 10X, 1 µL da enzima MultiScribeTM Reverse

Transcriptase (50 U/µL), 0,5 µL de oligonucleotídeos de timina Oligo dtt (Invitrogen)

(0,5 µg/µ L), 1 µL da enzima RNAseOUTTM Recombinant Ribonuclease Inhibitor

(Invitrogen) (40 U/µL), 2,7 µL de água tratada com DEPC (Ambion®) e 10 µL de RNA total na concentração de 100 ng/µ L. As reações compreenderam uma etapa inicial de 10 minutos a 25ºC seguida por incubação de 120 minutos a 37ºC. As amostras de cDNA foram estocadas a -20ºC para uso posterior.

A avaliação da integridade do cDNA foi realizada por meio da amplificação por PCR de um fragmento de 613 pb do gene E-actina (ACTB), utilizado como controle

para transcritos abundantes. As reações foram processadas em volume final de 20 µL, sendo 2,0 µL de tampão 10X, 0,6 µL de MgCl2 50 mM, 1,4 µL de dNTPs 10 mM, 1,25 µL de oligonucleotídeos iniciadores 10 mM cujas sequências foram: sense 5’- GGCATCGTGATGGACTCC-3’ e anti-sense 3’-GCTGGAAGGTGGACAGCG-5’, 0,3 µL da enzima Taq DNA polimerase (5 U/µL), 12,2 µL de água ultra-pura estéril e 1,0

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µL de cDNA (100 ng). As reações compreenderam uma desnaturação inicial de 4 minutos a 94ºC, 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 60ºC, para o anelamento dos iniciadores, 1 minuto a 72ºC, para a extensão das cadeias e, por fim, 7 minutos a 72ºC para a extensão final. Os produtos da reação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio, cujo padrão das bandas pode ser visualizado na Figura 8.

Figura 8. Padrão eletroforético do gene ACTB evidenciando o fragmento de 613 pb em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio. M: Marcador de peso

molecular de 100pb; Colunas 1-3: amostras de adenoma colorretal; Colunas 4-6: amostras de adenocarcinoma colorretal; Colunas 7-9: amostras de mucosa normal; C: Controle negativo da reação.

3.3.3 Quantificação da expressão gênica relativa por PCR quantitativa em tempo real (qPCR)

A quantificação da expressão gênica foi realizada utilizando-se ensaios

TaqMan® (Applied Biosystems) com sondas específicas para os genes alvos ANXA1

(Hs00167549_m1 inventoried) e LGALS1 (Hs00355202_m1 inventoried) e para os genes de referência ACTB (Catalog#: 4352935E) e GAPDH (Glyceraldehyde 3-

phosphate dehydrogenase) (Catalog#: 4352934E), utilizados como controles endógenos

da reação. As sondas TaqMan® MGB (minor groove binder) contêm o fluoróforo FAM

ligado à extremidade 5’ e um supressor (quencher) não fluorescente ligado à extremidade 3’.

Durante a qPCR, a sonda TaqMan® MGB hibridiza-se especificamente à sua

sequência complementar entre os oligonucleotídeos iniciadores sense e anti-sense. A intensidade da fluorescência na reação é determinada pelo cálculo do ΔRn (ΔRn=Rn+- Rn-), onde Rn+ corresponde à intensidade de emissão do fluoróforo FAM / intensidade de emissão do ROX em determinado momento; e Rn- corresponde à intensidade de emissão do fluoróforo FAM / intensidade de emissão do ROX antes da amplificação. O fluoróforo ROX é utilizado como controle interno passivo, pois a fluorescência emitida é constante durante toda a reação. Para a quantificação relativa foi estabelecido um

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valor de ΔRn, correspondente a linha de corte (threshold) para a curva de amplificação de cada gene estudado. O número do ciclo em que ΔRn cruza a linha de corte corresponde ao ciclo threshold (Ct) ou ciclo de quantificação da amostra. O valor de Ct é preditivo da quantidade de genes alvos presentes na amostra, e quanto menor o seu valor, maior é a quantidade de genes presente.

Para determinação da quantidade de cDNA a ser utilizado na qPCR, foi realizada uma curva padrão de quantificação para cada gene alvo e endógeno com uma amostra previamente escolhida, com alta concentração e boa integridade de RNA. As concentrações de cDNA testadas foram 100 ng/µL, 10 ng/µ L, 1 ng/µ L, 0,1 ng/µ L e 0,01 ng/µL. Todas as reações foram realizadas em triplicata em volume final de 20 µL, utilizando-se 10 µ L de TaqMan® Gene Expression Master Mix 2X (Applied

Biosystems), 1 µ L de TaqMan® Gene Expression Assays 20X (Applied Biosystems) que

contém os oligonucleotídeos iniciadores e a sonda TaqMan® MGB ligada ao fluoróforo

FAM específico para amplificação e detecção de cada gene, 8 µL de água tratada com DEPC (Ambion®) e 1 µL de amostra de cDNA (100 ng). As reações foram realizadas no equipamento Real-Time PCR Detection System CFX96 Touch™ (BIO-RAD) e submetidas a 95ºC por 10 minutos, seguidas por 40 ciclos a 95ºC por 15 minutos e a 60ºC por 1 minuto.

A realização da curva padrão possibilita a avaliação da eficiência do ensaio, pois indica a cinética de amplificação da sequência alvo. A taxa na qual um amplicon de qPCR é gerado corresponde à eficiência de amplificação (E). O valor E para cada gene foi calculado pelo software CFX ManagerTM versão 2.1, utilizando a seguinte fórmula: E=10(-1/slope), na qual o valor de slope corresponde à inclinação da reta obtida quando se analisa a variação do Ct (ciclo threshold) dos genes de interesse e do gene de referência em função do Log de diferentes quantidades de cDNA. O valor esperado do slope é de - 3,32, o qual corresponde à uma eficiência de 100% em que um amplicon dobrou em quantidade durante a fase geométrica da amplificação da qPCR. Na Figura 9 estão apresentados os resultados da curva padrão dos genes ANXA1, LGALS1, ACTB e

GAPDH geradas pelo programa. Para os genes ANXA1, LGALS1 e ACTB, foram

considerados quatro pontos de diluição, uma vez que na menor concentração de cDNA, a amplificação não foi detectada. A partir desses valores, pode-se concluir que os ensaios apresentaram valores de eficiência próximos ao esperado.

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Figura 9. Representação gráfica das curvas padrão dos genes ANXA1, LGALS1, ACTB e GAPDH, representando as quantidades iniciais de cDNA (ng/µ L) (eixo X) e os valores

da média de Ct das triplicatas (eixo Y).

O cDNA das amostras de tecido normal adjacente a cada um dos tipos de lesão (AD e ADC) foram misturados para formação de dois diferentes pools correspondentes. O pool de tecido normal do grupo AD foi constituído por 19 amostras, enquanto o do grupo ADC foi constituído por 39 amostras. Após a padronização, procederam-se as análises para quantificação da expressão relativa dos genes ANXA1 e

LGALS1 nas 70 amostras (27 AD e 43 ADC) estudadas e nos dois pools de mucosa

normal. Todas as reações foram realizadas em triplicata conforme descrito para a confecção da curva padrão, utilizando-se 25ng de cDNA e com controle negativo para atestar a ausência de contaminação.

Os dados gerados pelo software CFX ManagerTM versão 2.1 foram exportados para uma planilha do Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft) para normalização. Para isso, foi calculada a média geométrica dos valores de Ct dos dois genes de refêrencia (VANDESOMPELE et al., 2002) e o valor resultante foi subtraído do valor de Ct do gene alvo, para obtenção do ΔCt. A partir do ΔCt calculado para cada amostra, foi subtraído o valor do ΔCt calculado para o pool de mucosa normal correspondente à lesão da amostra, resultando no valor de ΔΔCt, utilizado para calcular a quantificação relativa (RQ) pelo método 2-ΔΔCt (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001), segundo a fórmula:

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Nesse cálculo, os grupos de mucosa normal foram utilizados como calibradores. Assim, os dados de RQ dos grupos de lesão (AD e ADC) foram representados em relação ao respectivo grupo de mucosa normal. Para esse grupo,

ΔΔCt=0 e, como 20=1, o RQ do grupo de mucosa normal é, por definição, igual a 1 (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001). Foram consideradas hiperexpressas as amostras

individuais com valores de RQ≥2.