RANDER RANGEL
Reisolamento, modificação estrutural e avaliação da atividade
antimicrobiana de diterpenos de Viguiera arenaria
Dissertação de mestrado apresentada à Universidade de Franca como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Química.
Orientador: Prof. Dr. Vladimir Constantino Gomes Heleno
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM CIÊNCIAS
“Reisolamento, modificação estrutural e avaliação da
atividade antimicrobiana de diterpenos de Viguiera
arenaria”
Rander Rangel
Franca
2009
“Reisolamento, modificação estrutural e avaliação da
atividade antimicrobiana de diterpenos de Viguiera
arenaria”
Dissertação de Mestrado apresentada à Universidade de Franca como exigência parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Química.
Orientador: Prof. Dr. Vladimir Constantino Gomes Heleno
Franca
2009
Catalogação na fonte – Biblioteca Central da Universidade de Franca Rangel, Rander
R156r Reisolamento, modificação estrutural e avaliação da atividade antimicrobiana de diterpenos de Viguiera arenaria / Rander Rangel ; orientador: Vladimir Constantino Gomes Heleno. – 2009
75 f. : 30 cm.
Dissertação de Mestrado – Universidade de Franca
Curso de Pós-Graduação Stricto Sensu – Mestre em Ciências
1. Viguiera arenaria. 2. Atividade antimicrobiana de diterpenos – Avaliação. 3. Diterpenos – Reisolamento. 4. Diterpenos – Modificação estrutural. I. Universidade de Franca. II. Título.
"
Reisolamento
,
modificaC;30 estrutural e avaliaC;30 da
atividade
antimicrobiana
de diterpenos
de Viguiera
arenaria
"
dimir Constantino Gomes Heleno n ersidade de Franca - UNIFRAN
Nome Prof. Dr, Nilton -y-egoArakawa
Instituiyc30 Universldade do Vale do Paraiba - UNIVAP
Nós, os perecíveis, tocamos metais, vento, margens do oceano, pedras, sabendo que continuarão, imóveis ou ardentes,
e eu fui descobrindo, nomeando todas as coisas:
foi meu destino amar e despedir-me.
Dedico este trabalho a DEUS, aos meus pais José Roberto Rangel e Benedita Alves Rangel e também à Aline Monteiro Rangel e Lara Mariana Rangel.
Agradeço, acima de tudo a Deus, que iluminou todos os meus passos nessa trajetória, permitindo a conquista de mais esta etapa.
Ao Governo do Estado de São Paulo pelo incentivo financeiro. De um modo especial na pessoa do então Secretario Estadual de Educação Gabriel Chalita, pela bolsa mestrado para professores da rede estadual de ensino, importante instrumento de formação e incentivo aos caros colegas para o aperfeiçoamento profissional, pela oportunidade de concluir esse mestrado.
Aos companheiros da Diretoria de Ensino de Franca, pelo zelo e prontidão na resolução dos problemas apresentados, na pessoa de minha amiga Profª Ms Ivani, a supervisora Sirley e Yolanda, pela prestatividade que em muito contribuíram para os tramites legais para a concessão de minha bolsa.
Ao meu orientador Prof. Dr. Vladimir C. G. Heleno, pela paciência, pelo apoio, conhecimento passado e, principalmente, pela amizade durante esses meses.
Aos professores que em muito contribuíram para meu aperfeiçoamento profissional e pessoal, obrigado pela amizade. De um modo especial ao Prof. Dr. Sérgio que foi de vital importância para a realização do presente trabalho. Não poderia me esquecer dos professores Wilson, Miller e Rodrigo, cada qual pela contribuição a sua maneira para os objetivos cumprimos. A todos vocês o meu mais sincero OBRIGADO!
Aos colegas de bancada, que sempre me receberam de braços abertos. Estou muito feliz por ter trabalhado com vocês!
Aos meus pais, Jose Roberto e Benedita e a minha noiva Aline pelo amor e incentivo, sem os quais eu nunca teria chegado até aqui. Impossível expressar em palavras meu amor e gratidão por vocês!
A todas as pessoas que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho. Pessoas que me incentivaram de diferentes maneiras. A todos vocês o meu sincero “MUITO OBRIGADO”!
ÍNDICE
Índice i
Lista de Abreviaturas ii
Lista de Figuras iii
Lista de Tabelas v Resumo vi Abstract viii 1.INTRODUÇÃO 1 1.1. Produtos Naturais 1 1.2. O Cerrado Brasileiro 2
1.3. Família Asteraceae, Tribo Heliantheae e o Gênero Viguiera 3
1.4. Viguiera arenaria 4
1.5. Diterpenos 5
1.6. Obtenção de novas substâncias ativas 7
1.7. Microrganismos da cavidade bucal 9
1.8. Patógenos bucais e cárie dental 10
2.OBJETIVOS 13
3.MATERIAIS E MÉTODOS 14
3.1. Especificações de Materiais, Instrumentos e Técnicas 14
3.2. Procedimento de re-isolamento dos diterpenos 15
3.3. Descrição das reações realizadas 31
3.4. Testes de atividade antimicrobiana 33
4.RESULTADOS E DISCUSSÃO 35
4.1. Identificação e caracterização das substâncias re-isoladas 35
4.2. Obtenção e determinação estrutural dos derivados semi-sintéticos 50
4.3. Espectros de RMN dos diterpenos isolados e obtidos por semi-síntese 53
4.4. Avaliação da atividade antimicrobiana. 63
5.CONCLUSÕES 70
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura SignificadoAcOEt Acetato de etila
AcOH Ácido acético
ATCC American Type Culture Collection
CCC Cromatografia em coluna clássica
CCDC Cromatografia em camada delgada comparativa
CCDP Cromatografia em camada delgada preparativa
CCF Cromatografia em coluna “flash”
CIM Concentração Inibitória Mínima
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CLE Clorexidina
CLV Cromatografia líquida a vácuo
DCM Diclorometano DMSO Dimetilsulfóxido
d dubleto
dd duplo dubleto
ddd duplo duplo dubleto
δ (delta) deslocamento químico
EDB Extrato diclorometânico bruto
GH Grupamento hidrofílico Hex Hexano m Multipleto MeOH Metanol PN Produtos Naturais quint quintupleto TMS Tetrametilsilano
REA Relação estrutura-atividade
RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN de 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
RMN de 13C {1H} Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13, H desacoplado
s singleto
sext sextupleto
LISTA DE FIGURAS
Figura Pág.
Figura 1: Estrutura dos diterpenos 1 e 2. 05
Figura 2: Possíveis transformações dos diterpenos da classe dos pimaranos. 09 Figura 3: Estrutura da substância VaD1-2. 36 Figura 4: Estrutura da substância VaD1-3. 38 Figura 5: Estrutura da substância VaD1-4. 40 Figura 6: Estrutura da substância VaD1-5. 42 Figura 7: Estrutura da substância VaD1-6. 44 Figura 8: Estrutura da substância VaD1-1. 46 Figura 9: Estrutura da substância VaD2-1. 48 Figura 10: Estrutura da substância VaD1-4m. 50 Figura 11: Estrutura da substância VaD1-2m. 51 Figura 12: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-1. 53 Figura 13: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-1 (expansão 1). 53 Figura 14: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-1 (expansão 2). 54 Figura 15: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-1 (expansão 3). 54 Figura 16: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-1 (expansão 4). 55 Figura 17: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-1 (expansão 5). 55 Figura 18: Espectro de RMN de 13 C de VaD1-1. 56 Figura 19: Espectro de RMN de 13 C de VaD1-1 (expansão 1). 56 Figura 18: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-2. 57 Figura 19: Espectro de RMN de 13 C de VaD1-2. 57 Figura 20: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-3. 58 Figura 21: Espectro de RMN de 13 C de VaD1-3. 58 Figura 22: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-4. 59 Figura 23: Espectro de RMN de 13 C de VaD1-4. 59 Figura 24: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-5. 60 Figura 25: Espectro de RMN de 13 C de VaD1-5. 60 Figura 26: Espectro de RMN de 1 H de VaD1-6. 61 Figura 27: Espectro de RMN de 13 C de VaD1-6. 61
Figura 28: Espectro de RMN de 1H de VaD2-1. 62 Figura 29: Espectro de RMN de
13
C de VaD2-1. 62
Figura 30: Estrutura de todos os diterpenos obtidos neste trabalho. 63 Figura 31: Estrutura química do ácido ent-kaur-16(17)-en-19-óico. 68
LISTA DE TABELAS
Tabela Pág.
Tabela 1: Resumo do resultado da partição. 16 Tabela 2: Esquema de eluição durante a CLV da fase F1. 17 Tabela 3: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.2. 18 Tabela 4: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.3. 20 Tabela 5: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.3.4. 21 Tabela 6: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.4. 22 Tabela 7: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.4.4. 23 Tabela 8: Frações obtidas com a coluna “flash” da fração F1.4.4.4. 24 Tabela 9: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.5. 25 Tabela 10: Esquema de eluição durante a CLV da fração F2. 27 Tabela 11: Esquema de eluição durante a CLV da fração F2.6. 28 Tabela 12: Esquema de eluição durante a CLV da fração F2.4. 29 Tabela 13: Frações obtidas com a coluna “flash” da fração F2.4.4. 30 Tabela 14: Dados de RMN de 1 H e de 13C da substância VaD1-2 (CDCl 3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). 37 Tabela 15: Dados de RMN de 1 H e de 13C da substância VaD1-3 (CDCl 3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). 39 Tabela 16: Dados de RMN de 1H e de 13C da substância VaD1-4 (CDCl
3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). 41 Tabela 17: Dados de RMN de 1 H e de 13C da substância VaD1-5 (CDCl 3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). 43 Tabela 18: Dados de RMN de 1H e de 13C da substância VaD1-6 (CDCl
3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). 45 Tabela 19: Dados de RMN de 1 H e de 13C da substância VaD1-1 (CDCl 3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). 47 Tabela 20: Dados de RMN de 1 H e de 13C da substância VaD2-1 (CDCl 3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). 49
Tabela 21: Atividade antimicrobiana dos diterpenos 1,2,3,4 e 5. 64 Tabela 22: Atividade antimicrobiana dos diterpenos 6, 7, 8 e 9. 65
RESUMO
Neste trabalho, seis diterpenos (2 a 7) da classe dos pimaranos foram reisolados do extrato em diclorometano das raízes de Viguiera arenaria Baker e um (1) foi isolado pela primeira vez da espécie, totalizando sete diterpenos naturais obtidos. As estruturas foram determinadas por técnicas de ressonância magnética nuclear. H H COOH H COOH O H HO
VaD1-1 (1) VaD1-2 (2) VaD 3)
VaD1-4 (4) H CH2OH HO H CH2OH OH H COOH OH O H O VaD1-5 (5) VaD 6) VaD2-1 (7) VaD1-4m (8) H COONa VaD1-2m (9) 1-3 ( 1-6 (
Com o trabalho de reisolamento e purificação, dois diterpenos foram obtidos em maior quantidade, suficiente para a utilização destes produtos naturais em modificações estruturais. Com isso, foram obtidos os derivados semi-sintéticos 8 e 9 a partir, respectivamente, da acetilação de 4 e da formação do sal de sódio de 2.
Estes nove diterpenos foram submetidos à avaliação de sua atividade antimicrobiana frente a um grupo de bactérias que inclui importantes patógenos bucais: Streptococcus piogenes ATCC 19615, Streptococcus pneumoniae ATCC 6305, Streptococcus sobrinus ATCC 33478, Streptococcus mitis ATCC 49456, Lactobacillus casei ATCC 11578, Streptococcus mutans ATCC 25275,
Streptococcus salivarius ATCC 25975, Streptococcus sanguinis ATCC10556; e
a um grupo de bactérias responsáveis por outras patologias humanas:Kocuria rhizophila ATCC 9341, Enterococcus hirae ATCC 10541, Staphylococcus aureus ATCC 9144, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus subtilis ATCC 6051, Bacillus cereus ATCC
14579
Os resultados obtidos permitem traçar novos objetivos no que diz respeito à obtenção de derivados e a subseqüente comparação entre a atividade antimicrobiana e as estruturas químicas identificadas, enriquecendo as informações obtidas até o momento. Isto pode possibilitar a realização de modificações estruturais dirigidas para o desenvolvimento de novos fármacos a partir dos protótipos extraídos.
ABSTRACT
In the present work, six diterpenes (2 to 7) from the pimarane class were reisolated from Viguiera arenaria Baker and another one (1) was first isolated from this specie, furnishing a total number of seven natural diterpenes obtained. The structures were clarified by means of nuclear magnetic resonance experiments. H H COOH H COOH O H HO
VaD1-1 (1) VaD1-2 (2) VaD 3)
VaD1-4 (4) H CH2OH HO H CH2OH OH H COOH OH O H O VaD1-5 (5) VaD 6) VaD2-1 (7) VaD1-4m (8) H COONa VaD1-2m (9) 1-3 ( 1-6 (
The reisolation work, after the purification processes, yielded two diterpenes in considerable amounts, enough to be used as substracts in synthetic structure modification. This allowed us to obtain the semi-synthetic derivatives 8 and 9 respectively from the acetylation of compound 4 and the sodium salt formation from 2.
The nine diterpenes were submitted to microbiological assays to evaluate their antimicrobial activity against a group of oral pathogens: Streptococcus
piogenes ATCC 19615, Streptococcus pneumoniae ATCC 6305, Streptococcus sobrinus ATCC 33478, Streptococcus mitis ATCC 49456, Lactobacillus casei
ATCC 11578, Streptococcus mutans ATCC 25275, Streptococcus salivarius ATCC 25975, Streptococcus sanguinis ATCC10556; and against a group of bacteria responsible for other human pathologies: Kocuria rhizophila ATCC
9341, Enterococcus hirae ATCC 10541, Staphylococcus aureus ATCC 9144,
Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus subtilis ATCC 6051, Bacillus cereus ATCC 14579.
The good results obtained during the antimicrobial activity evaluations lead us to determine new objectives concerning with the variation of structure and activity evaluation. This can allow us to apply particular structure modifications aiming to obtain some prototypes that may turn possible the obtention of new drugs.
1. INTRODUÇÃO
1.1. Produtos Naturais.
O Dictionary of Natural Products descreve dados químicos, estruturais e bibliográficos para cerca de 100.000 produtos naturais e substâncias relacionadas,1 o que mostra a importância desta fonte de substâncias.
Estas substâncias, classificadas como PN, são de inúmeras classes e apresentam variadas atividades biológicas e terapêuticas de importância elevada para a humanidade.2-4 Em 1990 já eram 119 os fármacos utilizados universalmente pela medicina convencional e extraídos de cerca de 90 espécies de Plantas Superiores.5
Se considerarmos que só no Brasil, maior biodiversidade genética vegetal do mundo, existem mais de 55.000 espécies catalogadas,6 de um total estimado entre 350.000 a 550.000,2 podemos imaginar a variedade de substâncias que ainda podem ser obtidas de fontes naturais. Devemos considerar também que, além de plantas, organismos marinhos7,8 e microorganismos4 contribuem consideravelmente para obtenção de produtos naturais. Com isto, pode-se estimar a variedade estrutural de substâncias a serem identificadas e, conseqüentemente, a variedade de atividades biológicas que se pode esperar.
Deve ser levado em consideração, ainda, que o número estimado de espécies de seres vivos varia de 5 a 50 milhões e que estas cifras representam apenas 0,001% das espécies que existiam em outras épocas, o que revela o problema da relação entre a extinção e a biodiversidade das espécies.9 Esses números ressaltam a importância do estudo sobre os diversos PN.
1.2. O Cerrado Brasileiro.
Uma importante fonte de biodiversidade é o cerrado brasileiro, apesar de ainda ser relativamente pouco valorizado. Segundo Castro e colaboradores,10 estima-se que no cerrado existam aproximadamente 1.709 espécies arbóreas e arbustivas, que compreendem por volta de 572 gêneros de 210 famílias de vegetais, além das mais de 5.000 espécies herbáceas e subarbustivas. Neste bioma, existem 6.000 espécies de plantas vasculares, segundo Felfili e colaboradores11 e 10.000 espécies de plantas, segundo Meyers e colaboradores.12 As informações sobre a flora de cerrado são muito dispersas, pois provêm de estudos realizados sob metodologias muito variadas, o que dificulta comparações.13
A vegetação do cerrado ocupa 23% da área total do Brasil com cerca de 2 milhões de km2, só perdendo em área para a floresta amazônica com 3,5 milhões de km2.13 A composição da flora de cerrado engloba principalmente gramíneas. Espécies arbustivas e arbóreas constituem entre 10 e 60%,13 sendo que, dentre as herbáceas, as famílias de plantas mais importantes são Leguminosae, Asteraceae, Myrtaceae e Rubiaceae,14 as quais apresentam uma grande diversidade de características adaptativas devido ao clima seco e solos pobres em nutrientes,15 o que leva à produção de uma vasta gama de metabólitos necessários à sobrevivência e adaptação da vegetação. Desta forma, estes metabólitos podem ser explorados na busca de novas substâncias com ação biológica e farmacológica.
1.3. Família Asteraceae, Tribo Heliantheae e o Gênero Viguiera.
A família Asteraceae, uma das que apresenta maior número de espécies, dentre as Angiospermas, é composta por 1.535 gêneros e aproximadamente 23.000 espécies, agrupadas em 3 subfamílias e 17 tribos.16
Essa família vegetal, por apresentar capacidade de biossintetizar metabólitos especiais com elevada diversidade estrutural, podendo ser destacadas as classes dos terpenóides, poliacetilenos, flavonóides e p-hidroxiacetofenonas;17 e por possuir importância em diferentes aspectos (alimentício, medicinal e econômico), tem sido fonte de diversos estudos.18-19 Podem ser destacadas como exemplo a alcachofra (Cynara scolymus), a chicória (Chichorium intybus), e a alface (Lactuca sativa), de importância alimentar e até medicinal; o guaco (Mikania glomerata), utilizado como antisséptico das vias respiratórias; a carqueja (Baccharis trimera), utilizada na promoção de diurese; a arnica (Arnica montana), utilizada como cicatrizante; o girassol (Helianthus annus), o crisântemo (Chrysanthemum cinerariaefolium) e a estévia (Stevia rebaudiana), cuja importância econômica está relacionada à comercialização de óleo comestível, de inseticidas e de adoçante natural, respectivamente.
Dentre as 17 tribos desta família encontra-se a tribo Heliantheae que, por sua vez, engloba 35 subtribos e cerca de 300 gêneros.20 No tocante a sua classificação taxonômica, essa tribo apresenta uma situação peculiar,16 devido ao fato de suas espécies serem química e morfologicamente semelhantes a outras espécies estreitamente correlacionadas. Um exemplo disso são os grupos de Viguiera, que atualmente estão classificados próximos entre si, mas na realidade estão filogeneticamente mais relacionados com os gêneros de
outras espécies (Helianthus, Tithonia, Pappopholus), os quais, por sua vez, estão distantes de Viguiera.
O gênero Viguiera H.B.K., pouco estudado no Brasil, tanto do ponto de vista taxonômico quanto do químico e do biológico, compreende cerca de 200 espécies21 e está situado na tribo Heliantheae, subtribo Helianthinae,16,22,23 sendo caracterizado por possuir plantas que biossintetizam, principalmente, terpenóides como metabólitos secundários,22 sendo mais comuns as lactonas sesquiterpênicas do tipo heliangolídeo e furanoheliangolídeo e diterpenos derivados do caurano e traquilobano.
A ocorrência desse gênero extende-se desde sudoeste da América do Norte até o sul da América do Sul. A grande concentração de espécies é encontrada no México, nas regiões Andinas e, no Brasil, as espécies de
Viguiera distribuem-se principalmente em áreas de cerrado.15
1.4. Viguiera arenaria
Viguiera arenaria Baker é uma planta herbácea nativa de cerrados do
Brasil que apresenta uma ramificação única com poucas folhas espalhadas e um conjunto de raízes tuberosas.
Estudos recentes desta espécie forneceram informações importantes sobre os metabólitos secundários encontrados nesta fonte botânica.24 Neste trabalho, foi preparado um extrato diclorometânico das raízes de V. arenaria, a partir do qual foram realizadas partições e subseqüentes separações e purificações das frações por variados métodos cromatográficos. Este trabalho resultou, além dos resultados biológicos, no isolamento de sete diterpenos da classe dos pimaranos, sendo dois deles consideravelmente abundantes na
planta: o ácido dien-19-óico (1) e o ent-pimara-8(14),15-dien-3β-ol (2), apresentados na figura 1.
H COOH
H HO
1 2
Figura 1: Estrutura dos diterpenos 1 e 2.
1.5. Diterpenos
A classe dos diterpenos envolve uma quantidade considerável de substâncias que apresentam variadas atividades biológicas e ecológicas. Algumas destas propriedades são clássicas, como a dos ácidos resínicos, como o abiético, que são exsudatos da madeira das árvores e protegem-nas de infecções e de ataque de insetos. Podem ser citadas, também, as giberelinas que são hormônios vegetais que estimulam o crescimento de plantas; o esteviosídeo, que é um adoçante natural; a forskolina que estimula a adenilciclase; o paclitaxel, que é um importante antineoplásico, etc.
As substâncias desta classe apresentam, também, atividades ecológicas tais como redução do número de larvas de insetos herbívoros em sua reprodução25 e atividade inseticida, manifestada por alguns clerodanos em
Leptinotarsa decemlineata (besouro de batata), uma peste que desenvolveu
Segundo Ghisalberti,27 os diterpenóides possuem outras atividades biológicas, como: atividade antimicrobiana, atividade antiparasitária (Trypanosoma cruzi), citotoxicidade com relativa seletividade para células cancerígenas, atividade contra o vírus causador da AIDS, atividade hipotensora, atiinflamatória, entre outras. Um exemplo de diterpenóide utilizado como droga anticancerígena é o paclitaxel, que é uma substância extraída de
Taxus brevifolia Nutt. Esta substância é um medicamento disponível e um dos
mais importantes antineoplásicos, que foi descoberto num estudo de produtos naturais com ação antitumoral produzido em pesquisas relativamente recentes.
Na medicina popular mexicana, várias espécies da família Asteraceae são utilizadas em preparações de uso ginecológico28 como, por exemplo, agentes contraceptivos, estimulantes da menstruação e abortivos.29 O gênero mais empregado para tais propósitos é o Montanoa.30-34 A planta utilizada é conhecida popularmente como “Zoapatle” (Montanoa tomentosa), que significa “medicina para mulheres”. Estudos fitoquímicos realizados com essa planta demonstraram que os principais constituintes do seu metabolismo são os diterpenos da classe dos cauranos.
Além destes estudos, trabalhos recentes têm apresentado novos testes com resultados promissores para substâncias desta classe, tais como significante atividade antiespasmódica e relaxante da musculatura lisa. Em trabalho realizado por Ohashi e seus colaboradores,35 quatro pimaranos foram isolados das folhas de Orthosiphon aristatus e estes apresentaram inibição da contração da aorta torácica induzida por KCl. Em outro trabalho,36 Ambrosio e seus colaboradores evidenciaram que o ácido pimaradienóico (ácido ent-pimara-8(14)-dien-19-óico) (1), um diterpeno da classe dos pimaranos (figura
1), inibe a contração de artéria carótida de rato induzida por fenilefrina e KCl, enquanto que Tirapelli e seus colaboradores37 demonstraram o efeito inibitório desse metabólito em aorta de rato. Estudos recentes mostraram que o mecanismo de ação desta inibição é devido ao bloqueio do influxo de Ca2+ extracelular.38,39 De forma geral, os antagonistas do cálcio causam uma dilatação arteriolar generalizada, o que resulta em queda da pressão arterial.40 Devido a isto, foi formulada uma hipótese de que este metabólito poderia apresentar atividade anti-hipertensiva in vivo,38 o que foi confirmado por Tirapelli e seus colaboradores, colocando os diterpenos como uma nova promessa para o tratamento de doenças cardiovasculares.39
Além de observar que os diterpenos apresentam significante potencial antiespasmódico,38 estudos comparativos entre metabólitos de estruturas análogas, demonstraram que pequenas alterações estruturais são capazes de influenciar significativamente esta atividade.41,42
Esta considerável gama de atividades apresentada pelas substâncias desta classe é o que motiva o trabalho com estes metabólitos.
1.6. Obtenção de novas substâncias ativas.
Atualmente existe grande dedicação de vários pesquisadores, em diferentes projetos, na busca por novas substâncias que sejam ainda mais ativas que as já conhecidas, ou mesmo que apresente novas atividades. Na maioria dos casos, o que realmente se busca é uma substância com potencial promissor para se chegar à produção de um fármaco.
Este longo e árduo caminho é bastante conhecido de vários pesquisadores nas áreas de Química e Farmácia, principalmente. No entanto, uma discussão
comum é sobre qual o caminho mais proveitoso para se chegar a novas substâncias ativas.
Certamente, como exposto anteriormente, os Produtos Naturais desempenham um papel de enorme importância nesta busca. Entretanto, os estudos clássicos como os de isolamento de substâncias de fontes naturais não têm fornecido mais tantas estruturas diferentes (inéditas) como anteriormente. Hoje em dia, muitos exemplares de várias classes de substâncias já foram isolados e estudados de forma que, a cada novo estudo de isolamento e identificação, são poucas as novas estruturas obtidas.
A química orgânica sintética tem desenvolvido um importante papel na área de obtenções de novas estruturas. Existe um número considerável de substâncias utilizadas na indústria farmacêutica, por exemplo, que são de origem sintética.
Considerando o fato de que, em várias classes de substâncias, a atividade apresentada por uma determinada estrutura chega a ser bem diferente da atividade apresentada por uma estrutura análoga, a modificação estrutural de PN de classes que apresentaram atividades promissoras deve ser vista como uma interessante fonte de novas estruturas com possibilidade de apresentar atividade biológica de importância. Se comparada com o estudo de isolamento clássico, a modificação estrutural apresenta possibilidade maior de obtenção de estruturas interessantes e em maior número.
Se forem observadas algumas propostas de transformações das estruturas dos diterpenos (figura 2), pode-se perceber a possibilidade de obter um número considerável de diferentes estruturas que podem ser testadas para uma série de atividades diferentes.
H HO HO H O O O COOH H NaOH COO-Na+ H CH2N2 H O O COOMe H H2, Pd/C
Figura 2: Possíveis transformações dos diterpenos da classe dos pimaranos.
Deve ser levado em consideração que um dos fatores limitantes de maior importância, ao submeter ou não uma substância isolada a um ensaio biológico, é a quantidade de substância obtida. Neste caso, se forem realizadas transformações químicas nos PN isolados em maior quantidade, aumenta-se a gama de ensaios a que se pode submeter um derivado obtido.
1.7. Microrganismos da cavidade bucal.
A cavidade bucal é formada por diferentes superfícies que mantêm o crescimento de comunidades microbianas características.43 Esta cavidade apresenta temperatura entre 34 e 36oC e pH quase neutro, entre 6,7 e 7,3, mantido pela saliva.44 Tais condições são favoráveis ao crescimento de vários microrganismos que, além dessas condições, têm sua proliferação propiciada pela presença de substratos particulares exógenos provenientes da dieta, como carboidratos e proteínas.
A microbiota bucal é um complexo ecossistema que envolve uma grande variedade de microrganismos.45 A capacidade de aderência destes microrganismos às superfícies da cavidade bucal, mediada por adesinas da
superfície das bactérias e receptores da superfície oral,43 bem como a capacidade de algumas bactérias se aderirem a outras bactérias (co-agregação) possibilita a formação do biofilme, que é indispensável para que as bactérias mantenham contato com as superfícies bucais e resistam ao fluxo da saliva.44 Deste modo é formado o biofilme dental, resultado da colonização de bactérias sobre a superfície do dente, que é benéfico ao hospedeiro (no caso, o homem), pois ajuda a prevenir a colonização de microrganismos exógenos e patógenos. A composição deste biofilme é relativamente estável, apesar da exposição regular dos microrganismos a mudanças no ambiente bucal.46 O tipo de microbiota predominante no biofilme dental pode variar conforme a dieta e a remoção mecânica regular deste biofilme. Em pessoas que mantêm uma higiene oral adequada e que não abusam da ingestão de sacarose, a microbiota predominante pode ser menos patogênica, de forma a ter uma boca saudável mesmo possuindo o biofilme.47 Por outro lado, quando existe uma conduta contínua de agressão por parte do indivíduo, como em situações nas quais a utilização de sacarose é freqüente e a remoção mecânica do biofilme é deficiente,47 há um desequilíbrio da microbiota bucal residente e pode se estabelecer uma população microbiana patogênica.46-48 Neste caso, o biofilme se torna mais virulento, podendo levar a complicações mais sérias como cáries, gengivites e periodontites.44,47,49,50
1.8. Patógenos bucais e cárie dental.
A cárie dental é um grande problema de saúde pública ainda nos dias de hoje em muitas partes do mundo.51 Esta é uma doença infecciosa do tecido duro que se caracteriza pela desintegração localizada e progressiva da
estrutura do dente, causada por ácidos orgânicos produzidos pela fermentação bacteriana a partir de carboidratos presentes na dieta.44 Esta doença tem sido associada com os microrganismos Streptococcus spp., incluindo Streptococcus
mitis, S. sanguinis e, principalmente, S. mutans e S. sobrinus, além de
Lactobacillus spp., incluindo Lactobacillus casei.52-53
A remoção mecânica do biofilme, através da escovação e uso de fio-dental, ainda é uma das formas mais eficientes e importantes na manutenção da saúde bucal. No entanto, a maioria da população certamente não promove tal remoção de forma eficiente.54 Além disso, o tratamento dentário é normalmente mais caro do que a maioria da população pode pagar e nem sempre é prontamente acessível, especialmente em países em desenvolvimento.55 Desta forma, muitas pesquisas têm sido feitas com o objetivo de encontrar compostos anti-cariogênicos que possam ser incorporados em produtos como enxaguatórios bucais,56,57 visando complementar a remoção mecânica do biofilme da cavidade bucal e reduzir a incidência de cárie na população.55,58
Vários antibióticos como ampicilina, clorexidina, sanguinarina, metronidazol, anti-sépticos fenólicos e anti-sépticos de amônia quaternária, entre outros, têm sido muito eficazes na prevenção da cárie dental.52,59 No entanto, vários efeitos adversos tem sido notados com o uso destes produtos, como o aparecimento de manchas em dentes e restaurações, aumento de formação de cálculos, diarréia e desarranjos das floras oral e intestinal.52,55 Isto justifica a busca por novos anti-cariogênicos eficazes para serem empregados na prevenção da cárie.
Pesquisas realizadas recentemente por nosso grupo,56 demonstraram que o ácido caurenóico, um diterpeno da classe dos cauranos isolado de Aspilia
foleacea, pode ser utilizado como protótipo para a descoberta de novos e
eficazes agentes contra patógenos responsáveis pela cárie e doenças periodontais. Estes resultados colocam os diterpenos como alvos em potencial para estudos de atividade antimicrobiana contra patógenos orais.
2. OBJETIVOS
2.1. Realizar o fracionamento do extrato diclorometânico das raízes de
Viguiera arenaria para o re-isolamento dos diterpenos desta fonte botânica,
com a intenção principal de obter os componentes mais abundantes;
2.2. Utilizar os componentes mais abundantes do extrato citado acima para realização de transformações químicas e obtenção de diferentes substâncias da classe dos diterpenos pimaranos;
2.3. Submeter as substâncias re-isoladas e os derivados semi-sintéticos obtidos a ensaios biológicos de atividade antimicrobiana frente a uma série de microrganismos, principalmente os patógenos da cavidade bucal.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Especificações de Materiais, Instrumentos e Técnicas
3.1.1. Para o desenvolvimento das separações e purificações por cromatografia em coluna clássica e cromatografia líquida a vácuo (CLV), foram utilizadas colunas de vidro de dimensões compatíveis com a massa da amostra. Como fase estacionária, foi utilizada sílica gel 60 H (Merck, código 1.07736.1000) e sílica gel 60 (Merck, 0,063-0,200 mm, código 1.07734.1000).
3.1.2. Durante o reisolamento dos metabólitos alvo, os processos de cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) foram realizados em placas de vidro (5x20, 10x20 ou 20x20 cm) tendo como fase estacionária sílica gel GF254 (Merck, 1.07730.1000). Foi utilizada uma espessura de 0,25 mm da
fase estacionária.
3.1.3. Os reveladores de placas cromatográficas utilizados foram: luz ultravioleta (Spectroline, modelo ENF-240C); câmara de iodo e revelador químico (solução de Vanilina sulfúrica a 2%).
3.1.4. Os espectros de RMN foram adquiridos em um equipamento Bruker DRX400 (400 MHz para 1H e 100 MHz para 13C) no Laboratório de RMN da UFSCar ou em um equipamento Bruker DPX300 (300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C) no Depto. De Química da USP - Ribeirão Preto. Como solvente foi utilizado, principalmente, CDCl3 98,9% e como padrão de referência interno
3.1.5. Os solventes utilizados, tanto nos procedimentos de isolamento e purificação quanto nos procedimentos reacionais, foram todos de grau PA.
3.1.6. A evaporação dos solventes em todos os processos realizados foi executada através de evaporadores rotativos (Fisatom 801 ou Marconi MA-120) com sistemas de condensação refrigerados por banhos refrigeradores (SOLAB ou Marconi MA-184).
3.1.7. As reações químicas foram realizadas utilizando-se agitadores magnéticos com aquecimento (Biothec BT40/A ou Fisatom Mod.752).
3.2. Procedimento de reisolamento dos diterpenos. 3.2.1. Obtenção do extrato de Viguiera arenaria.
O extrato utilizado neste trabalho (EDB – extrato diclorometânico bruto) foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Fernando Batista da Costa do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. A preparação deste extrato bruto diclorometânico de V. arenaria foi realizada conforme descrito previamente na literatura.24,60
3.2.2. Partição do extrato.
Com a intenção de promover uma separação prévia dos componentes do extrato por diferença de polaridade, o extrato diclorometânico bruto das raízes de Viguiera arenaria foi submetido a uma partição com diferentes solventes. Inicialmente, 65,2 g do extrato foram suspensos em 400mL de uma
solução de MeOH - H2O a 9:1 v/v, e a mistura permaneceu por 25 minutos no
aparelho de ultrassom para homogeneizar a suspensão. Após este procedimento, retirou-se uma parte do extrato (9,5 g) que não solubilizou nem suspendeu no solvente utilizado, e, que foi denominada precipitado insolúvel (PI). Com a parte suspensa em metanol-água, foram realizadas as partições com hexano (5 porções de 300 mL) e com DCM (4 porções de 300 mL). As fases obtidas foram todas secas com sulfato de magnésio anidro e tiveram o solvente retirado por evaporação rotativa. Desta forma foram obtidas frações com grau diferenciado de polaridade de seus componentes: a fase Hexânica (F1), a fase diclorometânica (F2) e a fase hidroalcoólica (F3). Pelo conhecimento do trabalho previamente realizado com este extrato, sabia-se que as substâncias que se procurava reisolar seriam encontradas nas fases F1 e F2. As massas dos extratos particionados obtidos após a remoção dos solventes encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1: Resumo do resultado da partição.
Fase Descrição Massa
PI Precipitado insolúvel 9,5 g
F1 Partição com hexano 31,36 g
F2 Partição com diclorometano 19,87 g
F3 Fase hidroalcoólica 2,38 g
3.2.3. Isolamento dos metabólitos de interesse.
Uma análise inicial por CCDC das fases obtidas no item anterior, por meio da utilização de uma fase móvel Hex/AcOEt 7:3 + AcOH 1%, mostrou que haviam poucas diferenças entre as fases F1 e F2. A fase F1 foi escolhida para o início dos fracionamentos.
3.2.3.1. Fracionamento da fase F1 (hexano).
Com a massa total da fase F1, foi realizada uma CLV com uma coluna com placa de vidro sinterizado de 18 cm de diâmetro por 25 cm de altura. Foi utilizada uma massa de 500 g de sílica gel H, empacotada nesta coluna sob pressão reduzida, utilizando hexano como solvente inicial.
Esta proporção de sílica em relação à quantidade de amostra é próxima de 16:1, e pode ser considerada como relativamente pequena para uma boa separação cromatográfica. No entanto, o objetivo desta CLV é apenas o de realizar uma separação inicial dos componentes do extrato por grau de polaridade.
Foram coletadas 6 frações, conforme esquema de gradiente crescente de polaridade descrito na Tabela 2.
Tabela 2: Esquema de eluição durante a CLV da fase F1.
Solvente Utilizado Volume (L) Fração Massa (g)
Hex 2,5 F1.1 0,39 Hex/AcOEt - 9:1 2,5 F1.2 10,57 Hex/AcOEt - 4:1 2,5 F1.3 11,27 Hex/AcOEt - 1:1 2,5 F1.4 4,20 AcOEt 2,5 F1.5 1,90 MeOH 2,5 F1.6 2,85 3.2.3.1.1. Fração F1.1.
Como uma primeira análise desta fração, foi realizada uma CCDC utilizando como eluente uma mistura de Hex/AcOEt – 19:1. A revelação desta placa mostrou apenas um componente principal nesta fração. Para isolar tal
componente, foi realizada uma CCC com sílica gel 60 como fase estacionária e Hex/AcOEt – 19:1 como eluente. Após a coluna, as frações foram analisadas por CCDC com o mesmo eluente antes utilizado e as frações contendo o componente principal foram reunidas e o solvente foi retirado por evaporação rotativa. A pureza do material mostrava que deveria se tratar de uma única substância, que foi codificada como VaD1-1. Foram obtidos 200 mg desta substância.
3.2.3.1.2. Fração F1.2.
Uma análise inicial desta fase foi feita por CCDC com Hex/AcOEt – 9:1 + AcOH 1%. Neste caso, parecia se tratar de uma única substância majoritária.
Com uma fração de 2 g da massa obtida de F1.2 foi feita uma nova CLV (coluna: 10 cm diâmetro por 17 cm altura) utilizando-se 80 g de sílica gel H. O procedimento foi exatamente como descrito no item 3.2.3.1. Todas as frações tiveram o solvente retirado por evaporação rotativa e a massa determinada. As 7 frações coletadas, bem como os detalhes das misturas de solventes utilizadas (gradiente crescente de polaridade), estão relacionados na Tabela 3.
Tabela 3: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.2.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 49:1 250 F1.2.1 4 Hex/AcOEt - 19:1 250 F1.2.2 320 Hex/AcOEt – 9:1 250 F1.2.3 680 Hex/AcOEt - 5:1 250 F1.2.4 463 Hex/AcOEt - 1:1 250 F1.2.5 230 AcOEt 250 F1.2.6 103 MeOH 250 F1.2.7 185
3.2.3.1.2.1. Fração F1.2.3.
Pela grande quantidade de cristais obtida nesta fração, preferiu-se lavar os mesmos com MeOH a frio. Uma amostra desta fração foi submetida a CCDC (Hex/AcOEt 9:1 + 1% AcOH), mostrando uma única mancha após revelação. Esta substância foi codificada como VaD1-2 e submetida a análises de RMN. Foram obtidos 400 mg da substância.
3.2.3.1.2.2. Fração F1.2.5.
O trabalho com esta fração começou por extensa seção de testes de fases móveis por CCDC. Em seguida, uma CCDP com 90 mg desta fração foi realizada com a melhor fase móvel encontrada (Hex/AcOEt 9:1 + 1% AcOH). As manchas principais foram retiradas e extraídas com DCM. Esse procedimento permitiu isolar uma única substância (5 mg) que foi codificada como VaD1-3 e submetida a análises por RMN para identificação estrutural.
3.2.3.1.3. Fração F1.3.
Para esta parte do trabalho foram separados 3,5 g da fração F1.3 e, inicialmente, foi realizada uma CCDC (Hex/AcOEt 8:2 + 1% AcOH) incluindo os metabólitos isolados até este ponto (VaD1-1, VaD1-2 e VaD1-3) para efeito de comparação. Este procedimento proporcionou a informação de que esta fase era composta de uma única substância, diferente das demais obtidas até aqui.
Desta forma, foi realizada uma CLV (coluna de 10 cm diâmetro por 17 cm altura) com a amostra desta fração (3,5 g) em 100 g de sílica gel H. O procedimento foi exatamente como descrito antes. Foram coletadas 8 frações
que se encontram relacionadas, juntamente com o esquema de eluição (gradiente crescente de polaridade) utilizado, na Tabela 4.
Tabela 4: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.3.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 19:1 250 F1.3.1 4 Hex/AcOEt - 9:1 250 F1.3.2 323 Hex/AcOEt – 17:3 250 F1.3.3 1203 Hex/AcOEt - 4:1 250 F1.3.4 1117 Hex/AcOEt - 3:1 250 F1.3.5 147 Hex/AcOEt - 7:3 250 F1.3.6 120 Hex/AcOEt - 1:1 250 F1.3.7 170 MeOH 250 F1.3.8 428
A análise das frações obtidas por CCDC demonstrou que o componente de interesse se encontra nas frações F1.3.3 e F1.3.4.
3.2.3.1.3.1. Fração F1.3.4.
Esta fração foi submetida a uma nova CLV com 50 g de sílica gel H em uma coluna de 5 cm de diâmetro por 17 cm de comprimento. O procedimento foi idêntico aos realizados anteriormente.
Foram coletadas 8 frações , apresentadas na Tabela 5, juntamente com o esquema de eluição.
Tabela 5: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.3.4.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 49:1 100 F1.3.4.1 4 Hex/AcOEt - 19:1 100 F1.3.4.2 1 Hex/AcOEt – 9:1 100 F1.3.4.3 4 Hex/AcOEt – 17:3 100 F1.3.4.4 78 Hex/AcOEt - 4:1 100 F1.3.4.5 850 Hex/AcOEt - 3:1 100 F1.3.4.6 118 Hex/AcOEt - 7:3 100 F1.3.4.7 16 MeOH 100 F1.3.4.8 4
Após a secagem do solvente, foi observada uma grande quantidade de cristais na fração F1.3.4.5. Esta foi lavada com MeOH, obtendo-se um sólido branco que, por CCDC, constatou-se que se tratava de uma substância pura. Ao todo foram obtidos 600 mg de uma substância que foi codificada como VaD1-4 e submetida a análise por RMN para elucidação da estrutura.
3.2.3.1.4. Fração F1.4.
O estudo detalhado desta fração foi impulsionado inicialmente pela quantidade obtida (4,2 g) e, posteriormente, pela análise por CCDC que mostrou uma composição com substâncias de polaridades diferentes. Uma amostra de 3,5 g desta fração foi, então, submetida a uma CLV com 100 g de sílica gel H em uma coluna de 10 cm de diâmetro por 17 cm de comprimento. Foram coletadas 10 frações, relacionadas na Tabela 6, juntamente com o esquema de eluição com gradiente crescente de polaridade.
Tabela 6: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.4.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 9:1 250 F1.4.1 9 Hex/AcOEt - 4:1 250 F1.4.2 250 Hex/AcOEt – 7:3 250 F1.4.3 770 Hex/AcOEt – 3:2 250 F1.4.4 1305 Hex/AcOEt - 11:9 250 F1.4.5 568 Hex/AcOEt - 1:1 250 F1.4.6 188 Hex/AcOEt - 9:11 250 F1.4.7 117 Hex/AcOEt - 2:3 250 F1.4.8 86 AcOEt 250 F1.4.9 68 MeOH 250 F1.4.10 50
As frações obtidas foram analisadas por CCDC (Hex/AcOEt 3:1+ AcOH 1%), cujo resultado coloca a fração F1.4.4 como a mais promissora por conter grande quantidade de cristais e apresentar boa resolução de seus componentes neste sistema de fase móvel.
3.2.3.1.4.1. Fração F1.4.4.
Inicialmente, os cristais obtidos foram lavados com MeOH/Acetona 1:9. Este procedimento permitiu a obtenção de 300 mg de uma substância pura codificada como VaD1-5 e que foi submetida a análises por RMN para elucidação estrutural.
Uma amostra de 900 mg restantes da fração foi submetida a outra CLV em uma coluna de 5 cm de diâmetro por 17 cm de altura. Foram utilizados 50 g de sílica gel H e foram obtidas 10 frações, relacionadas na Tabela 7,
juntamente com o esquema de eluição utilizando gradiente crescente de polaridade.
Tabela 7: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.4.4.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 9:1 100 F1.4.4.1 3 Hex/AcOEt - 17:3 100 F1.4.4.2 15 Hex/AcOEt – 4:1 100 F1.4.4.3 4 Hex/AcOEt – 3:1 100 F1.4.4.4 225 Hex/AcOEt - 7:3 100 F1.4.4.5 160 Hex/AcOEt - 13:7 100 F1.4.4.6 24 Hex/AcOEt - 3:2 100 F1.4.4.7 14 Hex/AcOEt - 11:9 100 F1.4.4.8 9 Hex/AcOEt - 1:1 100 F1.4.4.9 21 MeOH 100 F1.4.4.10 399
Após secagem das frações e análise por CCDC, verificou-se que nenhuma delas se apresentava pura.
3.2.3.1.4.1.1. Fração F1.4.4.4.
Inicialmente foram feitos vários testes de CCDC para encontrar uma boa fase móvel para a mistura em questão. Determinada a fase móvel adequada (Hex/AcOEt 8:2+ AcOH 1%), foi realizada uma cromatografia em coluna “flash”, utilizando uma coluna de 2 cm de diâmetro contendo uma coluna de 20 cm de sílica gel 60, através de um fluxo de 5 cm/min de fase móvel.
A coluna foi empacotada com a própria fase móvel e foi utilizado nitrogênio de cilindro para imprimir pressão ao solvente na coluna. Foram coletadas 25 frações com 10 mL cada que foram analisadas por CCDC e
agrupadas de acordo com seus perfis cromatográficos. As 8 frações obtidas ao final estão relacionadas na Tabela 8.
Tabela 8: Frações obtidas com a coluna “flash” da fração F1.4.4.4. Frações reunidas (CCDC) Fração obtida Massa (mg)
1 F1.4.4.4.1 6 2-3 F1.4.4.4.2 23 4-5 F1.4.4.4.3 38 6-7 F1.4.4.4.4 25 8-10 F1.4.4.4.5 13 11-14 F1.4.4.4.6 43 15-19 F1.4.4.4.7 13 20-25 F1.4.4.4.8 9
Foi realizada uma nova análise por CCDC com as novas frações, observando-se que a fração F1.4.4.4.7 deveria ser uma única substância, pois apresentou uma única mancha. Esta amostra foi submetida a análises por RMN e foi codificada como VaD1-6.
3.2.3.1.5. Fração F1.5.
Esta fração, que apresentava uma massa de 1,9 g, mostrou ser compostas por várias substâncias diferentes ao ser analisada por CCDC. Foi promovida, então, uma separação inicial por CLV utilizando 100 g de sílica gel 60 H em uma coluna de 10 cm de diâmetro por 17 cm de altura. A sílica foi empacotada com hexano a pressão reduzida. Foram coletadas 10 frações que estão relacionadas na Tabela 9 com o esquema de eluição.
Tabela 9: Esquema de eluição durante a CLV da fração F1.5.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/CHCl3- 9:1 250 F1.5.1 2 Hex/ CHCl3 - 17:3 250 F1.5.2 4 Hex/ CHCl3– 4:1 250 F1.5.3 4 Hex/ CHCl3 – 7:3 250 F1.5.4 201 Hex/ CHCl3 - 3:2 250 F1.5.5 256 Hex/ CHCl3/Isop - 12:7:1 250 F1.5.6 49 Hex/ CHCl3/Isop - 6:3:1 250 F1.5.7 1200 Hex/ CHCl3/Isop - 3:1:1 250 F1.5.8 359 Hex/Isop - 3:2 250 F1.5.9 155 MeOH 250 F1.5.10 321
Após a secagem, cada uma destas frações foram analisadas por CCDC utilizando-se Hex/AcOEt 1:1 + AcOH 1%.
3.2.3.1.5.1. Fração F1.5.4. e F1.5.5.
As análises cromatográficas citadas acima permitiram concluir que as frações F1.5.4 e F1.5.5 continham essencialmente a substância VaD1-5 isolada anteriormente. Desta forma, foram isolados mais 400 mg desta substância.
Devido à alta complexidade das misturas obtidas nas demais fases obtidas com a CLV, os estudos da fração F1.5 foi encerrado.
Todas as etapas e procedimentos durante o isolamento e purificação dos componentes da fase F1 estão resumidos no esquema 1.
Esquema 1: Resumo dos procedimentos utilizados no estudo da fase F1.
3.2.3.2. Fracionamento da fase F2 (diclorometano).
As análises prévias da composição de F2, comparada com a composição de F1 mostraram grande semelhança entre as mesmas. Quando
se observa os componentes principais nos dois casos, pode-se perceber que são VaD1-2, VaD1-4 e VaD1-5 em ambos os casos. Apesar da semelhança cromatográfica observada, o trabalho com a fase em DCM foi iniciado com o intuito de obter algum metabólito diferente.
Com uma fração de 12 g da fase F2, foi realizada uma CLV em uma coluna com placa de vidro sinterizado de 18 cm de diâmetro por 25 cm de altura. Foram utilizados no procedimento 300 g de sílica gel 60 que foi empacotada sob pressão reduzida, utilizando hexano como solvente.
A proporção de sílica em relação à quantidade de amostra foi de 25:1, o que pode ser considerado pouco para uma boa separação cromatográfica. No entanto, o intuito desta coluna inicial foi efetuar uma primeira separação para realizar processos mais refinados em etapas posteriores e, apenas, se estes se fizessem necessários.
A CLV foi realizada com gradiente crescente de polaridade do eluente e foram coletadas 5 frações. As frações coletadas e o esquema de eluição estão descritos na Tabela 10.
Tabela 10: Esquema de eluição durante a CLV da fração F2.
Solvente Utilizado Volume (L) Fração Massa (g)
Hexano 1 F2.1 1,0
Hex/AcOEt - 4:1 1 F2.2 0,50 Hex/AcOEt – 3:2 1 F2.3 4,60 Hex/AcOEt – 2:3 1 F2.4 2,50
MeOH 1 F2.5 1,80
Após a evaporação do solvente, todas as amostras foram analisadas por CCDC, utilizando como fase móvel Hex/AcOEt 3:1 + AcOH 1%.
3.2.3.2.1. Frações F2.2 e F2.3.
As análises por CCDC realizadas utilizando as substâncias isoladas em etapas anteriores, mostraram que estas duas fases eram compostas essencialmente pela substância codificada anteriormente como VaD1-2. Desta forma as duas frações foram reunidas, a nova mistura foi denominada fração F2.6 e submetida a uma CLV para o isolamento deste componente majoritário.
Para a CLV foram utilizados 200 g de sílica gel 60 H em uma coluna de 7 cm de diâmetro por 18 cm de altura. O eluente utilizado foi também com gradiente crescente de polaridade. As sub-frações obtidas e o esquema de eluição estão na Tabela 11.
Tabela 11: Esquema de eluição durante a CLV da fração F2.6. Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (g)
Hex/AcOEt - 4:1 400 F2.6.1 1,1 Hex/AcOEt - 3:2 400 F2.6.2 0,9 Hex/AcOEt – 2:3 400 F2.6.3 0,8 Hex/AcOEt – 1:4 400 F2.6.4 1,0
MeOH 400 F2.6.5 1,2
As análises por CCDC mostraram que a fração F2.6.3 era constituída apenas pela substância anteriormente codificada como VaD1-2 e, com isso, mais 800 mg deste metabólito foram isolados.
3.2.3.2.2. Fração F2.4.
Por apresentar uma massa considerável e um perfil cromatográfico um pouco diferente, esta fração foi escolhida para ser melhor estudada. Inicialmente, foi realizada uma CLV com a massa total desta fração. Utilizou-se
100 mg de sílica gel 60 H e uma coluna de 10 cm de diâmetro por 17 cm de altura. O empacotamento da fase estacionária foi realizado com hexano e sob pressão reduzida. Foram coletadas 7 sub-frações que estão relacionadas na Tabela 12, juntamente com o esquema de eluição utilizado.
Tabela 12: Esquema de eluição durante a CLV da fração F2.4.
Solvente Utilizado Volume (mL) Fração Massa (mg) Hex/AcOEt - 3:2 250 F2.4.1 5 Hex/AcOEt - 1:1 250 F2.4.2 1230 Hex/AcOEt – 2:3 250 F2.4.3 800 Hex/AcOEt – 3:7 250 F2.4.4 200 Hex/AcOEt - 1:4 250 F2.4.5 80 Hex/AcOEt - 1:9 250 F2.4.6 30 AcOEt 250 F2.4.7 5
As frações obtidas foram analisadas por CCDC, permitindo analisar o perfil cromatográfico de cada uma. Foram utilizadas como referências durante a CCDC, as substâncias VaD1-2, VaD1-4 e VaD1-5. Com isso, constatou-se que as frações F2.4.2 e F2.4.3 eram constituídas pelas substâncias VaD1-4 e VaD1-5 em mistura. Desta forma, foi dada continuidade no estudo da fração F2.4.4.
3.2.3.2.2.1. Fração F2.4.4.
Inicialmente, vários testes foram realizados por CCDC com o intuito de encontrar a fase móvel mais adequada para separar os componentes desta fase. Após esta determinação foi realizada uma cromatografia em coluna “flash”, utilizando-se como eluente uma mistura de Hex/AcOEt 7:3 + AcOH 1%
em uma coluna de 2 cm de diâmetro com uma coluna de 20 cm de sílica gel 60 empacotada com o próprio eluente.
Foram coletadas 25 frações de 10 mL cada que, em seguida, foram analisadas por CCDC e reagrupadas em 5 frações de acordo com o resultado dos perfis cromatográficos. O resultado alcançado com este procedimento está organizado na Tabela 13.
Tabela 13: Frações obtidas com a coluna “flash” da fração F2.4.4. Frações reunidas (CCDC) Fração obtida Massa (mg)
1-5 F2.4.4.1 8
6-10 F2.4.4.2 50
11-12 F2.4.4.3 8
13-21 F2.4.4.4 100
22-25 F2.4.4.5 4
Após a evaporação do solvente das frações reunidas, notou-se que na fração F2.4.4.2 haviam cristais e, com isso, resolveu-se lavá-los com MeOH. Com este procedimento foi obtido mais um metabólito, que foi codificado como VaD2-1 (15 mg) e enviado para análises por RMN.
Todos os procedimentos realizados para o isolamento e purificação dos metabólitos da fase F2 estão resumidos no Esquema 2.
Esquema 2: Resumo dos procedimentos utilizados no estudo da fase F2.
3.3. Descrição das reações realizadas.
3.3.1. Acetilação da substância VaD1-4.
HO H O H
O
MM=288,47
2
MM=330,50
Uma amostra de 50 mg (0,1733 mmol) de VaD1-4 foi tratada com
produto obtido foi purificado por cromatografia em coluna “flash” com hexano/AcOEt 9:1 para fornecer 37 mg (0,1119 mmol – 64,6 %) de VaD1-4m, seu derivado acetilado em C-3: ent-pimara-8(14),15-dien-3β-acetoxy.
Dados espectroscópicos do produto: RMN de 1H: δ 4.52 (1H, dd, J=4.2, 11.7 Hz, H-3); 5.14 (1H, s (br), H-14); 5.71 (1H, dd, J=10.3,17.2 Hz, H-15); 4.90 (1H, dd, J=2.0, 17.2 Hz, 16a); 4.95 (1H, dd, J=2.0, 10.3 Hz, 16b); 0.99 (3H,s, H-17); 0.88 (3H, s, H-18); 0.88 (3H, s, H-19); 0.75 (3H, s, H-20); 2.05 (3H, s, H-22 (OCOCH3)); RMN de 13C: δ 38.3 (C-1); 28.7 (C-2); 81.4 (C-3); 37.2 (C-4); 54.6 (C-5); 21.7 (C-6); 35.9 (C-7); 138.3 (C-8); 51.5 (C-9); 38.4 (C-10); 19.5 (C-11); 36.0 (C-12); 39.0 (C-13); 128.7 (C-14); 147.7 (C-15); 113.3 (C-16); 29.8 (C-17); 22.4 (C-18); 17.3 (C-19); 15.2 (C-20); 171.5 (C-21 (COCH3)); 24.5 (C-22 (COCH3)).
3.3.2. Formação do sal de sódio do ácido pimaradienóico.
COOH H
COO+Na -H
MM=302,45 MM=324,43
Uma porção de ácido pimaradienóico (VaD1-2) (50 mg – 0,1653 mmol) foi dissolvida em 5 mL de hexano. A esta mistura foram adicionados 5 mL de
uma solução aquosa de NaOH (0,5 mol.L-1). A mistura total foi agitada por 3
minutos a temperatura ambiente, conforme descrito por Daló e colaboradores.62
A fase aquosa, que apresentava aspecto de emulsão, foi filtrada em sistema com funil de Büchner, lavando-se o sólido retido com água gelada. Este
procedimento forneceu 40 mg (0,1232 mmol – 74,5 %) do sal de sódio do ácido pimaradienóico (VaD1-2m). A identificação foi realizada por métodos espectroscópicos e por comparação com dados da literatura.63,64
Dados espectroscópicos do produto: RMN de 1H: δ 5.11 (1H, s (br), H-14); 5.70 (1H, dd, J=10.2, 16.3 Hz, H-15); 4.91 (1H, dd, J=2.1, 16.3 Hz, H-16a); 4.95 (1H, dd, J=2.1, 10.2 Hz, H-16b); 0.96 (3H, s, H-17); 1.15 (3H, s, H-18); 0.71 (3H, s, H-20); RMN de 13C: δ 42.1 (C-1); 21.3 (C-2); 40.6 (C-3); 46.9 (C-4); 58.7 (C-5); 26.9 (C-6); 38.0 (C-7); 141.2 (C-8); 53.2 (C-9); 42.1 (C-10); 22.3 (C-11); 38.9 (C-12); 41.4 (C-13); 129.4 (C-14); 149.5 (C-15); 114.5 (C-16); 31.4 (C-17); 31.0 (C-18); 185.2 (C-19); 15.7 (C-20).
3.4. Testes de atividade antimicrobiana.
3.4.1. Avaliação da CIM dos diterpenos.
As bactérias utilizadas no presente estudo foram provenientes da “American Type Culture Collection” (ATCC). Os microrganismos utilizados foram: Streptococcus piogenes ATCC 19615, Streptococcus pneumoniae ATCC 6305, Streptococcus sobrinus ATCC 33478, Streptococcus mitis ATCC 49456, Lactobacillus casei ATCC 11578, Streptococcus mutans ATCC 25275,
Streptococcus salivarius ATCC 25975, Streptococcus sanguinis ATCC10556,
da cavidade bucal e: Kocuria rhizophila ATCC 9341, Enterococcus hirae ATCC 10541, Staphylococcus aureus ATCC 9144, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Bacillus subtilis ATCC 6051 e
Bacillus cereus ATCC 14579.
A determinação da CIM para cada microrganismo foi realizada em triplicata, utilizando-se o método de microdiluição em microplacas (NCCLS,
2004). Um miligrama de cada diterpeno foi dissolvido em 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO) e 1.900 µL de caldo Mueller Hinton foi adicionado. A concentração final de DMSO não foi superior a 4% e uma solução nesta porcentagem foi utilizada como controle negativo.
Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, culturas de 24 horas dos microrganismos foram transferidas para tubos contendo 10 mL de solução salina esterilizada. A suspensão foi padronizada comparando-a com o tubo 0,5 da escala de McFarland (0,1 mL de uma solução 1% de BaCl2 em 9,9 mL de
uma solução 1% de H2SO4). Em seguida, foram realizadas diluições sucessivas
em solução salina e por fim no meio Mueller Hinton, de modo a obter um inóculo de 5 x 105 UFC/mL (Unidade Formadora de Colônia/mL).
Em microplacas esterilizadas de 96 orifícios, foi adicionado meio Mueller Hinton, as suspensões dos microrganismos e as soluções dos diterpenos (diferentes concentrações) avaliados, obtendo-se um volume final de 100 µL por orifício. Para cada placa, foram feitos o controle da cultura, o controle de esterilidade do meio Mueller Hinton e controle do solvente (DMSO). Como controle positivo, utilizou-se clorexidina para as bactérias da cavidade bucal e vancomicina para os demais microrganismos.
As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas e, após este período, foram reveladas com 30 µL de uma solução aquosa 0,02% de resazurina.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Identificação e caracterização das substâncias re-isoladas.
Como se trata de re-isolamento dos diterpenos da classe dos pimaranos, a caracterização dos que já foram isolados anteriormente foi realizada apenas por comparação de dados de RMN de 1H e de RMN de 13C {1H} obtidos para cada substância com aqueles previamente publicados na literatura. Vale ressaltar que análises como de Infravermelho são dispensáveis por se tratar de re-isolamento, onde a identificação de grupos funcionais não se aplica como no caso de substâncias totalmente desconhecidas. Pelo mesmo motivo, não foram realizadas análises por experimentos de RMN bidimensionais, como COSY, HSQC e HMBC, nem outros mais específicos. Maiores detalhamentos foram trabalhados apenas durante as análises da substância VaD1-1, que não havia sido isolada em trabalhos anteriores com Viguiera arenaria. 24,60 Neste caso, após a discussão de várias estruturas antes, atribuídas por comparação, a atribuição foi minuciosamente detalhada.
4.1.1. Substância VaD1-2.
Esta substância, uma das mais abundantes obtidas do extrato diclorometânico das raízes de Viguiera arenaria é a codificada como VaD1-2. Isto pode ser observado se for considerada a obtenção desta substância de outras fases além da fase F1.2 relatada no início da parte experimental.
Foram realizados os espectros de RMN de 1H e de RMN de 13C. Os dados obtidos foram comparados com dados da literatura para a caracterização desta substância.
H COOH VaD1-2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 3: Estrutura da substância VaD1-2.
Como se trata de uma substância conhecida e como estamos propondo neste trabalho um re-isolamento, foi considerada suficiente a atribuição dos dados por comparação. A idéia inicial de que deveria se tratar da estrutura proposta acima partiu da observação de três sinais no espectro de RMN de 1H com deslocamentos químicos e integrais característicos de metilas em 0,99; 1,28 e 0,64 ppm. Soma-se a estas informações a presença dos sinais característicos de hidrogênios olefínicos em 5,12; 5,68; 4,91 e 4,95 ppm. Pode-se obPode-servar, ainda, como indicação desta estrutura, a prePode-sença de sinais importantes no espectro de RMN de 13C em 184,5 ppm (carbono da carboxila em C-19) e os quatro sinais entre 112,9 e 147,2 ppm (referentes aos carbonos olefínicos C-8, C-14, C-15 e C-16). Na Tabela 14 estão os dados obtidos para VaD1-2 em comparação com dados previamente publicados na literatura.
Como pode ser observada no conjunto de dados da tabela, a reprodução dos valores é praticamente total para os vários deslocamentos químicos de hidrogênio e de carbono 13. Desta forma, a substância VaD1-2 foi caracterizada como tendo a estrutura da figura 3 acima, ou seja, o ácido ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico.
Outras confirmações, como comparação de tempo de retenção em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), também foram obtidas e confirmaram as informações da estrutura.
Tabela 14: Dados de RMN de 1H e de 13C da substância VaD1-2 (CDCl3; 300
MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). C δC Lit.64 δC H δH Lit.65 δH 1 39,3 39,1 1 --- --- 2 19,3 19,3 2 --- --- 3 38,0 37,8 3 --- --- 4 44,1 43,9 --- --- --- 5 56,2 56,1 5 --- --- 6 24,2 24,3 6α --- --- 6β --- --- 7 35,8 35,7 7 --- 2,34 ddd J(7/6α)=2,3; J(7/6β)=3,7*; J(7α/7β)=3,7 Hz 8 137,9 138,1 --- --- --- 9 50,6 50,7 9 --- --- 10 39,3 39,1 --- --- --- 11 19,6 19,5 11 --- --- 12 36,5 36,6 12 --- --- 13 38,5 38,4 --- --- --- 14 124,0 127,7 14 5,16 s(l) 5,12 s(l) 15 147,2 147,0 15 5,72 sext. 5,68 dd J(15/16a)=16,3; J(15/16b)=10,2 Hz 16 112,9 113,0 16a 4,81-5,00 quint. 4,91 dd J(16a/16b)=2,1; J(16a/15)=16,3 Hz 16b 4,81-5,00 quint. 4,95 dd J(16b/16a)=2,1; J(16b/15)=10,2 Hz 17 29,4 28,7 17 1,00 s 0,99 s 18 29,2 28,5 18 1,27 s 1,28 s 19 184,5 184,6 --- --- --- 20 13,9 13,3 20 0,66 s 0,64 s
4.1.2. Substância VaD1-3.
Em seguida, será detalhada a determinação estrutural da substância VaD1-3, isolada inicialmente da fração F1.2.5. Esta substância foi isolada em quantidade bem menor que a anterior, mas em quantidade suficiente para identificação e os ensaios de atividade antimicrobiana.
H COOH O VaD1-3 1 2 3 5 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 4: Estrutura da substância VaD1-3.
Neste caso, novamente, foi realizada uma atribuição de dados de RMN e uma determinação estrutural por comparação com dados previamente publicados. As indicações iniciais sobre a estrutura foram a grande semelhança do espectro de RMN de 1H deste composto com o VaD1-2, mas com a significativa diferença do deslocamento químico de H-14 que, de 5,12 ppm em VaD1-2, passou a 6,52 neste composto. Além disso, o sinal de RMN de 13C em 200,7 ppm sugere uma carbonila de cetona, completando o conjunto de indicações iniciais sobre a estrutura.
Os dados obtidos de RMN de 1H e RMN de 13C foram devidamente relacionados na Tabela 15 ao lado de dados previamente publicados para esta substância, para facilitar a comparação dos valores.
Tabela 15: Dados de RMN de 1H e de 13C da substância VaD1-3 (CDCl3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). C δC Lit.60 δC H δH Lit.60 δH 1 39,2 39,1 1 --- --- 2 19,2 19,3 2 --- --- 3 37,8 37,8 3 --- --- 4 43,7 43,9 --- --- --- 5 51,4 52,1 5 --- --- 6 --- --- 6α 3,15 dd 3,00 dd J(6α/6β)=18,7; J(6α/5)=13,0 Hz 6β 2,81 dd 2,90 dd J(6β/6α)=18,7; J(6β/5)=5,5 Hz 7 200,7 200,6 --- --- --- 8 136,9 137,1 --- --- --- 9 50,2 50,7 9 --- --- 10 39,2 39,1 --- --- --- 11 19,5 19,5 11 --- --- 12 37,1 36,6 12 --- --- 13 38,5 38,4 --- --- --- 14 142,7 143,0 14 6,59 s(l) 6,52 s(l) 15 145,5 146,0 15 5,69 dd 5,68 dd J(15/16a)=17,3; J(15/16b)=10,7 Hz
16 114,1 113,8 16a 4,76 dd 4,75 dd J(16a/16b)=1,3; J(16a/15)=17,3
Hz 16b 5,02 dd 4,98 dd J(16b/16a)=1,3; J(16b/15)=10,7 Hz 17 28,4 28,7 17 1,13 s 1,10 s 18 --- --- 18 1,25 s 1,28 s 19 --- --- --- --- --- 20 12,8 13,2 20 0,77 s 0,74 s
Uma análise inicial dos dados obtidos nos espectros mostra uma enorme diferença no deslocamento químico de um dos carbonos (C-7 - 200,7 ppm) em relação aos sinais obtidos para a estrutura anterior. O valor obtido sugere uma carbonila e, desta forma, foi facilitado o reconhecimento da estrutura isolada.
Ao comparar os dados, a grande proximidade dos valores obtidos não deixa dúvidas de que a estrutura de VaD1-3 é realmente a proposta na figura 4, o ácido 7-ceto ent-pimara-8(14),15-dien-19-óico.
4.1.3. Substância VaD1-4.
A substância codificada como VaD1-4 é a única isolada da fase F1-3, como descrito anteriormente. Além disso, este composto foi obtido em grande quantidade, tornando-o um dos mais importantes deste estudo como um componente majoritário de Viguiera arenaria e, conseqüentemente, um possível alvo das modificações estruturais.
H HO VaD1-4 1 2 3 5 4 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Figura 5: Estrutura da substância VaD1-4.
Neste caso, assim como nos demais apresentados até o momento, trata-se de uma substância que já havia sido isolada anteriormente e que tem dados
de RMN de 1H e de RMN de 13C também previamente atribuídos.60,66
A análise inicial que se faz desta estrutura de diterpeno passa pela
observação de duas diferenças notáveis no espectro de RMN de 1H: uma delas
é a presença de mais um sinal de metila (o sinal em 0,86 de H-19), que agora são em número de 4 e não 3 como em VaD1-2; outra é o sinal de H-3, que agora aparece destacado em 3,22 ppm por ser vizinho de uma hidroxila.
Tabela 16: Dados de RMN de 1H e de 13C da substância VaD1-4 (CDCl3; 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C; δ em ppm). C δC Lit.66 δC H δH Lit.60 δH 1 37,3 37,2 1 --- --- 2 27,7 27,4 2 --- --- 3 79,2 79,2 3 3,26 dd 3,22 dd J(3β /2α)=11,5; J(3β /2β)=4,3 Hz 4 39,1 39,3 --- --- --- 5 54,3 54,1 5 --- --- 6 22,3 22,0 6α --- --- 6β --- --- 7 35,8 35,9 7 2,32 ddd 2,30 dd J(7α /7β)=14,4; J(7α /6α)=4,5**; J(7α /6β)=2,0** Hz 8 137,9 137,8 --- --- --- 9 51,3 51,3 9 --- --- 10 38,3* 38,2* --- --- --- 11 19,2 19,1 11 --- --- 12 35,8 35,5 12 --- --- 13 38,6* 38,4* --- --- --- 14 128,3 128,0 14 5,14 s(l) 5,17 s(l) 15 147,3 147,5 15 5,72 dd 5,68 dd J(15/16a)=17,3; J(15/16b)=10,2 Hz
16 112,8 112,7 16a 4,90 dd 4,85 dd J(16a/16b)=2,1; J(16a/15)=17,3
Hz 16b 4,95 dd 4,98 dd J(16b/16a)=2,1; J(16b/15)=10,2 Hz 17 29,5 29,2 17 0,98 s 1,00 s 18 28,5 28,6 18 1,00 s 1,05 s 19 15,7 15,5 19 0,81 s 0,86 s 20 14,8 14,9 20 0,73 s 0,72 s
* Podem estar trocados em uma mesma coluna. ** Valores de J podem estar invertidos.
Além disso, o sinal no espectro de RMN de 13C que, para a substância VaD1-2 aparece em 184,6 ppm, não aparece neste espectro, que agora conta
