4.1 Participantes
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP – Câmpus de Rio Claro (Protocolo Nº 7779/2011 - Anexo 1). As participantes desse estudo foram recrutadas através do banco de dados do laboratório, da divulgação do projeto pela mídia televisiva, rádio, panfletos e anúncios dentro da comunidade universitária e de áreas circunvizinhas à UNESP.
4.2 Critérios de Inclusão
Para serem incluídos no estudo as participantes deveriam ser do sexo feminino, ter idade
≥40 e ≤65 anos, não ser fumante, ter função renal normal (creatinina sérica entre 0,4 e 1,4
mg/dL), não fazer uso de medicamento que interfere com a atividade da enzima conversora de angiotensina (inibidores de ECA), não diabética (NCEP-ATPIII, 2002; ADA, 2013), apresentar Índice de Massa Corpórea (IMC) <30kg/m², evitando-se assim a interferência do diabetes
mellitus e da obesidade. Após a seleção, as voluntárias foram convidadas a comparecerem
novamente ao Laboratório de Fisiologia Cardiovascular e Atividade Física (local do estudo) para a explicação completa do estudo pelo pesquisador responsável. Depois de fornecidas todas as explicações e retiradas todas as dúvidas, as voluntárias assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, resumindo o estudo e informando seus riscos e benefícios.
4.3 Caracterização do Quadro Hipertensivo/Medida da Pressão Arterial
As voluntárias foram classificadas como hipertensas (HT), segundo diagnóstico previamente realizado pelo médico ou quando os valores médios da pressão arterial sistólica
(PAS) ≥140 mmHg e/ou pressão arterial diastólica (PAD) ≥90 mmHg.
Nos dias determinados para aferição da pressão arterial, as voluntárias foram instruídas para que não realizassem exercício físico. Pela manhã, a pressão arterial das voluntárias foi avaliada por método auscultatório, após 15 minutos de repouso na posição sentada utilizando um esfigmomanômetro aneróide (Tycos, Raleigh, NC, USA). Estas medições foram realizadas pelo
mesmo experiente avaliador durante três dias, de acordo com a VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial (2010).
4.4 Grupos Experimentais
Após algumas desistências ou mesmo exclusão por não se encaixarem nos critérios do estudo, o grupo experimental foi constituído por 96 voluntárias, sendo estas divididas entre normotensas (n=67) e hipertensas (n=29) conforme figura abaixo:
Figura 4. Recrutamento e divisão das voluntárias selecionadas divididas em normotensas e hipertensas. Banco de Dados (n=260) Entrevista (n=237) Total (n=497) Critérios de Exclusão (n=247) Candidatas ao Estudo (n=250) Total de Voluntárias (n=96) NT (n=67) Não Aceitaram (n=154) HT (n=29)
4.5 Identificação da Pós-menopausa
A identificação da pós-menopausa, foi feita através de auto-relato com ausência de menstruação por 12 meses e medida pelo folículo estimulante (FSH > 40mIU/mL).
Figura 5. Identificação do período do climatério das voluntárias normotensas e hipertensas: perimenopausa e pós-menopausa.
4.6 Parâmetros Antropométricos
O peso corporal foi mensurado em balança digital (Toledo® 2096 PP) com o indivíduo vestindo o mínimo possível de roupa e descalço. A estatura foi mensurada com estadiômetro da própria balança, isenta de rodapés ou irregularidades. A voluntária permaneceu ereta, e com os olhos fixos num eixo horizontal paralelo ao chão. O índice de massa corporal (IMC) foi determinado pela razão peso corporal/ altura2.
4.7 Coleta Sanguínea
Após jejum noturno de aproximadamente 12 horas, as amostras de sangue foram obtidas de veia antecubital (15 ml), através da técnica asséptica com material de punção venosa, descartável e apropriado para a população estudada. As coletas foram realizadas em um Laboratório particular de Análises Clínicas por profissionais altamente experientes e habilitados. As amostras de sangue obtidas foram depositadas em tubos específicos, contendo EDTA (obtenção do plasma), inibidores de protease (plasma para análise do sistema renina- angiotensina) e tubos secos com gel separador (obtenção soro).
NT HT 0 50 100 150 200 H o rm ôni o Fol íc ul o E st im u la nt e (m IU /m L)
4.8 PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
Perfil Lipídico e Glicemia de jejum 4.8.1
Amostras de soro foram utilizadas para a determinação dos níveis de colesterol total (CT), triglicerídeos (TG), LDL Colesterol (LDL–C), HDL Colesterol (HDL–C) e glicemia de jejum pelo método enzimático-colorimétrico (Trinder). As análises foram realizadas em um Laboratório de Análises Clínicas.
Atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) 4.8.2
A atividade da ECA foi determinada em amostras de soro usando (Abz-FRK(Dnp)P-OH derivados como substratos por medição contínua da fluorescência, conforme descrito por Alves e colaboradores (2005). O sangue obtido foi centrifugado por 10 min 3000 rpm a 4oC, para obtenção do soro e estocados a -80ºC. Foram incubados 5 Pl de soro com 195 Pl de tampão de incubação com o substrato fluorescente (Abz-FRK(Dnp)P-OH (Abz = ortho-aminobenzol; Dnp = dinitrophenil) 15PM em tampão Tris-HCl 0.1M contendo NaCl 50mM e 10 PM ZnCl2, pH
7.0), em um volume final de 200 Pl. A atividade da enzima foi determinada de forma contínua em fluorímetro (Oem =420nm e Oex=320nm), por 180 minutos. O tempo da leitura e a quantidade
de proteína utilizados na reação foram escolhidos de modo a assegurar a linearidade da formação do produto. Todas as amostras foram ensaiadas em duplicata, sendo que a fluorescência intrínseca da amostra foi corrigida através de brancos onde a reação era inibida por captopril 0,5
μM. A atividade da ECA foi expressa em uF/min/ml.
Concentração de Angiotensina I (Ang I), Angiotensina II (Ang II) e 4.8.3
Angiotensina-(1-7) [(Ang-(1-7)]
As determinações da Ang I, Ang II e Ang-(1-7) plasmáticas foram realizadas de acordo com Barauna e colaboradores (2008). O sangue foi rapidamente coletado em tubos refrigerados contendo um coquetel de inibidores de protease [p-hidroximercurio-benzoato (pOHHbBz – 1mM), o-fenantrolina (9,1mM), PMSF (1mM), pepstatina A (0,5 mM) e EDTA (0,2 M) para impedir a produção in vitro e a degradação dos peptídeos [Ang II e Ang-(1-7)]. Após centrifugação a 4ºC por 20 min a 3000 rpm, o sobrenadante coletado (plasma) foi estocado a - 80ºC para posterior extração do peptídeo e análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC).
Nitrato/Nitrito (NOx-) 4.8.4
Amostras de soro foram utilizadas para determinação da produção endógena de NO por meio da quantificação dos ânions nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-), produtos terminais da oxidação
do NO.
O soro foi ultrafiltrado (12000g) por 80 minutos utilizando-se microfiltros (Microcon Centrifugal Filter Units, 10 kDa; Millipore, Bedford, MA, USA), e o sobrenadante estocado a - 80°C. A concentração do nitrito/nitrato plasmático foi determinada por método colorimétrico utilizando kit comercial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) seguindo as instruções do fabricante. As absorbâncias dos picos foram determinadas a 540 nm.
Hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH) 4.8.5
A dosagem de LH/FSH foram realizadas pelo método de ELISA imunométrico do tipo sanduíche - Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA. Cada placa contem streptavidina. As amostras os anticorpos e o anticorpo marcado HRP são incubados conjuntamente. O anticorpo irá se ligar em ambas streptavidina na placa e no LH ou FSH da amostra, e o anticorpo de detecção irá se ligar a outro antígeno na molécula de LH/FSH. Todo o complexo é imobilizado na placa pela interação entre o anticorpo e a streptavidina. Depois da eliminação e lavagem do excesso do restante do anticorpo e do material não ligado ao complexo, à concentração de LH/FSH é determinada pela medida da atividade enzimática da HRP adicionando o substrato tetrametilbenzidina (TMB). Depois do tempo determinado a reação é interrompida com um ácido formando um produto de cor amarelada que pode ser medido a 450nm. A intensidade da coloração é diretamente proporcional à quantidade de ligações do anticorpo HRP e LH/FSH, que está relacionado à quantidade proporcional de LH/FSH na amostra. As amostras estão expressas em mIU/mL.
Análise das enzimas antioxidantes e concentrações de MDA 4.8.6
Amostras de plasma e soro foram utilizadas para medir as enzimas antioxidantes (Superóxido Dismutase – SOD e Catalase) e concentrações de malondíaldeido (MDA), respectivamente. Para determinação da atividade da SOD plasmática foi utilizado o kit comercial Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA. Esse kit utiliza o sal tetrazolium para detecção dos radicais superóxido gerados pela xantina oxidase e hipoxantina. Uma unidade de SOD foi definida como a quantidade de enzima necessária para exibir 50% de dismutação do radical
superóxido. O kit permite a medida da atividade plasmática dos três tipos de SOD (Cu/Zn, Mn, e FeSOD). A leitura foi realizada a 450 nm absorbância, e os resultados são expressos em U/mL. Catalase (CAT): Para determinação da atividade da CAT plasmática foi utilizado o kit comercial Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA. O kit utiliza da função peroxidática da catalase para determinação da atividade da enzima. O método é baseado na reação da enzima com metanol na presença de uma concentração ótima de peróxido de hidrogênio (H2O2). O
Formaldeído produzido é medido por método colorimétrico com 4-amino-3hidrazino-5- mercapto-1,2,4triazol (Purpald) como o cromógeno. O Purpald forma especificamente hererociclo biociclina com aldeídos que na oxidação muda a coloração para cor roxa. O kit é usado para medir a atividade da catalase plasmática em nmol/min/mL a 540 nm de absorbância. Malondíaldeido (MDA): Para determinação do MDA a medição das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) é um método bem estabelecido para detecção e monitoramento da peroxidação lipídica e foi realizado utilizando o kit comercial colorimétrico - Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA. O malondíaldeido (MDA) é um dos produtos derivados da oxidação dos ácidos graxos insaturados e utilizado como método para avaliação da peroxidação lipídica. O MDA em altas temperaturas e em condições ácidas se liga ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), formando MDA-TBARS e foram medidos a 532 nm, os resultados são expressos em μM.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como médiarerro padrão da média (EPM). Para avaliação dos resultados foi aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov para determinação da normalidade do conjunto de dados. Posteriormente, foi utilizado o teste t de Student para amostras não pareadas e o teste de qui-quadrado (χ2) para avaliar a associação entre variáveis independentes. O software utilizado foi o SPSS 13.0 e o GraphPad Prisma versão 4. O nível de significância adotado foi p<0,05.