MATERIAIS E MÉTODOS

Táxons

Foram estudadas 31 espécies (Tabela 1), representando 13 dos 19 gêneros atualmente reconhecidos dentro da família Didelphidae (Gardner, 2008), de forma a caracterizar ao máximo a diversidade morfológica, ecológica e evolutiva existente atualmente no grupo. Seis gêneros não foram incluídos nas análises em razão do número limitado de espécimes disponíveis: Caluromysiops (Sanborn, 1951),

Chacodelphys (Voss, Garner & Jansa, 2004), Cryptonanus (Voss, Lunde & Jansa,

2005), Glironia (Thomas, 1912), Hyladelphys (Voss, Lunde & Simmons, 2001) e

Lestodelphys (Tate, 1934). Para o cálculo das alometrias, descrito numa seção mais

adiante, o número de exemplares por espécie variou conforme sua disponibilidade nos museus e raridade de alguns táxons (Tabela 1).

Banco de dados

Dimorfismo sexual

Os dados referentes ao DST e DSF da vista dorsal do crânio e da vista lateral da mandíbula das 31 espécies de didelfídeos foram retirados de Astúa (2010) (Apêndice 1). Ao serem utilizados como variáveis numéricas, tais dados foram representados por índices: para o DSF, foi usada a média da distância de Procrustes entre os sexos e para o DST, o logaritmo da razão do tamanho do macho sobre o tamanho da fêmea, tamanhos estes baseados na média do tamanho do centróide (Tabela 2). Esses dados também foram tratados como variáveis categóricas (presença e ausência), com base na existência ou não de diferenças significativas no tamanho ou forma do crânio, como reportado em Astúa (2010) (Tabela 2).

Alometrias

Para o cálculo das alometrias entre forma e tamanho do crânio e da mandíbula em didelfídeos foram utilizadas as coordenadas cartesianas de 12 e 19 marcos anatômicos colocados por Astúa (2010), respectivamente em imagens digitalizadas das vistas dorsal do crânio e lateral da mandíbula desses animais, obtidas pelo autor. Essas coordenadas permitiram obter o tamanho do centróide (variável independente) e as variáveis de forma, ou seja, as deformações parciais e os componentes uniformes (variáveis dependentes) de cada crânio e mandíbula (mais detalhes sobre as variáveis de forma podem ser obtidas em Zelditch et al. (2004). A amostra compreendeu imagens do crânio de 1.877 indivíduos adultos (machos e fêmeas) das 31 espécies, e imagens da mandíbula de 1.754 espécimes adultos de ambos os sexos dos mesmos 31 táxons (Apêndice 1).

Foram realizadas regressões multivariadas com o programa TpsRegr (Rohlf, 2009) para estimar as relações alométricas entre tamanho e forma do crânio e da 44

mandíbula, em cada sexo de cada um dos táxons, regredindo as variáveis de forma sobre o tamanho de centróide, para avaliar como a relação entre tamanho e forma se comportava em cada sexo de cada espécie. Depois, as alometrias foram comparadas entre os sexos de cada táxon através de testes de comparação de inclinação de retas no TpsRegr, a fim de verificar se as alometrias entre os sexos de cada espécie diferiam significativamente entre si, baseando-se nas diferenças de intercepto e inclinação das retas de regressão.

O programa utilizado para o cálculo das alometrias (TpsRegr) requer um mínimo de indivíduos por espécie para processar o teste de comparação de retas, cuja exigência é de que o tamanho amostral (n; no caso, machos e fêmeas por espécie) seja maior do que o número de variáveis dependentes (v) utilizadas (n>2v-4). Portanto, isso funcionou como ponte de corte e justificou a não utilização de vários táxons utilizados por Astúa (2010). Além disso, apenas espécies com um mínimo de três indivíduos de cada sexo foram consideradas para fins estatísticos nas análises de regressão, portanto, justificando mais uma vez o porquê de algumas espécies das utilizadas por Astúa (2010) ficarem de fora das análises.

Análises filogenéticas

A filogenia utilizada (Figura 1) foi derivada de Cardillo et al. (2004), com modificações decorrentes dos resultados de Voss & Jansa (2009), com base em dados morfológicos, citogenéticos e moleculares independentes daqueles estudados aqui, já que nenhuma dessas duas possuía todos os táxons que este estudo contempla.

Contrastes filogenéticos independentes

Considerando que os dados aqui utilizados não têm independência estatística devido a relações filogenéticas entre as espécies estudadas, foi necessário conduzir as análises estatísticas dentro de uma perspectiva filogenética (Diniz-Filho, 2000; Harvey & Pagel, 1991; Martins & Hansen, 1997). O método escolhido, para tanto, foram os Contrastes Filogenéticos Independentes (Felsenstein, 1985), que utiliza variáveis contínuas e faz uma correção da falta de independência estatística destes dados, já que eles compartilham uma história evolutiva comum. O método utiliza as diferenças de cada par de espécies que possuem um ancestral comum direto, já que elas representam 45

as mudanças evolutivas que surgiram desde que as linhagens divergiram, resultando nos contrastes independentes. Felsenstein (1985) coloca que, como a expectativa média dos contrastes é zero, qualquer análise de correlação ou regressão entre os contrastes deve ser ajustada passando pela origem (Sokal & Rohlf, 1995). Os contrastes filogenéticos independentes foram calculados com o módulo PDAP:PDTREE (Midford, Garland Jr. & Maddison, 2008) do software Mesquite (Maddison & Maddison, 2011).

A árvore obtida possuía tamanhos de ramos desconhecidos e, por isso, foram avaliados três métodos que estabelecem tamanhos de ramos arbitrários: todos os tamanhos de ramos iguais a um, o método de transformação de tamanho de ramos proposto por Pagel (1992) e o método de estimativa de tamanho de ramos proposto por S. Nee (comunicação pessoal, citada por Purvis (1995), p. 416), todos implementados pelo programa Mesquite. Para cada um dos testes usando contrastes independentes, peso

versus tamanho do centróide, DS (crânio) versus DS (mandíbula) e DS (tamanho) versus DS (forma), foi averiguado o(s) método(s) de estimativa de tamanhos de ramos

arbitrários que não viola(m) as premissas da independência dos valores absolutos dos contrastes independentes e desvios padrões para os dados a serem utilizados, através do teste diagnóstico do PDAP (Diniz-Filho, 2000).

Vários estudos de modelagem documentam que métodos filogenéticos são robustos a filogenias com algumas topologias e tamanhos de ramos inacurados (Díaz- Uriarte & Garland-Jr., 1998; Martins, 1996; Martins & Garland, 1991; Smith & Cheverud, 2002). A filogenia usada aqui contém politomias, que refletem incerteza filogenética em alguns nós e altera os graus de liberdade dos testes (Astúa, 2010). Por isso, foi usada a abordagem de limites de graus de liberdade, proposta por (Purvis & Garland Jr., 1993), que mostram que contrastes independentes podem ser usados mesmo na presença de tais incertezas filogenéticas (Garland & Diaz-Uriarte, 1999). O método envolve calcular os limites superior e inferior para os graus de liberdade que são usados para determinar a significância da regressão (Astúa, 2010). Todas as politomias foram convertidas em uma série de bifurcações de comprimento zero, e assim m–1 contrastes são computados em cada politomia com m ramos. Entretanto, uma vez que não se pode saber se os nós multifurcados representam politomias “cognitivas” (soft politomies; geradas apenas por uma falta de conhecimento na resolução de um nó) ou “reais” (hard

politomies; representam eventos de especiação múltipla), representando uma filogenia

desconhecida ou um evento de especiação simultâneo verdadeiro, os graus de liberdade calculados são delimitados. O limite superior é calculado assumindo que todas as

multifurcações são politomias “reais”, e os graus de liberdade correspondentes são n-2 (onde n é o número de táxons terminais e n-1 é o número de contrastes). O limite inferior é calculado assumindo que todas as politomias são “cognitivas”, e é calculado como p-1 (onde p é o número de nós bifurcados reais). As regressões, então, são repetidas usando os limites superior e inferior para determinar como isso afeta o resultado (Astúa, 2010).

Massa corpórea x tamanho do centróide

Os dados de DST e DSF de crânio e mandíbula foram preferencialmente escolhidos para representar o dimorfismo nos Didelphidae por poderem ser utilizados como variáveis categóricas (presença/ausência) e como variáveis numéricas (valores dos índices), em vez do peso corporal das espécies. Mas, para comprovar o grau de correlação entre os dimorfismos obtidos por meio de medidas cranianas e mandibulares e o peso corporal e, assim, dar maior respaldo quanto à utilização dos índices de DST e DSF nas análises, foram realizadas correlações entre o tamanho do centróide (crânio e mandíbula) dos machos e das fêmeas e a massa corpórea dos machos e das fêmeas, respectivamente. Essas correlações foram feitas levando em conta as relações filogenéticas entre os táxons sendo, portanto, utilizado o método dos contrastes filogenéticos independentes dos caracteres em questão para realização das correlações. As informações de peso corporal médio de machos e fêmeas de cada espécie foram obtidas da literatura através de diversas fontes, por meio de comunicações pessoais e consulta a dados de museu, e expressas como variável contínua (Tabela 3 e Apêndice 2).

Os métodos de estimativas de tamanhos de ramos arbitrários de Pagel (1992) e de Nee foram os que melhor se ajustaram às premissas dos contrastes, com correlações não significativas entre os valores absolutos dos contrastes e seus desvios-padrões. Assim, foi escolhido, de maneira arbitrária, o método de Pagel (1992).

Dimorfismo sexual: crânio x mandíbula e tamanho x forma

Aqui, os caracteres, cujos contrastes serão utilizados para as análises, são: DST (crânio), DST (mandíbula), DSF (crânio) e DSF (mandíbula). Foram utilizadas

realizadas regressões simples e correlações entre os contrastes dos caracteres utilizados para ver como se comporta um caráter em relação ao outro em cada relação bivariada.

Nenhum método de estimativa de tamanhos de ramos arbitrários se ajustou aos valores originais dos dados, violando as premissas dos contrastes, com valores absolutos dos contrastes correlacionando significativamente com seus desvios-padrões. Assim, as variáveis foram logaritmizadas antes da análise e novamente foram testados os métodos de estimativa de tamanhos de ramos arbitrários, cujo melhor resultado foi o de todos os tamanhos de ramos iguais a um, onde as correlações indesejadas desapareceram.

Reconstrução dos estados ancestrais

A reconstrução da história evolutiva dos caracteres estudados (dimorfismo sexual e alometrias) nos Didelphidae foi feita através do mapeamento destes caracteres sobre uma filogenia (Figura 1). Foi utilizado o método de tamanhos de ramos arbitrários iguais a um e as variáveis numéricas de dimorfismo foram utilizadas logaritmizadas, assim como para os contrastes.

Para reconstruir a evolução das alometrias e dimorfismo sexual ao longo da filogenia dos Didelphidae, foram utilizados métodos de parcimônia, para dados qualitativos, e algoritmos de parcimônia nas mudanças quadráticas (squared change

parsimony) (Huey & Bennett, 1987), para dados quantitativos, que permitiram realizar

uma reconstrução generalizada dos estados ancestrais para todos os tipos de caracteres observados aqui. No método de mudanças quadráticas, o objetivo é minimizar a soma de quadrados das mudanças em cada ramo, ao longo de toda a filogenia (Diniz-Filho, 2000). Tais análises filogenéticas foram realizadas com o programa Mesquite.

Após a reconstrução, foi analisada a relação dos caracteres uns com os outros, num contexto evolutivo e observadas as apomorfias e plesiomorfias dos estados dos caracteres estudados. Mais precisamente, foi avaliado: 1) se os dimorfismos (DST e DSF) de crânio evoluíram de maneira semelhante aos de mandíbula; 2) se existe uma congruência evolutiva entre os dois tipos de dimorfismo (DST e DSF); e 3) se os dimorfismos e as alometrias se comportam de forma similar ao longo da filogenia.

Os dimorfismos foram avaliados como variáveis contínuas e discretas, e as alometrias, como variáveis categóricas apenas. Em relação às variáveis numéricas, o DST foi representado, como dito anteriormente, pelo logaritmo da razão tamanho do centróide do macho sobre tamanho do centróide da fêmea, e analisados para o crânio e 48

mandíbula, e o DSF, também avaliado para ambas as estruturas, foi expresso como a média da distância de Procrustes entre os sexos, também já mencionado antes. Em se tratando das variáveis categóricas: DST e DSF, ambos para o crânio e mandíbula, apresentaram como estado de caráter a presença ou ausência dos mesmos; e, para as mesmas estruturas, as relações alométricas entre os machos e fêmeas de cada táxon estudado foram examinadas sob os estados de iguais ou diferentes.

RESULTADOS

Alometrias

Os resultados das alometrias foram os mesmos para crânio e mandíbula. As relações entre tamanho e forma entre os sexos foram as mesmas em 14 das 31 espécies, já que as inclinações e as interseções das retas de regressão, que representam tais relações alométricas em machos e em fêmeas, não diferiram significativamente entre si (Tabela 4). Os demais 17 táxons mostraram diferenças alométricas significativas entre si, onde 13 deles apresentaram as mesmas inclinações nas retas de regressão, porém interceptos diferentes, e quatro deles apresentaram tanto origens como inclinações diferentes nas relações alométricas (Tabela 4).

Contrastes independentes

Massa corpórea x tamanho do centróide

Foram extraídos 30 contrastes para correlacionar massa corpórea de cada um dos sexos e tamanho do centróide do crânio e da mandíbula das espécies, e em cada uma das quatro correlações o modelo de regressão foi ajustado pela origem. Todas as correlações foram significativas (P<0,05) para ambos os limites superior e inferior de graus de liberdade. Os resultados das correlações estão apresentados na tabela 5.

Dimorfismo sexual: crânio x mandíbula e tamanho x forma

Para as correlações de dimorfismo, também foram extraídos 30 contrastes, mais uma vez, ajustando o modelo de regressão pela origem. O DST e o DSF se mostraram significativamente correlacionados (P<0,05), tanto para o crânio como para a mandíbula, assim como aconteceu com as correlações focadas em cada tipo de dimorfismo comparando as duas estruturas. A significância de tais correlações foi confirmada para ambos os limites (superior e inferior) de graus de liberdade. Os resultados das correlações estão apresentados na tabela 6.

Reconstrução dos estados ancestrais

Dados quantitativos: DST e DSF para crânio e mandíbula

Nas reconstruções de DST e DSF, no crânio e na mandíbula, é possível observar que os dimorfismos aumentam e diminuem diversas vezes ao longo das linhagens (Figura 2). Ainda assim, nota-se que os Caluromyinae exibem baixos níveis de DST e níveis médios a baixos de DSF no crânio e na mandíbula, enquanto que os Didelphinae apresentam maiores diferenças entre os sexos. Em relação aos táxons atuais, a maioria das espécies exibe baixo DST, médio DSF no crânio e médio a baixo DSF na mandíbula, sendo poucas as espécies de didelfídeos altamente dimórficas.

As reconstruções comparativas entre crânio e mandíbula para o DST mostram que, para tais estruturas, este caráter aumenta e diminui de maneira proporcionalmente semelhante nas espécies, com exceções sutis (Figura 2). O mesmo aplica-se ao DSF, salvo pelo fato de que há um pouco mais de diferenças do que para o DST. Nas comparações reconstrutivas DST versus DSF, em cada uma das estruturas, observou-se que estes também aumentam e diminuem de forma similar dentro da família Didelphidae, havendo, no entanto maiores diferenças do que as comparações evolutivas realizadas dentro de cada tipo de dimorfismo, entre crânio e mandíbula.

A figura 2 (crânio versus mandíbula (DST) aqui apresentada representa as demais comparações (crânio versus mandíbula (DSF), DST versus DSF (crânio) e DST

versus DSF (mandíbula)), tendo em vista a semelhança entre elas.

Dados qualitativos: DST, DSF e alometrias para crânio e mandíbula

As reconstruções mostram que o DST e o DSF surgiram e desapareceram várias vezes ao longo da filogenia (Figura 3 e 4). Porém, observa-se que a presença e a ausência destes caracteres, tanto no crânio como na mandíbula, são apresentados como estados primitivos igualmente parcimoniosos desta família (Figura 3 e 4). A presença e a ausência de DST estão uniformemente distribuídas entre os táxons recentes, contrastando com os resultados de DSF, que está presente na maioria das espécies atuais (Figura 3 e 4). Em relação ao DST, o clado dos Caluromyinae não exibe DST, enquanto que os Didelphinae (Monodelphini e Didelphini) apresentam ambos os estados, de presença e ausência. O gênero Marmosops e o subgênero Marmosa da filogenia apresentada mostram DST, mas os Thylamys exibem ausência de DST. Contudo, as reconstruções mostram o inverso para o táxon Thylamys quanto ao DSF.

Comparando-se crânio e mandíbula quanto ao DST e ao DSF, nota-se que estes surgiram e desapareceram de maneira exatamente igual nas espécies, sem exceções (Figura 3). Já quando se compara as reconstruções entre os dois tipos de dimorfismo, em relação a cada uma das estruturas, observa-se que eles surgem e desaparecem de maneira similar nas espécies, mas com diferenças maiores em relação às comparações feitas entre as reconstruções entre os dois tipos de estrutura em relação a cada tipo de dimorfismo (Figura 4).

A figura 3 (crânio versus mandíbula (DSF)) aqui apresentada é representativa também da comparação crânio versus mandíbula (DST), uma vez que ambas as comparações mostram o perfeito sincronismo de surgimento e desaparecimento de cada tipo de dimorfismo nas duas estruturas. Da mesma maneira, a figura 4 (DST versus DSF (crânio)) representa também, de certa forma, a comparação DST versus DSF (mandíbula), uma vez que a natureza dos resultados destas comparações é similar.

As alometrias entre os sexos, para crânio e mandíbula, apresentam-se como iguais e diferentes de forma irregular ao longo da filogenia dos Didelphidae (Figura 5). Uma única regularidade de ocorrência foi observada no clado Didelphis, que mostrou trajetórias alométricas diferentes entre os sexos em todas as espécies analisadas.

As reconstruções de alometrias crânio versus mandíbula se mostraram exatamente iguais em todas as linhagens da filogenia dos Didelphidae, sem nenhuma exceção (Figura 5). Já a projeção das reconstruções das alometrias versus as do DST (Figura 6) e do DSF (Figura 7), para ambas as estruturas, exibem várias diferenças para essa família de marsupiais, sendo as maiores delas encontradas quando se compara alometrias com DSF. Geralmente, táxons com alometrias iguais entre os sexos possuem

DST e os que não têm DST apresentam alometrias diferentes entre os sexos, sendo

Caluromys philander, Monodelphis domestica e Thylamys pallidior as exceções para

ambos os casos, e as situações inversas não procedendo. Isso não acontece entre alometrias e DSF, onde alometrias iguais ou diferentes entre os sexos não implicam obrigatoriamente na ocorrência ou ausência de DSF na estrutura considerada.

As figuras 6 (alometria versus DST (crânio)) e 7 (alometria versus DSF (mandíbula)) apresentam resultados semelhantes às comparações alometria versus DSF (crânio) e alometria versus DST (mandíbula), respectivamente, e por isso, as representam e justificam a ausência de esquemas das duas últimas comparações mencionadas.

DISCUSSÃO

O dimorfismo sexual de tamanho e forma de marsupiais didelfídeos não parece apresentar um padrão lógico de comportamento ao longo da história evolutiva dessa família de marsupiais neotropicais. Da mesma forma, alometrias iguais ou diferentes entre os sexos de cada espécie não se apresentam de maneira aparentemente lógica na filogenia dos Didelphidae. Finalmente, o fator alométrico não parece ser o elemento que explica satisfatoriamente o desenvolvimento do caráter dimorfismo em marsupiais didelfídeos, contrariando a hipótese previamente levantada com base em argumentos nesse sentido para outros táxons.

A detecção de correlações significativas entre massa corporal e tamanho do centróide do crânio e da mandíbula em Didelphidae fornece respaldo e justifica a utilização de dados morfométricos no presente estudo. Já as correlações significativas entre os contrastes referentes ao dimorfismo mostram que crânio e mandíbula se mostraram estreitamente relacionados em ambos os tipos de dimorfismo apresentado por esses marsupiais e também que DST e DSF também mantêm uma relação expressiva em cada uma das estruturas estudadas. Esses resultados parecem indicar uma evolução conjunta de tais caracteres (DST e DSF) ao longo da filogenia dessa família.

De fato, essas indicações se confirmaram nos resultados das comparações quantitativas e qualitativas de reconstruções de estados ancestrais realizadas para dimorfismo. Um resultado congruente importante entre estes dois tipos de análises foi a coevolução entre tais caracteres. Neles, é possível observar que os caracteres de

dimorfismo parecem ter evoluído de maneira similar ao longo da história evolutiva dos didelfídeos tanto no crânio como na mandíbula e que cada um dos tipos de dimorfismo respondem de maneira semelhante em ambas essas estruturas. Na investigação qualitativa, crânio e mandíbula demonstraram coevolução perfeita em relação aos dois tipos de dimorfismo, que foi confirmada pela evolução conjunta bastante semelhante para os mesmos dados no crivo quantitativo. A exploração dos dados categóricos também apontou uma evolução conjunta similar entre DST e DSF tanto no crânio como na mandíbula, resultados estes que condizem com os achados da análise numérica, que mostraram evolução similar também para os mesmos caracteres. Ambos os tipos de análise, quantitativa e qualitativa, revelaram também que não há um padrão evolutivo unidirecional, no sentido de aumento ou diminuição e surgimento ou desaparecimento gradual do dimorfismo ao longo da história evolutiva dos Didelphidae. Em geral, não há um padrão claro nem para a maioria dos clados, visto que sua ocorrência ou não independe de afinidades filogenéticas entre a maioria dos táxons. No entanto, a tendência geral das espécies atuais é a de apresentar DSF, mas o mesmo não se pode