Hidrogenação Melaço
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 • OBTENÇÃO, CONCENTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO HIDROUSADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA·DE ÃÇÚCAR
O bagaço de cana-de-açúcar, proveniente da Usina Santa Bárbara em Santa Bárbara d'Oeste - SP, foi seco em estufa a 100 ºC, até peso constante, a fim de determinar-se o seu teor de umidade. A hidrólise ácida do bagaço de cana-de-açúcar foi realizada nas instalações da planta piloto do Departamento de Engenharia Química (DEQUI) da FAENQUIL em reator de aço inox AISI 316 (FIGURA 4) com capacidade volumétrica total de 250 litros, equipado com camisa de óleo térmico para aquecimento indireto por resistência elétrica. Operou-se em regime descontínuo sob as seguintes condições: 100 mg de ácido sulfúrico para 1 g de matéria seca, 121 ºC, tempo de reação 1 O minutos, relação sólido-líquido 1: 1 O. O hidrolisado obtido foi primeiramente centrifugado em uma centrífuga industrial para a retirada da massa residual de sólidos.
A fim de aumentar o teor de xilose para 3, 4 e 5 vezes a sua concentração original, o hidrolisado foi concentrado em evaporador à vácuo de 4 litros de capacidade útil, operando a 70 ± 5 ºC. Os hidrolisados foram caracterizados quanto ao pH, à concentração dos açúcares (xilose, glicose e arabinose) e à concentração de ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural.
3.2· TRATAMENTO DO HIDROUSADO
Empregou-se o tratamento proposto por RAMOS (1996), que consiste na alteração do pH inicial para 8,0 pela adição de óxido de cálcio comercial (pó), seguida de aquecimento a 50 ºC e posterior adição de sulfato
1- Reator de Hidrólise 2- Condensador
3-Tanque para os Condensados 4- Centrífuga Semicontínua 5- Sistema de Agitação
de alumínio (solução a 30 %) de modo a obter-se uma concentração de 10 g/1 na solução. O hidrolisado tratado foi deixado em repouso por 1 hora, e, em seguida, seu pH foi ajustado para 5,5 pela adição de óxido de cálcio comercial. A cada alteração de pH o hidrolisado foi filtrado para a remoção do precipitado formado.
O hidrolisado tratado foi autoclavado (SOC. FABBE LTDA) a 111 ºC por 15 min.
3.3· MICRORGANISMO
Utilizou-se a levedura Candida guilliermondii FTI 20037 selecionada por BARBOSA et ai. (1988). As células foram mantidas a 4 ºCem ágar extrato de malte (Merck).
3.4· PREPARO DE MEIO
Os meios de fermentação e de alimentação foram compostos por hidrolisado (fator de concentração 3, 4 ou 5) e suplementados com os seguintes nutrientes (em g/1): sulfato de amônia (5), cloreto de cálcio (0,1) e extrato de farelo de arroz (20). Para os experimentos em meio sintético substituiu-se o hidrolisado por uma solução de xilose de modo a alcançar 48 ou 73 g/1 no meio e por solução de glicose para alcançar 3,5 ou 6,0 g/1 no meio.
As soluções de sulfato de amônia e cloreto de cálcio foram preparadas na concentração de 30 % (p/v) e a solução de farelo de arroz foi preparada adicionando-se 200 g de farelo "ln natura" para 1 1 de água destilada. Estas soluções foram esterilizadas separadamente a 121 ºC por 20 min. O extrato de farelo de arroz foi obtido centrifugando-se a solução de farelo assepticamente a 1070 x g por 15 min (centrífuga Cu-5000 - Damon/lEC
Division). A solução de xilose e glicose foram preparadas na concentração de 1 O % (p/v) e autoclavadas a 111 ºC, por 15 min.
Para os meios compostos de hidrolisado misturou-se os nutrientes, deixou-se o meio em repouso por 1 h e centrifugou-se assepticamente a 1070 x g por 15 min para remoção do precipitado formado. Para os meios sintéticos misturou-se os açúcares e os nutrientes.
3.6· PREPARO DO INÓCULO
O cultivo da levedura foi feito a partir da transferência de uma alçada da cultura estoque recém repicada (7 a 10 dias) para o meio de fermentação contendo hidrolisado tratado (fator de concentração 3) suplementado com nutrientes (item 3.4). Para os experimentos em meio sintético substituiu-se o hidrolisado por uma solução de xilose para alcançar uma concentração de 30 g/1 no meio.
O cultivo do inóculo foi conduzido em frascos Erlenmeyer de 125 mi contendo 50 mi de meio, em agitador rotatório (G25-KC, New Brunswick, Scientific Co) a 200 rpm,
à temperatura de 30 ºC por 24 h (meio
sintético) ou 48 h (hidrolisado). Após este período as células foram recolhidas assepticamente por centrifugação a 2200 x g por 15 min e lavadas com água destilada esterilizada sob nova centrifugação. As células obtidas desta maneira foram utilizadas para preparar a suspensão empregada como inóculo. Em todos os experimentos a concentração celular inicial foi de 1,0 g/1.3.6· CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO
Utilizou-se o fermentador BIOFLO Ili (New Brunswick, Scientific Co) de 51 de capacidade útil, equipado com eletrodos de pH (lngold) e de oxigênio dissolvido (NBS), controles de agitação, de pH e de temperatura. Na
FIGURA 5 encontra-se um esquema do fermentador empregado no presente trabalho.
As condições de fermentação foram: agitação 300 rpm, aeração 0,4 vvm (volume de ar por volume de meio por minuto), correspondendo a um kLa inicial de 21 h-1, temperatura 30 ºC (SILVA, 1994), volume de meio 2,5 1. Para os ensaios em meio sintético empregou-se as mesmas condições, modificando-se apenas a agitação (297 rpm) de forma a obter-se o mesmo kLa inicial. O pH do meio foi monitorado, mas não controlado durante as fermentações.
Os meios de alimentação foram mantidos em um recipiente esterilizado de 4 1 de capacidade. Para a alimentação utilizou-se uma bomba peristáltica (505 S - Watson-Marlow), previamente calibrada para as vazões empregadas. Para o sistema descontínuo alimentado o volume de meio alimentado foi de 2,5 1 (volume final de 5 1).
3.6.1- Fermentações em Hidrolisado Hemicelulósico de Bagaço de Cana- de-Açúcar
3.6.1.1- Cultivo inicial em sistema descontínuo
O cultivo inicial das células foi. realizado em fermentador contendo 2,5 1 do hidrolisado tratado (fator de concentração 3) e suplementado com nutrientes, como descrito no item 3.4.
Avaliou-se a cinética do sistema descontínuo em hidrolisado hemicelulósico de bagaço com o objetivo de obter-se os parâmetros necessários aos cálculos das vazões de alimentação para os cultivas em sistema descontínuo alimentado. As amostras foram coletadas de 6 em 6 h e analisadas quanto ao teor de células, xilose e xilitol.
As velocidades de crescimento celular, de consumo de xilose e de produção de xilitol foram calculadas utilizando-se o método de Le DUY e ZAJIC (1973). As velocidades específicas foram calculadas dividindo-se as respectivas velocidades pela concentração celular.
1
1
1-Agitação
2- Condensador dos gases de saída 3- Coletor de amostras 4- Cuba de vidro 5- Distribuidor de ar 6- Sistema de Aquecimento ou Resfriamento 7- Circulação de água de aquecimento/resfriamento 8-Chicanas
9- Turbina tipo "flat blade"
1 O- Eletrodo de pH 11- Sonda de Oxigênio dissolvido
12- Entrada de meio e inóculo
13- Entrada para meio de alimentação
14- Entrada de ar 5
6
3.6.1.2- Cultivas em sistema descontínuo alimentado com vazão exponencial de alimentação
Realizou-se primeiramente cultivas iniciais, como o descrito no item 3.6.1.1, antes de iniciar-se os experimentos com alimentação.
O meio de alimentação foi composto de hidrolisado (fator de concentração 3, 4 ou 5) tratado e suplementado com nutrientes conforme descrito no item 3.4.
A fim de manter-se a concentração de xilose constante no fermentador durante a fase de enchimento (So = 20, 30 ou 40 g/1) utilizou-se uma vazão exponencial de allmentação, de acordo com o modelo matemático (FACCIOTTl, 1995) a seguir:
F = A exp (µo . t) Equação 1 A= (µo
.Xo
.Vo) I (YXJs)o (Si - So) Equação 2 (Y XJS)o = CPO I (Csoo - Cso) Equação 3Os parâmetros µo,
Xo
e (YXJS)o foram obtidos a partir de um estudo cinético realizado em cultivo descontínuo.3.6.1.3- Cultivo em Sistema Descontínuo Alimentado com Vazão Constante de Alimentação
Realizou-se um cultivo descontínuo alimentado com vazão constante de alimentação com o objetivo de comparar os resultados obtidos com os do sistema com alimentação exponencial. Para isso, iniciou-se um cultivo descontínuo como descrito no item 3.6.1.1. A alimentação iniciou 13 h após o início do cultivo descontínuo. Utilizou-se o hidrolisado concentrado com
fator 5 para compor o meio de alimentação. Baseando-se no estudo cinético (item 3.6.1.1) calculou-se a vazão de alimentação através da equação 4.
F