A cicatrização é um processo complexo que ocorre em quase todos os tecidos após exposição a um estímulo destrutivo e que envolve a interação entre múltiplas células, a matriz extracelular, fatores envolvidos na resposta inflamatória e revascularização. Este processo pode ser divido em três fases, a inflamação, a proliferação e a remodelação [7], [22], [25]. Pode ser desencadeada por compostos químicos ou biológicos, incluindo enzimas pró-inflamatórias, citoquinas e compostos de baixo peso molecular como os eicosanoides [5].
A fase inflamatória dura aproximadamente 4 dias e é caracterizada pela acumulação de plaquetas no local da lesão, seguida da migração de células do sistema imunitário, neutrófilos e macrófagos [22]. Esta fase ocorre imediatamente após a lesão no tecido para prevenção de hemorragia e perda de fluidos, remoção de tecido morto ou desvitalizado e para prevenção de infeções. A hemóstase é atingida pela formação do tampão plaquetário, seguido da matriz de fibrina que se converte no suporte para a infiltração de células [25].
A segunda fase, a fase proliferativa, ocorre 2 a 10 dias após a lesão e é caracterizada pela migração e proliferação de vários tipos de células. Inicialmente ocorre a migração dos queratinócitos sobre a derme lesionada, seguida de angiogénese e por fim, os fibroblastos são atraídos das margens da lesão ou da medula óssea e estimulados pelos macrófagos, observando-se a diferenciação de alguns fibroblastos em miofibroblastos. Os fibroblastos e miofibroblastos interagem e produzem matriz extracelular maioritariamente composta por colagénio tipo III [22], [25].
A última fase, a fase de remodelação ou maturação, inicia-se 2 a 3 semanas após a lesão e pode durar até mais de 1 ano. Durante esta fase os processos anteriores diminuem e cessam devido à apoptose ou migração das células endoteliais, macrófagos e miofibroblastos, formando-se uma matriz acelular. Após 6 a 12 meses a matriz sofre remodelação e o colagénio tipo III é transformado em colagénio tipo I, devido às
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metaloproteinases secretadas por fibroblastos, macrófagos e células endoteliais, o que fortalece o tecido remodelado [22], [25].
O mel promove a cicatrização por redução do edema, inflamação e dor consequente, por facilitar a síntese de colagénio, a angiogénese, estimular o desenvolvimento de fibroblastos e células epiteliais, promover a granulação e por prevenir a formação de tecido cicatricial e queloides [7].
O mel tem a capacidade de estimular a angiogénese, devido ao seu pH acídico que provoca a libertação de oxigénio da hemoglobina, estimulando a granulação, formação de tecido e regeneração tecidular. Por outro lado, o mel acelera a contração da lesão por estimulação dos fibroblastos e miofibroblastos e por potenciar a deposição de colagénio [7].
O peróxido de hidrogénio presente no mel pode estimular o crescimento e proliferação de fibroblastos em cultura, sendo que os compostos fenólicos apresentam um efeito protetor contra os efeitos nefastos do peróxido de hidrogénio [7].
O própolis apresenta várias propriedades que em conjunto potenciam a cicatrização, tais como a sua capacidade antimicrobiana, adstringência, anestésica, antioxidante e anti-inflamatória [13].
Alguns estudos têm demonstrado uma aceleração da cicatrização aquando da aplicação tópica de própolis, por estimulação da síntese e libertação de glicosaminoglicano, o qual é necessário para a formação de tecido de granulação no leito da lesão, crescimento tecidular e encerramento da ferida [23].
O tratamento com própolis estimula o aumento dos componentes da matriz extracelular durante a fase inicial da cicatrização, seguido de uma redução das moléculas da matriz. Considera-se que o efeito biológico advém da habilidade de estimular a expressão do fator de crescimento transformante β (TGF-β) que participa nas fases iniciais de hemóstase e inflamação [13].
A existência excessiva de mastócitos pode ser prejudicial ao processo regenerativo, aumentando a formação de tecido cicatricial e inflamação. A aplicação tópica de própolis tem o potencial para diminuir o número de mastócitos, devido ao éster
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1.7.1.Determinação da viabilidade celular
O método do Brometo de 3(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), foi o primeiro ensaio para verificação da viabilidade celular em placas com 96 poços adaptado a HTS (high troughput screening). Este método é bastante sensível e fácil de realizar e pode ser utilizado para avaliar a viabilidade e proliferação celular [26]. Por este motivo foi o método aplicado neste trabalho.
O princípio deste método baseia-se no facto de as células viáveis com metabolismo ativo terem a capacidade para converter MTT num composto de cor roxa, o formazano, o qual possui um pico de absorvância perto dos 570 nm. Quando as células morrem estas perdem a capacidade de conversão e como tal a formação de cor roxa serve como indicador da viabilidade celular [26]. A quantidade de formazano será proporcional ao número de células viáveis, e é medido por verificação das alterações de absorvância a 570 nm, utilizando um espetrofotómetro com leitura de placas [26].
Se os valores das absorvância das amostras forem inferiores aos valores do controlo isto indica que ocorreu uma redução da taxa e proliferação celular e redução da viabilidade. Pelo contrário, se os valores das absorvâncias das amostras forem superiores aos valores de controlo isto indica que ocorreu um aumento da viabilidade celular e da proliferação celular.
1.7.2.Avaliação da capacidade de cicatrização in vitro - Scratch
Wound Healing Assay
Para avaliação da capacidade cicatrizante é usado o ensaio de cicatrização Scratch
Wound Healing Assay, o qual é um ensaio simples comummente utilizado para medir
a migração celular, que pretende mimetizar in vitro as condições apresentadas in vivo, aquando de uma lesão numa camada celular [27].
Para realizar este ensaio deverá existir uma camada de células confluentes na qual seja realizada uma zona de separação com a ponta de uma micropipeta que simula uma lesão. Depois a cultura celular deverá ser observada ao microscópio ao longo do tempo para verificar o tempo decorrido até obter novamente 90% de confluência [28]. Ao adicionar os compostos em estudo ao meio de cultura, depois de realizada a zona de separação, poderá ser analisada a capacidade dos compostos de favorecerem a migração celular, ou seja, a capacidade de cicatrização [28].
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2. Objetivos
Este trabalho de investigação teve como objetivos principais a verificação da atividade regenerativa de amostras de mel com própolis em fibroblastos humanos da derme e a análise de um possível sinergismo entre as propriedades bioativas de diferentes misturas de mel com extrato de própolis.
Para tal foram avaliadas as características fitoquímicas e biológicas das amostras de mel de cores diferentes, produzidas em épocas do ano diferentes e recorrendo consequentemente a espécies vegetais distintas, das amostras de extrato de própolis e das misturas de mel com extrato de própolis a diferentes concentrações.
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