3.1. Especificações de Materiais, Instrumentos e Técnicas
3.1.1. Para o desenvolvimento das separações e purificações por cromatografia em coluna clássica e cromatografia líquida a vácuo (CLV), foram utilizadas colunas de vidro de dimensões compatíveis com a massa da amostra. Como fase estacionária, foi utilizada sílica gel 60 H (Merck, código 1.07736.1000) e sílica gel 60 (Merck, 0,063-0,200 mm, código 1.07734.1000).
3.1.2. Durante o reisolamento dos metabólitos alvo, os processos de cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) foram realizados em placas de vidro (5x20, 10x20 ou 20x20 cm) tendo como fase estacionária sílica gel GF254 (Merck, 1.07730.1000). Foi utilizada uma espessura de 0,25 mm da
fase estacionária.
3.1.3. Os reveladores de placas cromatográficas utilizados foram: luz ultravioleta (Spectroline, modelo ENF-240C); câmara de iodo e revelador químico (solução de Vanilina sulfúrica a 2%).
3.1.4. Os espectros de RMN foram adquiridos em um equipamento Bruker DRX400 (400 MHz para 1H e 100 MHz para 13C) no Laboratório de RMN da UFSCar ou em um equipamento Bruker DPX300 (300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C) no Depto. De Química da USP - Ribeirão Preto. Como solvente foi utilizado, principalmente, CDCl3 98,9% e como padrão de referência interno
3.1.5. Os solventes utilizados, tanto nos procedimentos de isolamento e purificação quanto nos procedimentos reacionais, foram todos de grau PA.
3.1.6. A evaporação dos solventes em todos os processos realizados foi executada através de evaporadores rotativos (Fisatom 801 ou Marconi MA- 120) com sistemas de condensação refrigerados por banhos refrigeradores (SOLAB ou Marconi MA-184).
3.1.7. As reações químicas foram realizadas utilizando-se agitadores magnéticos com aquecimento (Biothec BT40/A ou Fisatom Mod.752).
3.2. Procedimento de reisolamento dos diterpenos. 3.2.1. Obtenção do extrato de Viguiera arenaria.
O extrato utilizado neste trabalho (EDB – extrato diclorometânico bruto) foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Fernando Batista da Costa do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A preparação deste extrato bruto diclorometânico de V. arenaria foi realizada conforme descrito previamente na literatura.24,60
3.2.2. Partição do extrato.
Com a intenção de promover uma separação prévia dos componentes do extrato por diferença de polaridade, o extrato diclorometânico bruto das raízes de Viguiera arenaria foi submetido a uma partição com diferentes solventes. Inicialmente, 65,2 g do extrato foram suspensos em 400mL de uma
solução de MeOH - H2O a 9:1 v/v, e a mistura permaneceu por 25 minutos no
aparelho de ultrassom para homogeneizar a suspensão. Após este procedimento, retirou-se uma parte do extrato (9,5 g) que não solubilizou nem suspendeu no solvente utilizado, e, que foi denominada precipitado insolúvel (PI). Com a parte suspensa em metanol-água, foram realizadas as partições com hexano (5 porções de 300 mL) e com DCM (4 porções de 300 mL). As fases obtidas foram todas secas com sulfato de magnésio anidro e tiveram o solvente retirado por evaporação rotativa. Desta forma foram obtidas frações com grau diferenciado de polaridade de seus componentes: a fase Hexânica (F1), a fase diclorometânica (F2) e a fase hidroalcoólica (F3). Pelo conhecimento do trabalho previamente realizado com este extrato, sabia-se que as substâncias que se procurava reisolar seriam encontradas nas fases F1 e F2. As massas dos extratos particionados obtidos após a remoção dos solventes encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1: Resumo do resultado da partição.
Fase Descrição Massa
PI Precipitado insolúvel 9,5 g
F1 Partição com hexano 31,36 g
F2 Partição com diclorometano 19,87 g
F3 Fase hidroalcoólica 2,38 g
3.2.3. Isolamento dos metabólitos de interesse.
Uma análise inicial por CCDC das fases obtidas no item anterior, por meio da utilização de uma fase móvel Hex/AcOEt 7:3 + AcOH 1%, mostrou que haviam poucas diferenças entre as fases F1 e F2. A fase F1 foi escolhida para o início dos fracionamentos.
3.2.3.1. Fracionamento da fase F1 (hexano).
Com a massa total da fase F1, foi realizada uma CLV com uma coluna com placa de vidro sinterizado de 18 cm de diâmetro por 25 cm de altura. Foi utilizada uma massa de 500 g de sílica gel H, empacotada nesta coluna sob pressão reduzida, utilizando hexano como solvente inicial.
Esta proporção de sílica em relação à quantidade de amostra é próxima de 16:1, e pode ser considerada como relativamente pequena para uma boa separação cromatográfica. No entanto, o objetivo desta CLV é apenas o de realizar uma separação inicial dos componentes do extrato por grau de polaridade.
Foram coletadas 6 frações, conforme esquema de gradiente crescente de polaridade descrito na Tabela 2.
Tabela 2: Esquema de eluição durante a CLV da fase F1.
Solvente Utilizado Volume (L) Fração Massa (g)
Hex 2,5 F1.1 0,39 Hex/AcOEt - 9:1 2,5 F1.2 10,57 Hex/AcOEt - 4:1 2,5 F1.3 11,27 Hex/AcOEt - 1:1 2,5 F1.4 4,20 AcOEt 2,5 F1.5 1,90 MeOH 2,5 F1.6 2,85 3.2.3.1.1. Fração F1.1.
Como uma primeira análise desta fração, foi realizada uma CCDC utilizando como eluente uma mistura de Hex/AcOEt – 19:1. A revelação desta placa mostrou apenas um componente principal nesta fração. Para isolar tal
componente, foi realizada uma CCC com sílica gel 60 como fase estacionária e Hex/AcOEt – 19:1 como eluente. Após a coluna, as frações foram analisadas por CCDC com o mesmo eluente antes utilizado e as frações contendo o componente principal foram reunidas e o solvente foi retirado por evaporação rotativa. A pureza do material mostrava que deveria se tratar de uma única substância, que foi codificada como VaD1-1. Foram obtidos 200 mg desta substância.
3.2.3.1.2. Fração F1.2.
Uma análise inicial desta fase foi feita por CCDC com Hex/AcOEt – 9:1 + AcOH 1%. Neste caso, parecia se tratar de uma única substância majoritária.
Com uma fração de 2 g da massa obtida de F1.2 foi feita uma nova CLV (coluna: 10 cm diâmetro por 17 cm altura) utilizando-se 80 g de sílica gel H. O procedimento foi exatamente como descrito no item 3.2.3.1. Todas as frações tiveram o solvente retirado por evaporação rotativa e a massa determinada. As 7 frações coletadas, bem como os detalhes das misturas de solventes utilizadas (gradiente crescente de polaridade), estão relacionados na Tabela 3.
Tabela 3: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.2.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 49:1 250 F1.2.1 4 Hex/AcOEt - 19:1 250 F1.2.2 320 Hex/AcOEt – 9:1 250 F1.2.3 680 Hex/AcOEt - 5:1 250 F1.2.4 463 Hex/AcOEt - 1:1 250 F1.2.5 230 AcOEt 250 F1.2.6 103 MeOH 250 F1.2.7 185
3.2.3.1.2.1. Fração F1.2.3.
Pela grande quantidade de cristais obtida nesta fração, preferiu-se lavar os mesmos com MeOH a frio. Uma amostra desta fração foi submetida a CCDC (Hex/AcOEt 9:1 + 1% AcOH), mostrando uma única mancha após revelação. Esta substância foi codificada como VaD1-2 e submetida a análises de RMN. Foram obtidos 400 mg da substância.
3.2.3.1.2.2. Fração F1.2.5.
O trabalho com esta fração começou por extensa seção de testes de fases móveis por CCDC. Em seguida, uma CCDP com 90 mg desta fração foi realizada com a melhor fase móvel encontrada (Hex/AcOEt 9:1 + 1% AcOH). As manchas principais foram retiradas e extraídas com DCM. Esse procedimento permitiu isolar uma única substância (5 mg) que foi codificada como VaD1-3 e submetida a análises por RMN para identificação estrutural.
3.2.3.1.3. Fração F1.3.
Para esta parte do trabalho foram separados 3,5 g da fração F1.3 e, inicialmente, foi realizada uma CCDC (Hex/AcOEt 8:2 + 1% AcOH) incluindo os metabólitos isolados até este ponto (VaD1-1, VaD1-2 e VaD1-3) para efeito de comparação. Este procedimento proporcionou a informação de que esta fase era composta de uma única substância, diferente das demais obtidas até aqui.
Desta forma, foi realizada uma CLV (coluna de 10 cm diâmetro por 17 cm altura) com a amostra desta fração (3,5 g) em 100 g de sílica gel H. O procedimento foi exatamente como descrito antes. Foram coletadas 8 frações
que se encontram relacionadas, juntamente com o esquema de eluição (gradiente crescente de polaridade) utilizado, na Tabela 4.
Tabela 4: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.3.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 19:1 250 F1.3.1 4 Hex/AcOEt - 9:1 250 F1.3.2 323 Hex/AcOEt – 17:3 250 F1.3.3 1203 Hex/AcOEt - 4:1 250 F1.3.4 1117 Hex/AcOEt - 3:1 250 F1.3.5 147 Hex/AcOEt - 7:3 250 F1.3.6 120 Hex/AcOEt - 1:1 250 F1.3.7 170 MeOH 250 F1.3.8 428
A análise das frações obtidas por CCDC demonstrou que o componente de interesse se encontra nas frações F1.3.3 e F1.3.4.
3.2.3.1.3.1. Fração F1.3.4.
Esta fração foi submetida a uma nova CLV com 50 g de sílica gel H em uma coluna de 5 cm de diâmetro por 17 cm de comprimento. O procedimento foi idêntico aos realizados anteriormente.
Foram coletadas 8 frações , apresentadas na Tabela 5, juntamente com o esquema de eluição.
Tabela 5: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.3.4.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 49:1 100 F1.3.4.1 4 Hex/AcOEt - 19:1 100 F1.3.4.2 1 Hex/AcOEt – 9:1 100 F1.3.4.3 4 Hex/AcOEt – 17:3 100 F1.3.4.4 78 Hex/AcOEt - 4:1 100 F1.3.4.5 850 Hex/AcOEt - 3:1 100 F1.3.4.6 118 Hex/AcOEt - 7:3 100 F1.3.4.7 16 MeOH 100 F1.3.4.8 4
Após a secagem do solvente, foi observada uma grande quantidade de cristais na fração F1.3.4.5. Esta foi lavada com MeOH, obtendo-se um sólido branco que, por CCDC, constatou-se que se tratava de uma substância pura. Ao todo foram obtidos 600 mg de uma substância que foi codificada como VaD1-4 e submetida a análise por RMN para elucidação da estrutura.
3.2.3.1.4. Fração F1.4.
O estudo detalhado desta fração foi impulsionado inicialmente pela quantidade obtida (4,2 g) e, posteriormente, pela análise por CCDC que mostrou uma composição com substâncias de polaridades diferentes. Uma amostra de 3,5 g desta fração foi, então, submetida a uma CLV com 100 g de sílica gel H em uma coluna de 10 cm de diâmetro por 17 cm de comprimento. Foram coletadas 10 frações, relacionadas na Tabela 6, juntamente com o esquema de eluição com gradiente crescente de polaridade.
Tabela 6: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.4.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 9:1 250 F1.4.1 9 Hex/AcOEt - 4:1 250 F1.4.2 250 Hex/AcOEt – 7:3 250 F1.4.3 770 Hex/AcOEt – 3:2 250 F1.4.4 1305 Hex/AcOEt - 11:9 250 F1.4.5 568 Hex/AcOEt - 1:1 250 F1.4.6 188 Hex/AcOEt - 9:11 250 F1.4.7 117 Hex/AcOEt - 2:3 250 F1.4.8 86 AcOEt 250 F1.4.9 68 MeOH 250 F1.4.10 50
As frações obtidas foram analisadas por CCDC (Hex/AcOEt 3:1+ AcOH 1%), cujo resultado coloca a fração F1.4.4 como a mais promissora por conter grande quantidade de cristais e apresentar boa resolução de seus componentes neste sistema de fase móvel.
3.2.3.1.4.1. Fração F1.4.4.
Inicialmente, os cristais obtidos foram lavados com MeOH/Acetona 1:9. Este procedimento permitiu a obtenção de 300 mg de uma substância pura codificada como VaD1-5 e que foi submetida a análises por RMN para elucidação estrutural.
Uma amostra de 900 mg restantes da fração foi submetida a outra CLV em uma coluna de 5 cm de diâmetro por 17 cm de altura. Foram utilizados 50 g de sílica gel H e foram obtidas 10 frações, relacionadas na Tabela 7,
juntamente com o esquema de eluição utilizando gradiente crescente de polaridade.
Tabela 7: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.4.4.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 9:1 100 F1.4.4.1 3 Hex/AcOEt - 17:3 100 F1.4.4.2 15 Hex/AcOEt – 4:1 100 F1.4.4.3 4 Hex/AcOEt – 3:1 100 F1.4.4.4 225 Hex/AcOEt - 7:3 100 F1.4.4.5 160 Hex/AcOEt - 13:7 100 F1.4.4.6 24 Hex/AcOEt - 3:2 100 F1.4.4.7 14 Hex/AcOEt - 11:9 100 F1.4.4.8 9 Hex/AcOEt - 1:1 100 F1.4.4.9 21 MeOH 100 F1.4.4.10 399
Após secagem das frações e análise por CCDC, verificou-se que nenhuma delas se apresentava pura.
3.2.3.1.4.1.1. Fração F1.4.4.4.
Inicialmente foram feitos vários testes de CCDC para encontrar uma boa fase móvel para a mistura em questão. Determinada a fase móvel adequada (Hex/AcOEt 8:2+ AcOH 1%), foi realizada uma cromatografia em coluna “flash”, utilizando uma coluna de 2 cm de diâmetro contendo uma coluna de 20 cm de sílica gel 60, através de um fluxo de 5 cm/min de fase móvel.
A coluna foi empacotada com a própria fase móvel e foi utilizado nitrogênio de cilindro para imprimir pressão ao solvente na coluna. Foram coletadas 25 frações com 10 mL cada que foram analisadas por CCDC e
agrupadas de acordo com seus perfis cromatográficos. As 8 frações obtidas ao final estão relacionadas na Tabela 8.
Tabela 8: Frações obtidas com a coluna “flash” da fração F1.4.4.4. Frações reunidas (CCDC) Fração obtida Massa (mg)
1 F1.4.4.4.1 6 2-3 F1.4.4.4.2 23 4-5 F1.4.4.4.3 38 6-7 F1.4.4.4.4 25 8-10 F1.4.4.4.5 13 11-14 F1.4.4.4.6 43 15-19 F1.4.4.4.7 13 20-25 F1.4.4.4.8 9
Foi realizada uma nova análise por CCDC com as novas frações, observando-se que a fração F1.4.4.4.7 deveria ser uma única substância, pois apresentou uma única mancha. Esta amostra foi submetida a análises por RMN e foi codificada como VaD1-6.
3.2.3.1.5. Fração F1.5.
Esta fração, que apresentava uma massa de 1,9 g, mostrou ser compostas por várias substâncias diferentes ao ser analisada por CCDC. Foi promovida, então, uma separação inicial por CLV utilizando 100 g de sílica gel 60 H em uma coluna de 10 cm de diâmetro por 17 cm de altura. A sílica foi empacotada com hexano a pressão reduzida. Foram coletadas 10 frações que estão relacionadas na Tabela 9 com o esquema de eluição.
Tabela 9: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.5.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/CHCl3- 9:1 250 F1.5.1 2 Hex/ CHCl3 - 17:3 250 F1.5.2 4 Hex/ CHCl3– 4:1 250 F1.5.3 4 Hex/ CHCl3 – 7:3 250 F1.5.4 201 Hex/ CHCl3 - 3:2 250 F1.5.5 256 Hex/ CHCl3/Isop - 12:7:1 250 F1.5.6 49 Hex/ CHCl3/Isop - 6:3:1 250 F1.5.7 1200 Hex/ CHCl3/Isop - 3:1:1 250 F1.5.8 359 Hex/Isop - 3:2 250 F1.5.9 155 MeOH 250 F1.5.10 321
Após a secagem, cada uma destas frações foram analisadas por CCDC utilizando-se Hex/AcOEt 1:1 + AcOH 1%.
3.2.3.1.5.1. Fração F1.5.4. e F1.5.5.
As análises cromatográficas citadas acima permitiram concluir que as frações F1.5.4 e F1.5.5 continham essencialmente a substância VaD1-5 isolada anteriormente. Desta forma, foram isolados mais 400 mg desta substância.
Devido à alta complexidade das misturas obtidas nas demais fases obtidas com a CLV, os estudos da fração F1.5 foi encerrado.
Todas as etapas e procedimentos durante o isolamento e purificação dos componentes da fase F1 estão resumidos no esquema 1.