Métodos

O doseamento de hidratos de carbono nos vários órgãos da planta da oliveira, nomeadamente, a raiz, tronco e nos ramos com diferentes idades é uma tarefa morosa, visto que é necessário dispor de aparelhos capazes de triturar madeira bem como metodologias especializados a extrair os hidratos de carbono contidos no lenho.

A análise dos hidratos de carbono presentes num tecido poder ser feita segundo várias metodologias, tendo em atenção, entre outros aspectos, o peso molecular dos carbohidratos em análise.

21 LATT et al. (2001) referiram que, para extrair açúcares solúveis totais (glucose, frutose e sacarose), seria necessário realizar quatro lavagens com álcool etílico quente, permitindo este procedimento extrair açúcares de baixo peso molecular, ficando no precipitado os hidratos de carbono de alto peso molecular (MANESS e PERKINS-VEAZIE, 2005). Estes mesmos autores referiram que, para extrair o amido, seria necessário utilizar o ácido perclórico. Por sua vez, segundo CARPITA et al., (1989) referido por TRETHEWEY e ROLSTON (2009) basta apenas a extracção de etanol a duas vezes para extrair hidratos de carbono solúveis de baixo peso molecular, predominantemente a sacarose e os monossacáridos.

Segundo PRUDHOMME et al. (1992) referido por TRETHEWEY e ROLSTON (2009), a realização de uma a extracção com água destilada permite obter polímeros e hidratos de carbono de alto peso molecular, como as fructanas. Uma outra abordagem para decompor os açúcares de alto peso molecular envolve a hidrólise com ácido sulfúrico, que permite, segundo LATT et al. (2001) reduzir o amido a monómeros de glucose, produzindo uma cor verde.

Existem vários métodos para a quantificação de hidratos de carbono, podendo-se distinguir uns dos outros pela rapidez, rigor, técnica e economia. Neste trabalho restringiu-se a detecção dos hidratos de carbono a métodos colorimétricos, apresentando-se de seguida os fundamentos dos métodos utilizados.

2.4.1. Detecção com recurso à 2-cianoacetamida

A detecção com recurso à 2-cianoacetamida tem como principal objectivo a determinação de açúcares redutores (glucose e frutose). HONDA et al. (1982) encontraram um novo agente para a medição dos hidratos de carbono redutores, a 2 – cianoacetamida. A fase inicial da reacção é em meio alcalino fraco e ocorre uma condensação de Knoevenagel (adição nucleofílica de um composto orgânico ionizado a um grupo carbonilo seguida de uma reacção de desidratação, na qual uma molécula de água é eliminada) entre o grupo aldeído do açúcar redutor e o grupo metileno da 2 – cianocetamida. A desidratação subsequente dá origem ao dienol que absorve a luz UV a 274 nm e pode ser electroquimicamente oxidado. Os referidos autores identificaram o composto intermédio activo na gama UV para a glucose como sendo o 4, 6, 7, 8 – tetrahidroxi – 2 – ciano – 2, 4 – octadienamida. Este método foi descrito para detectar a glucose mas pode ser aplicado a outros hidratos de carbono redutores.

22 2.4.2. Somogyi-Nelson

O método de Somogyi-Nelson tem como principal objectivo a determinação de açúcares redutores (glucose e frutose), baseando-se a determinação nas suas propriedades. A solução de açúcar é fervida com uma solução cúprica alcalina (reagente de Somogyi), formando-se um precipitado de Cu2O que é detectado através da adição de um composto

contendo arsenomolibdato (reagente de Nelson). O arsenomolibdato é reduzido a arsenomolibdito, de cor azul intensa, que é detectável espectrofotometricamente. Esta reacção não é específica, podendo sofrer interferência de outros componentes redutores (por exemplo, proteínas que também reduzam o Cu2+). Para minimizar interferências, o comprimento de onda usado nesta determinação é entre 500 e 520 nm (NELSON, 1944).

Figura 11 - Reacção do método de Somogyi-Nelson

(http://dc357.4shared.com/doc/mD4zQTwz/preview.html, consultado a 6-01-13). 2.4.3. Antrona

O método da antrona foi descrito em 1954 por YEMM e WILLIS e tem como principal objectivo a determinação de açúcares solúveis totais, como a glucose, frutose e a sacarose. Em 1895, LOBRY DE BRUYN e ALBERTA VAN ECKENSTEIN verificaram que soluções fracamente alcalinas de D-glucose continham ao fim de algum tempo D-manose e D-frutose em equilíbrio com o açúcar original, concluindo, portanto que os monossacáridos, de uma maneira geral, estão sujeitos a reacções de enolização. Os monossacáridos são estáveis quando tratados com soluções de ácidos minerais diluídos, mesmo sob aquecimento, mas as aldoses sofrem desidratação quando aquecidas na presença de ácidos fortes, formando furfural (pentoses) ou hidroximetilfurfural (hexoses) (NERY et al., 2004). Esta reacção

23 constitui a base de alguns testes qualitativos de açúcares, pois os furfurais reagem com determinados compostos aromáticos, formando produtos coloridos característicos.

Para se obter uma coloração mais distinta pode-se adicionar outros compostos orgânicos, como por exemplo a antrona e fenol (existem outros, mas este são os mais utilizados porque não são tão selectivos quanto ao açúcar a ser doseado).

A antrona (9,10-dihidro-9-oxiantraceno) é uma substância estável, sólida, incolor, com ponto de fusão a 154ºC e peso molecular de 194,23 g mol-1. A reacção é realizada em meio fortemente ácido (solução concentrada em ácido sulfúrico), onde há hidrólise dos dissacáridos e formação de furfurais, os quais reagem com a antrona formando um produto de coloração azul-esverdeada, que é quantificado através do espectrofotómetro (Figura 12).

Figura 12 - Reacção da antrona (NERY et al., 2004).

O método da 2-cianoacetamida apresenta algumas vantagens em relação ao método de Somogyi-Nelson, visto que este é demorado e não muito preciso ou reprodutível. Este método procura ser rápido e simples de efectuar, utilizando aparelhos mais vulgares (espectrofotómetro).

A diferença entre o método de Somogyi-Nelson e outros métodos de determinação de açúcares redutores é a sensibilidade do método, cuja faixa de determinação situa-se entre 25 e 500 mg/L.

O método da Antrona fornece melhores resultados quando aplicada em soluções puras de hexoses ou seus polímeros.

A reacção do reagente fenol (no caso deste trabalho foi efectuado com a antrona) com ácido sulfúrico é um método simples, rápido, sensível, exacto, específico e largamente aplicado

24 para praticamente todos os hidratos de carbono (monossacáridos, oligossacáridos e polissacáridos). A cor produzida é estável e os resultados são reprodutíveis. O método é excelente para determinação de açúcares separados por cromatografia, não apresentando problemas com interferentes.