Manutenção das culturas celulares e da área de trabalho

Antes de se iniciar o trabalho na câmara de fluxo laminar, deve ser garantida a esterilidade da mesma. Assim, a lâmpada UV foi ligada cerca de 15 min antes de cada utilização. De seguida, a luz interior e o fluxo vertical foram ligados e, posteriormente, o vidro subido até ao limite indicado. Decorridos alguns minutos, toda a superfície no interior da câmara foi limpa, sendo a mesma borrifada com etanol 70%.

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Todo o material dentro da sala de cultura deve ser manipulado com luvas e todas as soluções utilizadas devem ser pré-aquecidas a 37ºC num banho.

Durante o manuseamento das culturas celulares houve sempre o cuidado de não manipular qualquer objeto sobre as soluções, frascos de cultura ou outros frascos que se encontrassem abertos. Foi ainda garantido que todas as tampas se encontravam voltadas para baixo na superfície esterilizada da câmara. Estes cuidados ajudam a garantir que não ocorrem contaminações.

Terminada a manipulação, todo o material utilizado foi descartado nos contentores apropriados. Sempre que o sistema de aspiração automático por vácuo foi utilizado este foi lavado com uma solução de lixívia e despejado no reservatório de resíduos adequado. Finalmente, foi limpa toda a área interior da câmara com etanol a 70%, fechada e desligada.

3.4.2.1.Preparação dos meios de cultura

A composição do meio de cultura é fundamental para a manutenção e crescimento de culturas celulares. Este deve conter constituintes fundamentais para o crescimento celular como água, hidratos de carbono, lípidos, aminoácidos, sais inorgânicos podendo ainda ser suplementados com Soro Bovino Fetal (FBS) que contém albumina, fatores de crescimento e de adesão e transportadores.

O meio utilizado neste trabalho foi o RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) da Sigma Aldrich. O meio foi preparado a partir de meio liofilizado por adição em água Milli-Q sob agitação mecânica sem aquecimento. Após a dissolução completa foram adicionadas 2 g de bicarbonato de sódio e procedeu-se à transferência para um balão de fundo redondo de 1 L, aferido com água Milli-Q.

Recorrendo a uma câmara de fluxo laminar e técnica assética, o meio foi suplementado com 2 nM de L-glutamina, 1 nM de piruvato de sódio, 10 nM de HEPES, 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico e filtrado recorrendo a uma unidade de filtração estéril sob vácuo. O meio foi acondicionado devidamente fechado em câmara frigorifica a 4ºC nos intervalos de utilização.

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3.4.2.2.Descongelamento de células

As alíquotas de células utilizadas, contendo 1x106 _{células cada uma, encontravam-se}

criopreservadas em azoto líquido (-180ºC), em meio RPMI-C com 10% de DMSO, sendo que o primeiro passo a executar foi a sua recolha do banco de células onde estavam armazenadas.

O meio RPMI-C foi aquecido em banho termostatizado a 37ºC antes de se iniciar o procedimento em câmara de fluxo laminar sob técnica assética.

Procedeu-se à preparação de um tubo de falcon com 4 mL de meio a 37ºC e, de seguida, foi descongelada a alíquota à temperatura ambiente durante alguns minutos. Assim que foi possível removê-la do criotubo, a alíquota foi transferida para o tubo de

falcon previamente preparado. O tubo de falcon foi centrifugado a 900 rotações por

minuto (rpm) durante 4 min, procedendo-se de seguida à aspiração do sobrenadante que continha DMSO, tóxico à temperatura ambiente para as células, e ressuspensão cuidadosa do pellet em 2 mL de meio RPMI-C.

A suspensão de células foi transferida para um frasco de cultura de 75 cm2 _e

adicionaram-se 13mL de meio completo, perfazendo um total de 15 mL (0,2 mL/cm2_).

O frasco foi colocado na incubadora e monitorizado diariamente recorrendo a um microscópio ótico até ser necessário renovar o meio ou atingir 90 % de confluência.

3.4.2.3.Tripsinização

A tripsinização consiste na utilização de tripsina para dissociar células em crescimento aderidas ao material de cultura.

Após confirmação de 90% de confluência das células aderidas por observação microscópica, procedeu-se à remoção cuidadosa do meio gasto, seguido de lavagem das células aderidas com PBS 1X (0,2 mL/cm2_{) e aspiração cuidadosa deste reagente.}

As culturas foram sujeitas ao efeito de 0,025% Tripsina em PBS/EDTA (0,13 mL/cm2_),

durante aproximadamente 1 a 2 min em incubadora para que a enzima atuasse, e observadas ao microscópio para garantir que a dissociação tinha ocorrido de forma correta e completa. Findo este tempo foi adicionado o dobro do volume de meio RPMI-C (0,2 mL/cm2_{) para neutralizar a tripsina e interromper o processo.}

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A suspensão celular foi centrifugada durante 4 min a 900 rpm. De seguida o sobrenadante foi recolhido e descartado e o pellet foi ressuspendido em 2 mL de meio RPMI-C. A suspensão de células foi transferida para um frasco de cultura de 125cm2_,

perfazendo um volume final de 25 mL com meio RPMI-C, ou para multiwell no caso dos ensaios.

3.4.2.4.Criopreservação

A criopreservação é a técnica experimental que permite o congelamento de células, mantendo a viabilidade celular, durante períodos relativamente longos.

No caso do armazenamento das subculturas, procedeu-se à tripsinização tal como descrito acima com a suspensão do pellet em meio RPMI-C. Depois disso, procedeu- se à contagem das células e retirou-se o volume correspondente a 1x106 _{células que foi}

pipetado para um criotubo, perfazendo-se o volume de 1 mL com RPMI-C, com 10% de DMSO.

Cada tubo foi identificado com a designação da linha celular, o número da passagem, sigla do utilizador e data e armazenado a -20ºC durante 2 a 4 horas, com transferência para câmara a -80ºC durante 2 a 3 dias e por fim procedeu-se ao armazenamento em azoto líquido a -180ºC.

3.4.2.5.Contagem de células

A contagem de células foi executada antes de iniciar o armazenamento ou a utilização das subculturas em ensaios para avaliar a densidade celular estimada em cada frasco de criopreservação ou poço de multiwell respetivamente.

Foi utilizado uma câmara de Neubauer, a qual foi limpa antes e depois de cada utilização para evitar a visualização de células aderidas de contagens prévias. Sobre a placa de vidro foi colocada uma lamela de vidro que cobrisse a zona central e a câmara foi reservada até utilização.

Foi utilizada uma solução de trypan blue (0,4%) tendo por base o preceito de que este reagente não consegue penetrar a membrana celular de células viáveis, mas consegue penetrar a de células mortas, e que ao serem observadas ao microscópio as células mortas estarão pigmentadas de azul escuro, permitindo assim a contagem de células viáveis.

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Depois do processo de tripsinização da subcultura, centrifugação e ressuspensão do

pellet como supramencionado, procedeu-se à pipetagem de 10 μL da suspensão celular

para um eppendorf e adição de 10 μL de trypan blue (0,4%). A suspensão foi homogeneizada recorrendo a movimentos “up and down” executados com micropipeta. De seguida, 10 μL desta solução foram cuidadosamente introduzidos na camara de Neubauer garantindo que esta ficasse cheia e sem bolhas de ar entre a câmara e a lamela de vidro.

Depois de preparada, a câmara foi observada ao microscópio utilizando uma objetiva de 10x focada, tendo sido contadas apenas as células viáveis recorrendo a um contador analógico e contando apenas uma vez as células que se encontrassem em mais do que um quadrado, seguindo um padrão de zigzag. Para determinar a concentração de células presente na amostra foi aplicada a seguinte razão: nº de células = média das células nos quadrantes × 104 _{× 2 × volume de ressuspensão das células.}