ILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
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Rodrigo Degli EspostiATIVIDADE DA ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA E OS NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PEPTÍDEOS DO SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA
(ANG I, ANG II E ANG-(1-7)) EM MULHERES NORMOTENSAS E HIPERTENSAS NO CLIMATÉRIO
Rio Claro - SP 2013
Rodrigo Degli Esposti
ATIVIDADE DA ENZIMA CONVERSORA DE ANGIOTENSINA E OS NÍVEIS PLASMÁTICOS DE PEPTÍDEOS DO SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA (ANG I,
ANG II E ANG-(1-7)) EM MULHERES NORMOTENSAS E HIPERTENSAS NO CLIMATÉRIO
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Campus de Rio Claro, como requisito para obtenção do grau de Mestre em Ciências da Motricidade (Biodinâmica da Motricidade Humana).
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por me conceder força e saúde para finalizar este trabalho e
atingir meu objetivo.
Agradeço aos meus pais e irmão pela ajuda não só financeira como também
pela compreensão, alegria e carinho.
Agradeço aos “velhos” e novos amigos por todos os momentos vividos ao longo
desse período.
Agradeço aos companheiros e amigos do laboratório e da pós-graduação, aqui
um agradecimento em especial ao Me. Carlos Henrique Grossi Sponton, o qual
compartilhou comigo sua sabedoria e colaborou na realização desse projeto. Aos
alunos Chadi Anaruma Pellegrini, Aline Pincerato e Maycon Ferreira pela ajuda na
coleta dos dados.
Um agradecimento em especial à Pamella Araújo Malagrino a qual contribui nos
meus primeiros passos em direção ao mestrado.
Agradeço ao Dr. Altair A. Marino por abrir as portas de seu Laboratório de
Análises Clínicas e permitir que as coletas fossem realizadas no mesmo.
Agradeço ao apoio e suporte da profª. Drª. Edilamar Menezes de Oliveira e da
Profª. Drª. Dulce Elena Casarini e de seus respectivos alunos, Me. Tiago Fernandes e
Dra. Fernanda Barrinha Fernandes. Em especial, a profª. Drª. Edilamar Menezes de
Oliveira por ter propiciado as análises em seu Laboratório e por intermediar as análises
no Laboratório da Profª. Drª. Dulce Elena Casarini.
“Nossa maior fraqueza é a desistência. O caminho mais certeiro
para o sucesso é sempre tentar apenas uma vez mais”
RESUMO
O objetivo do estudo foi analisar o Sistema Renina-Angiotensina circulante, concentrações plasmáticas de Nitrito/Nitrato e biomarcadores do estresse oxidativo em mulheres normotensas e hipertensas no climatério.
Noventa e seis voluntárias participaram do estudo, sendo sessenta e sete voluntárias normotensas (NT) e vinte e nove voluntárias hipertensas (HT) com idade de 52,07±0,88 e 55,48±1,51 anos, respectivamente. Parâmetros antropométricos (peso corporal, índice de massa corporal - IMC) cardiovasculares (pressão arterial sistólica – PAS, pressão arterial diastólica – PAD) e bioquímicos (perfil lipídico, glicemia, atividade da enzima conversora de angiotensina – Ativ. ECA, concentrações de Angiotensina I - Ang I, Angiotensina II - Ang II e Angiotensina-(1-7) - (Ang-(1-7), concentrações de nitrito/nitrato (NOx-), atividade da SOD e catalase e concentrações séricas de MDA) foram analisados. Não foram observadas diferenças entre os parâmetros antropométricos, hormonais, perfil lipídico e biomarcadores do estresse oxidativo entre as voluntárias NT e HT. Por outro lado, foram observadas diferenças significativas na PAS, PAD, glicemia, os peptídeos do SRA [Ang I, Ang II e Ang-(1-7)] e as concentrações de NOx-. Quando divididas em perimenopausa e pós-menopausa, observamos diferença estatisticamente significativa, com redução da atividade da SOD, aumento das concentrações de NOx- e do SRA (ativ. ECA e Ang II) para as mulheres hipertensas após a menopausa enquanto que o mesmo não ocorreu nas mulheres normotensas. Portanto, mulheres HT após a menopausa apresentam elevação da atividade do SRA medidos pela atividade da ECA e Ang II. Esses dados mostram que a elevação do sistema renina-angiotensina é potencializada no período após a menopausa em mulheres com a presença de hipertensão arterial.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Principais fatores de risco que levam à morte (WHO, 2008). ... 15 Figura 2. Prevalência da Hipertensão Arterial Sistêmica, segundo o American Heart
Association, 2010. ... 16 Figura 3. Esquema do Sistema Renina-Angiotensina (Adaptado de Santos et al., 2008). ... 21 Figura 4. Recrutamento e divisão das voluntárias selecionadas divididas em normotensas e hipertensas... 28 Figura 5. Identificação do período do climatério das voluntárias normotensas e hipertensas: perimenopausa e pós-menopausa. ... 29 Figura 6. Valores de pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e
concentração de nitrito/nitrato (NOx-) das voluntárias normotensas (n=67) e hipertensas (n=29). Os valores representam as médias±erro padrão da média. †p<0.05; *p<0.01. ... 34 Figura 7. Valores individuais da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e concentração de nitrito/nitrato (NOx-) das voluntárias normotensas (n=67) e hipertensas (n=29). ... 35 Figura 8. Dados dos medicamentos das voluntárias hipertensas. ... 35 Figura 9. Valores da glicemia de jejum e perfil lipídico das voluntárias normotensas (n=67) e hipertensas (n=29). Os valores representam as médias±erro padrão da média. †p<0.05. ... 37 Figura 10. Valores individuais da glicemia e colesterol total e frações das voluntárias
normotensas (n=67) e hipertensas (n=29). ... 38 Figura 11. Atividade da ECA circulante, concentrações plasmáticas de Angiotensina I,
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AHA: American Heart Association
Ang I: Angiotensina I Ang II: Angiotensina II Ang-(1-7): Angiotensina-(1-7)
Bloq. Recep. AT1: Bloqueador do receptor AT1 Ca2+: Cálcio
CAT: Catalase CT: Colesterol Total Cu/Zn: Cobre e Zinco
DCs: Doenças Cardiovasculares
ECA: Enzima Conversora de Angiotensina ECA2: Enzima Conversora de Angiotensina 2 eNOS: Óxido Nítrico Sintase Endotelial EPM: Erro Padrão da Média
EROs: Espécies Reativas de Oxigênio GCs: Guanilato Ciclase Solúvel
GMPc: Monofosfato Cíclico de Guanosina GSH-Px: glutationa peroxidade
H2O2: Peróxido de Hidrogênio HAS: Hipertensão Arterial Sistêmica HDL-C: HDL Colesterol
HT: Hipertensas
IMC: Índice de Massa Corpórea IP3: Inositol-1,4,5-Trifosfato K+: Potássio
LDL-C: LDL Colesterol
PGI2: Prostaciclina
Mn: Manganês
NEP: Endopeptidases Neutras NO: Óxido Nitríco
NOx-: Nitrito/Nitrato NT: Normotensas O2-: ânion superóxido .
PAD: Pressão Arterial Diastólica PAS: Pressão Arterial Sistólica PEP: Prolil Endopeptidases SOD: Superóxido Dismutase
SHR: Espontaneamente Hipertensos SRA: Sistema Renina-Angiotensina TG: Triglicerídeos
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 10
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 12
2.1. Menopausa e Incidência de Doenças Cardiovasculares ... 12
2.2. Hipertensão Arterial Sistêmica(HAS) ... 14
2.3. Óxido Nítrico (NO) ... 17
2.4. Estado Redox e Sistema Antioxidante ... 18
2.5. Sistema Renina-Angiotensina ... 20
2.6. Sistema Renina-Angiotensina em modelos experimentais ... 22
2.7. Sistema Renina-Angiotensina em seres humanos ... 24
3. OBJETIVO GERAL ... 26
3.1. Objetivos Específicos... 26
4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 27
4.1 Participantes... 27
4.2 Critérios de Inclusão ... 27
4.3 Caracterização do Quadro Hipertensivo/Medida da Pressão Arterial ... 27
4.4 Grupos Experimentais ... 28
4.5 Identificação da Pós-menopausa ... 29
4.6 Parâmetros Antropométricos ... 29
4.7 Coleta Sanguínea ... 29
4.8 PARÂMETROS BIOQUÍMICOS ... 30
Perfil Lipídico e Glicemia de jejum ... 30
4.8.1 Atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) ... 30
4.8.2 Concentração de Angiotensina I (Ang I), Angiotensina II (Ang II) e 4.8.3 Angiotensina-(1-7) [(Ang-(1-7)] ... 30
Nitrato/Nitrito (NOx-) ... 31
4.8.4 Hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH) ... 31
4.8.5 Análise das enzimas antioxidantes e concentrações de MDA ... 31
4.8.6 4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 32
5. RESULTADOS... 32
6. SUMÁRIO DOS RESULTADOS ... 60
7. DISCUSSÃO ... 62
8. CONCLUSÕES ... 66
1. INTRODUÇÃO
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é uma síndrome multicausal, multifatorial e poligênica caracterizada pela presença de níveis pressóricos elevados e normalmente associada a distúrbios metabólicos, hormonais e hipertrofia cardíaca e vascular (NEGRÃO & BARRETO, 2006). Sua elevação representa um fator de risco independente, linear e contínuo para a doença cardiovascular (LAWES et al., 2008). Até os 44 anos de idade, um maior percentual de homens tem HAS, dos 45 aos 54 anos de idade período em que se encontram na menopausa, as mulheres apresentam valores similares aos dos homens, e após esse período o predomínio de HAS no sexo feminino é significativamente superior (AMERICAN HEART ASSOCIATION – AHA, 2010). Ainda, não se sabe qual ou quais são os mecanismos para a maior incidência de HAS após a menopausa.
Evidências mostram uma possível ação protetora exercida pelos hormônios sexuais femininos, sobretudo os estrogênios que apresentam queda abrupta no período da menopausa (GENAZZANI, 2001; NISKANEN et al, 2002). Além do estrogênio, uma variedade de fatores parece contribuir para elevação da pressão arterial (PA) na menopausa, entre eles, o aumento do estresse oxidativo, maior atividade do sistema renina-angiotensina (SRA), elevação nos níveis
plasmáticos de testosterona, alterações no perfil lipídico e o aumento no ganho de peso (FURTADO & MARTIN, 1995; REIS et al., 2000; FORJAZ et al., 2007; PHILLIPS, JING & HEYMSFIELD, 2008).
arritmogênico e inibição da proliferação contrátil (DONOGHUE et al., 2000; RAIZADA & FERREIRA, 2007). Acredita-se que essa via atue de forma contra-regulatória à via clássica.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Menopausa e Incidência de Doenças Cardiovasculares
A incidência de doenças cardiovasculares (DCV) aumenta dramaticamente com o envelhecimento populacional e tem se constituído na maior causa de morbi-mortalidade em todo mundo, especialmente acima dos 50 anos de idade (WHO, 2008).
O climatério compreende o período de transição fisiológica da fase reprodutiva para não reprodutiva na mulher. Inserida no climatério, temos a menopausa sendo definida como a falência total da função ovariana em produzir hormônios esteróides e ovulação, acarretando em amenorréia permanente. Após 1 ano de amenorréia, temos dentro do climatério a fase chamada pós-menopausa. No entanto, a falha nos ciclos menstruais começa por volta dos 40 anos, e maioria das mulheres experimenta a completa perda da produção de estrogênio por volta dos 50 anos de idade (FREITAS et al., 2002; AACE, 2006). Apesar das mulheres compartilharem com os homens os diversos fatores de risco para o desenvolvimento das DCV como: obesidade, diabetes, hipertensão arterial, dislipidemia, dentre outros, estudos epidemiológicos mostram que as mesmas, antes da menopausa, apresentam menor risco cardiovascular quando comparadas aos
homens de mesma idade (RECKELHOFF, 2001; VAN EICKELS et al., 2005). Entretanto, após o período da menopausa há um aumento significativo na incidência de hipertensão arterial, sendo seus valores similares aos dos homens para este período (AHA, 2010). Os mecanismos celulares e/ou moleculares pelos quais ocorre maior incidência de hipertensão arterial em mulheres ainda não são claros. Este fato parece estar relacionado a uma possível ação protetora exercida pelos hormônios sexuais femininos, sobretudo os estrogênios que apresentam queda abrupta no
período da menopausa (GENAZZANI, 2001; NISKANEN et al, 2002). Além do estrogênio, uma variedade de fatores parece contribuir para elevação da pressão arterial (PA) na menopausa, entre eles, o aumento do estresse oxidativo, maior atividade do sistema renina-angiotensina (SRA), elevação nos níveis plasmáticos de testosterona, alterações no perfil lipídico e o aumento no
cardiovascular através da modulação da função endotelial (WASSERTHEIL-SMOLLER et al., 2000), ao elevar a produção de óxido nítrico (NO) via ativação da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (TOSTES et al., 2003; FORJAZ et al., 2007), através de receptores específicos no endotélio vascular, e de prostaciclina (PGI2) que são importantes substâncias
vasodilatadoras dependentes de endotélio, assim também modula a síntese de endotelina que é um potente vasoconstritor (FREITAS et al., 2002). Além disso, pode promover proteção cardiovascular através do controle do SRA, incluindo redução da expressão dos receptores AT1 em vasos e rins e reduzir a atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA), (HARRISON-BERNARD, SCHULMAN & RAIJ, 2003). Sendo assim, reduções nas
concentrações de estrogênio podem levar a disfunção endotelial e desregulação do SRA que acarreta em elevação da PA através do aumento da resistência vascular periférica. No entanto, a gênese da hipertensão arterial é mais complexa do que àquela observada em modelo experimental de menopausa (animais de laboratório) citada nos estudos cima. Além disso, a reposição hormonal em mulheres após a menopausa mostrou-se de baixa eficácia na redução dos valores de PA, como também na prevenção de eventos cardiovasculares, confirmando que os mecanismos envolvidos no controle da PA em mulheres após a menopausa são diferentes daqueles encontrados em modelos experimentais (ESHRE Capri Workshop Group, 2006).
Além de estimular a produção de NO, a atividade física promove também elevação da expressão de enzimas antioxidantes, como a SOD-1, aumentando a biodisponibilidade do NO para as células musculares lisas, promovendo melhor relaxamento da musculatura lisa vascular, e, consequentemente, reduzindo os valores de pressão arterial (DE MORAES et al., 2008).
Com relação ao SRA e o exercício físico, os dados são ainda controversos. Estudo realizado com cardiopatas, demonstrou que o treinamento físico aeróbio por 3 meses foi capaz de reduzir a atividade da renina plasmática, porém não houveram alterações nas concentrações de Ang I e II. Sendo que a redução da atividade da renina plasmática pode ser explicada pela redução do tônus simpático após o treinamento (VANHESS et al.,1984). Em contrapartida, Nelson e colaboradores (1986) não observaram qualquer alteração da atividade da renina plasmática em pessoas com hipertensão frente ao treinamento físico aeróbio.
2.2. Hipertensão Arterial Sistêmica(HAS)
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é uma doença crônica e degenerativa de etiologia multicausal, multifatorial e poligênica, caracterizada pela presença de níveis pressóricos elevados e normalmente associada a distúrbios metabólicos, hormonais e hipertrofia cardíaca e vascular. Sendo, considerada um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento de DCV (NEGRÃO & BARRETO, 2006; KRIEGER & PEREIRA, 2006).
Segundo a VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial (2010) a classificação da pressão arterial para indivíduos maiores de 18 anos é dada conforme a tabela que segue abaixo (Tabela 1).
Estima-se que cerca de 1 bilhão de indivíduos apresentem HAS em todo mundo, sendo esta patologia responsável por aproximadamente 7,5 milhões de óbitos por ano, representando 13% do total de óbitos no mundo (CHOBANIAN et al., 2003; WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2008). Ainda, de acordo com a OMS (2004) o aumento da pressão arterial é
o principal fator de risco para o qual se atribui essas mortes (Figura 1).
Figura 1. Principais fatores de risco que levam à morte (WHO, 2008).
Segundo, dados do AHA em 2010, 74 milhões de pessoas nos EUA são hipertensas, sendo que uma em cada três pessoas adultas apresentam esta patologia. No Brasil, inquéritos populacionais realizados nos últimos vinte anos apontaram uma prevalência de HAS de 30%. Sendo esta, responsável por 54% das mortes por acidente vascular cerebral e 47% dos casos de infarto (VI DIRETRIZES BRASILEIRAS DE HIPERTENSÃO ARTERIAL, 2010). Ainda,
segundo estudo realizado no estado de São Paulo pelo nosso Laboratório, 25.7% (n=369) da população estudada reportou HAS. Sendo que, entre 50 a 64 anos 38.9% apresentavam HAS e acima dos 65 anos de idade 53.4% da população estudada (FERNANDES & ZANESCO, 2010).
Existe relação direta e linear da pressão arterial com a idade e sua elevação representa um fator de risco independente, linear e contínuo para as DCV (LAWES et al., 2008). Sendo, a
ARTERIAL; AHA, 2010). Até os 44 anos de idade, um maior percentual de homens tem HAS, dos 45 aos 54 anos de idade período em que se encontram na menopausa, as mulheres apresentam valores similares aos dos homens, e após esse período o predomínio de HAS no sexo feminino é significativamente superior (AHA, 2010). Assim, a incidência de HAS aumenta tanto
com a idade quanto com o início da fase pós-menopausa (Figura 2).
Figura 2. Prevalência da Hipertensão Arterial Sistêmica, segundo o American Heart Association, 2010.
O excesso do consumo de sódio é um fator muito importante na incidência e prevalência
da HAS. Mas, assim como em qualquer DCV, ela tem como seus geradores o sedentarismo, o fumo, o consumo elevado de álcool, a obesidade, a dislipidemia, o diabetes mellitus e a genética (BLOCH et al., 2006).
A hipertensão arterial se origina da falta de controle da pressão arterial (PA) pelo organismo, que se dá pela seguinte equação:
PA = Débito cardíaco x Resistência vascular periférica.
O controle da PA é feito por dois principais mecanismos: neurais e humorais. O mecanismo neural é feito pelo sistema nervoso autônomo (que age através dos barorreceptores e quimiorreceptores) composto pelo sistema: simpático/parassimpático, que age aumentando/diminuindo a frequência cardíaca bem como atuando na resistência vascular periférica. O controle humoral é feito por várias substâncias (vasoconstritoras ou vasodilatadoras) que interferem diretamente na resistência vascular periférica. O aumento das substâncias vasodilatadoras como o óxido nítrico (NO) pode contribuir para uma melhora da HAS. Por outro lado, o SRA desempenha fundamental importância devido à sua ação vasoconstritora, através principalmente da angiotensina II (Ang II).
2.3. Óxido Nítrico (NO)
As células endoteliais desempenham relevante papel no controle do tônus cardiovascular, regulando a vasomotricidade, a permeabilidade vascular, o metabolismo de substâncias endógenas/exógenas e a atividade plaquetária e leucocitária (ZANESCO & ANTUNES, 2005).
A biossíntese do NO compreende uma das funções mais importantes do metabolismo da L-arginina no organismo. O NO é formado a partir do nitrogênio terminal da guanidina presente na L-arginina, sob a ação catalítica da enzima sintase do óxido nítrico (eNOS), gerando concentrações equimolares de L-citrulina e NO (MONCADA, PALMER & HIGGS, 1991). Uma vez liberado, o NO difunde-se rapidamente da célula geradora (células endoteliais) para a célula alvo (musculatura lisa do vaso sanguíneo), onde interage com o grupamento heme da guanilato ciclase solúvel (GCs) estimulando sua atividade catalítica, levando à formação de GMPc, que por sua vez, diminui os níveis intracelular de cálcio (Ca2+), reduzindo o tônus vascular. Os mecanismos pelos quais a via NO/GMPc induz a vasodilatação incluem inibição da geração do inositol-1,4,5-trifosfato (IP3), aumento do sequestro de Ca2+ citosólico, desfosforilação da cadeia
leve de miosina, inibição do influxo de Ca2+, ativação de proteína quinase, estimulação da Ca2+ ATPase de membrana e abertura de canais de K+ (IGNARRO et al., 1987).
Em vasos sanguíneos, o aumento intracelular de GMPc induz ao relaxamento da musculatura lisa vascular e consequente vasodilatação. Portanto, o NO produzido via ativação da eNOS desencadeia a formação de GMPc, estando envolvido com mecanismos que regulam o
normotensos quanto hipertensos (SPOSITO, 2004). Dentre os quais podemos destacar: controle da resistência vascular, a adaptação do fluxo sanguíneo às demandas metabólicas e o remodelamento do diâmetro do vaso ao fluxo de volume circulante.
2.4. Estado Redox e Sistema Antioxidante
O processo redox desempenha papel relevante na homeostasia de todas as células (JONES, 2006; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007; WINTERBOURN 2008). O desequilíbrio entre e produção e inativação das espécies reativas de oxigênio (EROs), conhecidas como radicais livres, denomina-se estresse oxidativo (MITTAL & KANT, 2009). Sendo, as EROs formadas em nosso organismo através de diversos processos fisiológicos e/ou fisiopatológicos. Em condições basais, apenas 5% de EROs são formadas durante o metabolismo celular. No entanto, em estados patológicos, sua produção aumenta de maneira significativa. Sabe-se que na hipertensão (HAS) ocorre estresse oxidativo e desequilíbrio redox (TOUYZ, 2004).
As principais espécies reativas de oxigênio são o ânion superóxido (·O2-), o radical
hidroxila (.OH), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o peroxinitrito (ONOO-). As espécies
reativas de oxigênio são formadas por atividade enzimática intra e extracelular, sendo a xantina oxidase, o citocromo P450, a via da cicloxigenase, a sintase endotelial do óxido nítrico (eNOS) desacoplada e a NADPH oxidase, as principais enzimas envolvidas neste processo. Sendo, a NADPH oxidase principal enzima formadora de ·O2- que possui grande citotoxicidade e está
envolvida na gênese de processos patológicos, como a hipertensão arterial (PARAVICINI & TOUYZ, 2008).
A reação do ·O2- com o NO produzido pela célula endotelial reduz a sua
Como forma de combater a formação de EROs, temos as enzimas antioxidantes que compõem a principal linha de defesa do nosso organismo. Dentre as enzimas antioxidantes presentes no tecido vascular, temos a catalase (CAT), a glutationa peroxidade (GSH-Px) e mais três tipos de superóxido dismutase (SOD), sendo a SOD-1 dependente de cobre e zinco (Cu/Zn), presente no núcleo e no citosol, a SOD-2 dependente de manganês (Mn), presente na mitocôndria e a SOD-3, presente na matriz extracelular. O papel da enzima SOD é promover a dismutação do ·O2-, formando assim peróxido de hidrogênio (H2O2). As enzimas CAT e a
GSH-Px promovem a eliminação de H2O2, promovendo a formação de água, mantendo os níveis de
EROs reduzidos no organismo. O perfeito equilíbrio entre as enzimas antioxidantes e a formação de EROs é fator determinante para a integridade celular, pois a SOD, CAT e GSH-Px evitam o acúmulo das moléculas altamente reativas de oxigênio, evitando o dano celular (CAI & HARRISON, 2000; ZAROS & ZANESCO, 2009).
Como demonstrado anteriormente, a menopausa pode causar mudanças na saúde da mulher. Trabalhos mostram que alterações no estresse oxidativo de mulheres pós-menopausa podem ocorrer aumentando o risco de eventos cardiovasculares (REIS et al., 2000; SIGNORELLI et al., 2006; HODIS et al., 2008). Além disso, estudos demonstraram que a menopausa está associada com aumento da peroxidação lipídica e CAT, e uma diminuição da SOD e GSH-Px (BEDNAREK-TUPIKOWSKA et al., 2001; SHRIVASTAVA et al., 2005; PANSINI et al., 2008). No entanto, estudos em modelos animais não suportam o papel do estresse oxidativo contribuindo para o controle da PA em animais fêmeas (SARTORI-VALINOTTI et al., 2007).
2.5. Sistema Renina-Angiotensina
O SRA é um complexo sistema hormonal associado com o controle da pressão arterial e associado à manutenção da homeostasia hidroeletrolítica do organismo. Além disso, é considerado o mais importante regulador da função renal e cardiovascular (KEIDAR et al., 2007). Classicamente, o principal componente biologicamente ativo do SRA é a Angiotensina II (Ang II), que desempenha papel regulatório fundamental devido à sua ação vasoconstritora e importante contribuição para a liberação de aldosterona (EHLERS & RIORDAN, 1989; GOODMAN & GILMAN, 1991).
A visão clássica desse sistema dá-se pela produção do angiotensinogênio pelo fígado, sendo liberado para circulação, onde é encontrado em altas concentrações. Na circulação, o angiotensinogênio sofre ação da renina, uma enzima glicoproteolítica de origem renal, a mesma é armazenada de forma inativa (denominada pró-renina) nas células justaglomerulares dos rins. Quando se observa reduções da pressão arterial, reações fazem com que essas moléculas de pró-renina sejam convertidas em pró-renina através da clivagem do pró-segmento N-terminal de 43 aminoácidos (PEART, 1991; GUYTON & HALL, 2006). Depois de sintetizadas e liberadas para circulação a renina promove a clivagem do segmento N-terminal do angiotensinogênio, produzindo um decapeptídeo chamado de Angiotensina I (Ang I), também conhecida como Angiotensina-(1-10) (Asp-Arg-Val-Tyr-lle-His-Pro-Phe-His-Leu) (JAMES & SIELECKI, 1985; GUYTON & HALL, 2006).
Após a formação da Ang I, ocorre a formação da Ang II pela ação catalítica da Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) sobre a Ang I (DONOGHUE et al., 2000; RAIZADA & FERREIRA, 2007). Esta conversão ocorre quase que exclusivamente nos vasos dos pulmões, catalisada pela ECA presente no endotélio dos vasos pulmonares. A ECA remove o dipeptídeo (His-Leu) da Ang I, dando origem a Ang II. Os efeitos da Ang II são mediados por dois tipos distintos de receptores: AT1 e AT2, sendo que a maior interação desse peptídeo dá-se pela via dos
receptores AT1, acarretando ação vasoconstritora, efeito arritmogênico, proliferação celular,
trombose, coagulação, inflamação e hipertrofia do músculo liso vascular (ALLEN et al., 2000; SIRAGY, GASPARO & CAREY, 2000). Essa via de sinalização da Ang II com os receptores AT1, é feita pela ativação da proteína G, com consequente ativação de fosfolipase C-β e
com o receptor AT2, apresenta efeito antagônico à ação do eixo ANG II – receptor AT1,
resultando na formação de NO, e consequente vasodilatação (RUSH & AULTMAN, 2008). Além da Ang II, outros peptídeos biologicamente ativos são formados, entre eles, angiotensina III, angiotensina IV e angiotensina-(1-7) [Ang-(1-7)]. Este último, de grande interesse em razão de suas ações antagônicas às da Ang II (FERRARIO et al.,1998). (Ilustração do Sistema Renina-Angiotensina – Figura 3).
Figura 3. Esquema do Sistema Renina-Angiotensina (Adaptado de Santos et al., 2008).
Ang: Angiotensina, ECA: enzima conversora de angiotensina, NEP: Endopeptidase Neutra, PEP: Prolil
Endopeptidases, AMP: aminopeptidase, D-AMP: dimetil-aminopeptidase, AT1: receptor de Ang II do
tipo 1, AT2: receptor de Ang II do tipo 2.
A
Angiotensinogênio
Renina
A
Ang I
E ECA
Receptor AT1
NEP, PEP ECA, NEP
E ECA Ang-(1-5)
Bradicinina
Mas
Vasodilatação Anti- proliferação
Anti-hipertrofia ECA 2, PEP, PCP D-AMP
AMP
Vasoconstrição Proliferação celular
Hipertrofia
ECA2
Ang II
Ang-(1-9)
Ang--(1--7)
Receptor AT2
ECA NEP NEP PEP
ECA 2 PEP PCP
Ang III Ang IV
A descoberta da Enzima Conversora de Angiotensina 2 (ECA2), um homólogo da ECA, mudou todo o conceito do SRA (DONOGHUE et al., 2000; FERRARIO, C.M., 2006; RAIZADA & FERREIRA, 2007). A ECA2 está presente em uma variedade de células e tecidos sendo altamente expressa no coração, rim, retina e tecido placentário (BROSNIHAN et al.,2003; TIKELLIS et al., 2004; BURREL et al., 2005). Sendo responsável pela formação do heptapeptídeo Ang-(1-7), a partir da clivagem do último aminoácido (fenilalanina) da Ang II, proporcionando assim, redução dos efeitos vasoconstritores da Ang II por utilizá-lo como substrato (SCHINDLER et al., 2007). Além desta, outra via de atuação da ECA2, menos eficiente, dá-se pela remoção de um aminoácido do substrato protéico na extremidade carboxílica da Ang I, resultando na formação de um peptídeo biologicamente inativo a Angiotensina-(1-9), que é posteriormente convertido em Ang-(1-7) pela ação de ECA e endopeptidases neutras (NEP) ou ainda uma terceira via que ocorre pela ação das endopeptidases teciduais prolil-endopeptidases (PEP) e NEP, a Ang I é convertida diretamente em Ang-(1-7) (DONOGHUE et al., 2000;RICE et al., 2004). A Ang-(1-7) tem suas ações biológicas mediadas pelo receptor Mas (SANTOS et al., 2003).
Evidências têm demonstrado efeitos benéficos da Ang-(1-7) para as doenças cardiovasculares através da vasodilatação, efeito anti-arritmogênico, melhora na função contrátil pós-isquemia (FERREIRA, SANTOS & ALMEIDA, 2001), sendo esses efeitos antagônicos àqueles observados pela Ang II tanto em culturas de células (CRACKOWER et al., 2002; RICE et al., 2004; KUBA et al., 2005), como em diversos tecidos vasculares (HARMER et al., 2002; LI et al., 2003; RICE et al., 2004). Assim, surge outra via de regulação do sistema cardiovascular a partir do SRA, denominado ECA2–Ang-(1-7)–Mas (SANTOS et al., 2003; TALLANT, FERRARIO, GALLAGHER, 2005). Sendo que, esse eixo desempenha papel contra regulatório para o SRA, induzindo a liberação de NO; sendo esses efeitos opostos aos clássicos efeitos do eixo ECA–Ang II–AT1 (FERREIRA & SANTOS, 2005).
2.6. Sistema Renina-Angiotensina em modelos experimentais
receptor AT1 ou de forma indireta (sobrecarga pressórica), estimula o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca (SAKATA et al., 2001) e a Ang-(1-7), via receptor MAS, inibe este efeito (TALLANT, FERRARIO & GALLAGHER, 2005).
Utilizando o modelo de hipertensão por coartação subdiafragmática da aorta, foi demonstrado que a elevação da PA foi acompanhada por ativação da Ang II plasmática e tecidual, causando diminuição da sensibilidade barorreflexa (MICHELINI, OLIVEIRA, SANTOS, 1992; SANTOS et al., 1995). Em contrapartida, a administração de losartan, visando o bloqueio crônico dos receptores AT1, reverteu os efeitos observados no modelo de hipertensão por coartação, mediados pela maior disponibilidade de Ang II (SANTOS et al., 1998; BEZERRA et al. 2001). Em outro estudo foi observado que animais knockout para o receptor AT1 apresentam pressão arterial e peso cardíaco menor que os animais selvagens, demonstrando os efeitos principalmente da Ang II, para o desenvolvimento de HAS (GEMBARDT et al., 2008). Em contrapartida, Zou e colaboradores (2004) demonstraram que o receptor AT1 pode ser ativado por estresse mecânico sem a participação da Ang II. E ainda, mesmo na ausência de Ang II (animais KO para o angiotensinogênio), o tratamento com Candesartan (bloqueador do Receptor AT1) foi eficaz em diminuir a hipertrofia cardíaca, sugerindo ativação direta dos receptores pela sobrecarga pressórica.
O estudo realizado por Gomes Filho e colaboradores (2008) demonstrou em condições basais que ratos SHR (espontaneamente hipertensos), possuem significativamente maiores concentrações de Ang II e menores concentrações plasmáticas de Ang-(1-7) quando comparadas a ratos Wistar normotensos. Neste mesmo estudo, foi observado hipertrofia cardíaca em ambas as linhagens após o treinamento físico com mudanças nos níveis cardíacos de Ang-(1-7) apenas para os ratos da linhagem SHR, o qual desenvolveu menor hipertrofia. Sugerindo que, o exercício estimule o eixo Ang-(1-7)–MAS em condições patológicas como a hipertensão arterial, demonstrando seus efeitos cardioprotetores.
2.7. Sistema Renina-Angiotensina em seres humanos
Estudos em seres humanos sobre o SRA são mais complexos devido a interação de outros sistemas e das possibilidades de análises. Um estudo em homens normotensos demonstrou que a infusão local de Ang-(1-7) mais a bradicinina atenuam as respostas vasoconstritoras induzidas pela Ang II (UEDA et al., 2001). Em contrapartida, uma evidência negativa para o papel da Ang-(1-7) na regulação da pressão arterial foi obtida a partir da infusão de baixas doses de Ang-Ang-(1-7) em homens com dieta pobre em sódio seguida de bloqueio agudo com captopril (PLOVSING et al., 2003). Sugerindo que para alcançar as ações desejáveis da Ang-(1-7), precisa estar em altas concentrações na circulação.
3. OBJETIVO GERAL
O objetivo do presente estudo foi analisar o Sistema Renina-Angiotensina circulante, concentrações plasmáticas de Nitrito/Nitrato e biomarcadores do estresse oxidativo em mulheres no climatério.
3.1. Objetivos Específicos
- Comparar a atividade da ECA circulante, as concentrações plasmáticas da Angiotensina I, Angiotensina II, Angiotensina-(1-7), concentrações plasmáticas de Nitrito/Nitrato, enzimas antioxidantes (SOD e Catalase) e concentrações de MDA em mulheres normotensas e hipertensas no climatério.
- Comparar a atividade da ECA circulante, as concentrações plasmáticas da Angiotensina I, Angiotensina II, Angiotensina-(1-7), concentrações plasmáticas de Nitrito/Nitrato, enzimas antioxidantes (SOD e Catalase) e concentrações de MDA em mulheres perimenopausa e pós-menopausa.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Participantes
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos do Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho – UNESP –
Câmpus de Rio Claro (Protocolo Nº 7779/2011 - Anexo 1). As participantes desse estudo foram recrutadas através do banco de dados do laboratório, da divulgação do projeto pela mídia televisiva, rádio, panfletos e anúncios dentro da comunidade universitária e de áreas circunvizinhas à UNESP.
4.2 Critérios de Inclusão
Para serem incluídos no estudo as participantes deveriam ser do sexo feminino, ter idade ≥40 e ≤65 anos, não ser fumante, ter função renal normal (creatinina sérica entre 0,4 e 1,4
mg/dL), não fazer uso de medicamento que interfere com a atividade da enzima conversora de angiotensina (inibidores de ECA), não diabética (NCEP-ATPIII, 2002; ADA, 2013), apresentar Índice de Massa Corpórea (IMC) <30kg/m², evitando-se assim a interferência do diabetes
mellitus e da obesidade. Após a seleção, as voluntárias foram convidadas a comparecerem
novamente ao Laboratório de Fisiologia Cardiovascular e Atividade Física (local do estudo) para a explicação completa do estudo pelo pesquisador responsável. Depois de fornecidas todas as explicações e retiradas todas as dúvidas, as voluntárias assinaram um Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido, resumindo o estudo e informando seus riscos e benefícios.
4.3 Caracterização do Quadro Hipertensivo/Medida da Pressão Arterial
As voluntárias foram classificadas como hipertensas (HT), segundo diagnóstico previamente realizado pelo médico ou quando os valores médios da pressão arterial sistólica (PAS) ≥140 mmHg e/ou pressão arterial diastólica (PAD) ≥90 mmHg.
mesmo experiente avaliador durante três dias, de acordo com a VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão Arterial (2010).
4.4 Grupos Experimentais
Após algumas desistências ou mesmo exclusão por não se encaixarem nos critérios do estudo, o grupo experimental foi constituído por 96 voluntárias, sendo estas divididas entre normotensas (n=67) e hipertensas (n=29) conforme figura abaixo:
Figura 4. Recrutamento e divisão das voluntárias selecionadas divididas em normotensas e
hipertensas.
Banco de Dados
(n=260)
Entrevista
(n=237)
Total
(n=497)
Critérios de Exclusão
(n=247)
Candidatas ao Estudo
(n=250)
Total de Voluntárias
(n=96)
NT
(n=67)
Não Aceitaram
(n=154)
HT
4.5 Identificação da Pós-menopausa
A identificação da pós-menopausa, foi feita através de auto-relato com ausência de menstruação por 12 meses e medida pelo folículo estimulante (FSH > 40mIU/mL).
Figura 5. Identificação do período do climatério das voluntárias normotensas e hipertensas:
perimenopausa e pós-menopausa.
4.6 Parâmetros Antropométricos
O peso corporal foi mensurado em balança digital (Toledo® 2096 PP) com o indivíduo vestindo o mínimo possível de roupa e descalço. A estatura foi mensurada com estadiômetro da própria balança, isenta de rodapés ou irregularidades. A voluntária permaneceu ereta, e com os olhos fixos num eixo horizontal paralelo ao chão. O índice de massa corporal (IMC) foi determinado pela razão peso corporal/ altura2.
4.7 Coleta Sanguínea
Após jejum noturno de aproximadamente 12 horas, as amostras de sangue foram obtidas de veia antecubital (15 ml), através da técnica asséptica com material de punção venosa, descartável e apropriado para a população estudada. As coletas foram realizadas em um Laboratório particular de Análises Clínicas por profissionais altamente experientes e habilitados. As amostras de sangue obtidas foram depositadas em tubos específicos, contendo EDTA (obtenção do plasma), inibidores de protease (plasma para análise do sistema renina-angiotensina) e tubos secos com gel separador (obtenção soro).
NT HT
0 50 100 150 200
H
o
rm
ôni
o Fol
íc
ul
o E
st
im
u
la
nt
e
(m
IU
/m
4.8 PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
Perfil Lipídico e Glicemia de jejum 4.8.1
Amostras de soro foram utilizadas para a determinação dos níveis de colesterol total (CT), triglicerídeos (TG), LDL Colesterol (LDL–C), HDL Colesterol (HDL–C) e glicemia de jejum pelo método enzimático-colorimétrico (Trinder). As análises foram realizadas em um Laboratório de Análises Clínicas.
Atividade da enzima conversora de angiotensina (ECA) 4.8.2
A atividade da ECA foi determinada em amostras de soro usando (Abz-FRK(Dnp)P-OH derivados como substratos por medição contínua da fluorescência, conforme descrito por Alves e colaboradores (2005). O sangue obtido foi centrifugado por 10 min 3000 rpm a 4oC, para obtenção do soro e estocados a -80ºC. Foram incubados 5 Pl de soro com 195 Pl de tampão de incubação com o substrato fluorescente (Abz-FRK(Dnp)P-OH (Abz = ortho-aminobenzol; Dnp = dinitrophenil) 15PM em tampão Tris-HCl 0.1M contendo NaCl 50mM e 10 PM ZnCl2, pH
7.0), em um volume final de 200 Pl. A atividade da enzima foi determinada de forma contínua em fluorímetro (Oem =420nm e Oex=320nm), por 180 minutos. O tempo da leitura e a quantidade
de proteína utilizados na reação foram escolhidos de modo a assegurar a linearidade da formação do produto. Todas as amostras foram ensaiadas em duplicata, sendo que a fluorescência intrínseca da amostra foi corrigida através de brancos onde a reação era inibida por captopril 0,5 μM. A atividade da ECA foi expressa em uF/min/ml.
Concentração de Angiotensina I (Ang I), Angiotensina II (Ang II) e 4.8.3
Angiotensina-(1-7) [(Ang-(1-7)]
Nitrato/Nitrito (NOx-) 4.8.4
Amostras de soro foram utilizadas para determinação da produção endógena de NO por meio da quantificação dos ânions nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-), produtos terminais da oxidação
do NO.
O soro foi ultrafiltrado (12000g) por 80 minutos utilizando-se microfiltros (Microcon Centrifugal Filter Units, 10 kDa; Millipore, Bedford, MA, USA), e o sobrenadante estocado a -80°C. A concentração do nitrito/nitrato plasmático foi determinada por método colorimétrico utilizando kit comercial (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) seguindo as instruções do fabricante. As absorbâncias dos picos foram determinadas a 540 nm.
Hormônio luteinizante (LH) e folículo estimulante (FSH) 4.8.5
A dosagem de LH/FSH foram realizadas pelo método de ELISA imunométrico do tipo sanduíche - Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA. Cada placa contem streptavidina. As amostras os anticorpos e o anticorpo marcado HRP são incubados conjuntamente. O anticorpo irá se ligar em ambas streptavidina na placa e no LH ou FSH da amostra, e o anticorpo de detecção irá se ligar a outro antígeno na molécula de LH/FSH. Todo o complexo é imobilizado na placa pela interação entre o anticorpo e a streptavidina. Depois da eliminação e lavagem do excesso do restante do anticorpo e do material não ligado ao complexo, à concentração de LH/FSH é determinada pela medida da atividade enzimática da HRP adicionando o substrato tetrametilbenzidina (TMB). Depois do tempo determinado a reação é interrompida com um ácido formando um produto de cor amarelada que pode ser medido a 450nm. A intensidade da coloração é diretamente proporcional à quantidade de ligações do anticorpo HRP e LH/FSH, que está relacionado à quantidade proporcional de LH/FSH na amostra. As amostras estão expressas em mIU/mL.
Análise das enzimas antioxidantes e concentrações de MDA 4.8.6
superóxido. O kit permite a medida da atividade plasmática dos três tipos de SOD (Cu/Zn, Mn, e FeSOD). A leitura foi realizada a 450 nm absorbância, e os resultados são expressos em U/mL. Catalase (CAT): Para determinação da atividade da CAT plasmática foi utilizado o kit comercial Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA. O kit utiliza da função peroxidática da catalase para determinação da atividade da enzima. O método é baseado na reação da enzima com metanol na presença de uma concentração ótima de peróxido de hidrogênio (H2O2). O
Formaldeído produzido é medido por método colorimétrico com 4-amino-3hidrazino-5-mercapto-1,2,4triazol (Purpald) como o cromógeno. O Purpald forma especificamente hererociclo biociclina com aldeídos que na oxidação muda a coloração para cor roxa. O kit é usado para medir a atividade da catalase plasmática em nmol/min/mL a 540 nm de absorbância. Malondíaldeido (MDA): Para determinação do MDA a medição das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) é um método bem estabelecido para detecção e monitoramento da peroxidação lipídica e foi realizado utilizando o kit comercial colorimétrico - Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EUA. O malondíaldeido (MDA) é um dos produtos derivados da oxidação dos ácidos graxos insaturados e utilizado como método para avaliação da peroxidação lipídica. O MDA em altas temperaturas e em condições ácidas se liga ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), formando MDA-TBARS e foram medidos a 532 nm, os resultados são expressos em μM.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como médiarerro padrão da média (EPM). Para avaliação dos resultados foi aplicado o teste de Kolmogorov-Smirnov para determinação da normalidade do conjunto de dados. Posteriormente, foi utilizado o teste t de Student para amostras não pareadas e o teste de qui-quadrado (χ2) para avaliar a associação entre variáveis independentes. O software utilizado foi o SPSS 13.0 e o GraphPad Prisma versão 4. O nível de significância adotado foi p<0,05.
Foram selecionadas 96 voluntárias, das quais 67 eram normotensas e 29 eram hipertensas, conforme os critérios de inclusão. Ambos os grupo de voluntárias apresentavam tempo de menopausa similar, cerca de 7,7±1,0 anos e 10,2±2,2 anos para as normotensas e hipertensas, respectivamente. A tabela 2 mostra as características das participantes do estudo, podemos observar que a média de idade das voluntárias hipertensas era significativamente maior quando comparada às voluntárias normotensas. No entanto, elas encontravam-se dentro da mesma faixa etária. Os demais parâmetros não apresentaram diferenças estatísticas entre si demonstrando homogeneidade da população e servindo para caracterizar os grupos dentro da normalidade estabelecida nos critérios de inclusão.
Tabela 2. Características gerais das voluntárias normotensas e hipertensas.
PARÂMETROS Normotensas (NT) n=67
Hipertensas (HT)
n=29
Δ (%)
Idade (anos) 52,1±0,9 55,5±1,5† -
IMC (Kg/m2) 26,4±0,4 25,8±0,9 -2,3
CA (cm) 82,4±1,0 85,2±1,8 3,4
Creatinina (mg/dL) 0,80±0,02 0,83±0,02 3,7
LH (mIU/mL) 29,7±2,6 29,3±3,3 -1,3
FSH (mIU/mL) 40,1±4,0 49,1±6,8 22,3
Os dados estão expressos em média±erro padrão da média.
IMC: índice de massa corporal; CA: circunferência abdominal; LH: hormônio luteinizante; FSH: hormônio folículo estimulante.
†p<0.05. (Diferença estatisticamente significativa entre normotensas e hipertensas).
apresenta-se maior em voluntárias hipertensas. A figura 6 mostra os dados individuais da PAS, PAD e NOx- das voluntárias normotensas e hipertensas e na sequência a figura 7 ilustra os dados de medicamentos anti-hipertensivos usados pelas voluntárias.
Figura 6. Valores de pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e
concentração de nitrito/nitrato (NOx-) das voluntárias normotensas (n=67) e hipertensas (n=29). Os
valores representam as médias±erro padrão da média. †p<0.05; *p<0.01. '= 22,3%
50 75 100 125 150
*
109,83±1,38 134,27±2,64 PA S ( m m H g)*
'= 15,3%
50 75 100 125 150 71,52±0,88 82,44±1,39 HT NT P AD ( m m H g )
'= 39,7%
Figura 7. Valores individuais da pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD) e
concentração de nitrito/nitrato (NOx-) das voluntárias normotensas (n=67) e hipertensas (n=29).
Figura 8. Dados dos medicamentos das voluntárias hipertensas.
NT HT 50 75 100 125 150 175 PAS ( m m Hg) NT HT 50 75 100 125 150 175 PAD ( m m Hg) NT HT 0 10 20 30 40 50 60 NO x - ( µ M ) n=5, 28% n=7, 34% n=11, 38% n=2, 7%
n=3, 11% Bloq. do Recep.
AT1
Betabloqueador
Nada
Bloq. do Recep. AT1+Diurético
Figura 9. Valores da glicemia de jejum e perfil lipídico das voluntárias normotensas (n=67) e hipertensas
(n=29). Os valores representam as médias±erro padrão da média. †p<0.05. '= 4,4%
0 20 40 60 80 100 † 90,16±1,03 94,10±1,83 G lic e m ia ( m g /d L )
'= 0,7%
0 50 100 150 200 250 NT HT 201,00±3,69 202,34±5,48 C ol est er ol Tot al ( m g/ dL)
'= -1,1%
0 25 50 75 100 46,53±0,68 46,03±1,09 H D L -C ol est er ol ( m g/ dL)
'= -2,4%
50 75 100 125 150 132,39±3,28 129,26±5,73 NT HT L D L-C o lest er ol ( m g/ dL)
'= 24,5%
50 75 100 125 150 108,62±6,81 135,24±15,78 T rig lic e rid e o s ( m g /d L )
'= 24,5%
Figura 10. Valores individuais da glicemia e colesterol total e frações das voluntárias normotensas
(n=67) e hipertensas (n=29).
A figura 10 mostra os valores de atividade da ECA circulante e das concentrações plasmáticas dos peptídeos do sistema renina-angiotensina (Ang I, Ang II e Ang-(1-7)) das voluntárias NT (n=67) e HT (n=29). Podemos observar que os peptídeos avaliados apresentavam valores significativamente aumentados nas voluntárias hipertensas quando comparadas às normotensas. De maneira interessante, a Ang-(1-7), considerado um peptídeo vasodilatador, apresenta-se grandemente elevado em sua concentração plasmática em mulheres hipertensas, cerca de 130%. Por outro lado, não observamos qualquer alteração na atividade da ECA basal entre os grupos. Na figura 11 temos os dados individuais da atividade da ECA circulante e das concentrações dos peptídeos plasmáticos do sistema renina-angiotensina.
Figura 11. Atividade da ECA circulante, concentrações plasmáticas de Angiotensina I, Angiotensina II,
Angiotensina-(1-7) das voluntárias normotensas (n= 67) e hipertensas (n=29). Os valores representam as
médias±erro padrão da média. *p<0,01.
'= 252,1%
0 100 200 300 400 500
*
69,05±7,99 243,14±39,09 A n g I (p m o l/m L )'= 3,1%
0 100000 200000 300000 400000 NT HT 320272,3±7053,7 330185,8±8894,2 At iv id a d e E CA ( u F /mi n /mL )
'= 88,5%
0 100 200 300 400 500
*
196,27±14,84 370,02±40,74 A n g II ( p m o l/m L )'= 130,5%
Figura 12. Valores individuais da atividade da ECA circulante, concentrações plasmáticas de
Angiotensina I, Angiotensina II, Angiotensina-(1-7) das voluntárias normotensas (n= 67) e hipertensas
(n=29).
A figura 12 apresenta os valores da atividade das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase – SOD e catalase) e as concentrações séricas de malondíaldeido (MDA). A atividade das enzimas SOD e catalase não foram diferentes entre os grupos, apesar da atividade da SOD ter apresentado um valor de 23% menor no grupo de voluntárias hipertensas quando comparado às voluntárias normotensas. As concentrações do MDA também não foram diferentes entre os grupos. Na figura 13 temos os dados individuais das enzimas antioxidantes e da concentração sérica de MDA.
Figura 13. Atividade da SOD, atividade da catalase e concentrações de MDA de voluntárias normotensas
(n= 67) e hipertensas (n=29). Os valores representam as médias±erro padrão da média.
0 5 10 15 20
25 '= -23,1
17,94±1,46 13,79±1,51 S O D (U /m l)
'= 12,1%
0 10 20 30 40 50 32,68±2,63 36,63±3,78 NT HT C a ta la s e (n m o l/m in /m L )
'= 16,5%
Figura 14. Valores individuais de atividade da SOD, atividade da catalase e concentrações de MDA de
voluntárias normotensas (n= 67) e hipertensas (n=29).
NT HT
0 20 40 60 80
S
O
D
(
U
/m
l)
NT HT
0 20 40 60 80 100
C
a
ta
la
s
e
(
n
m
o
l/m
in
/m
L
)
NT HT
0 5 10 15 20
MD
A (
µ
M
As voluntárias selecionadas foram divididas em dois períodos do climatério, perimenopausa e após a menopausa, para isso anteriormente ao início da análise foi realizado o teste de qui-quadrado (χ2), objetivando avaliar se havia associação entre mulheres na pós-menopausa e a presença de hipertensão arterial. Observamos que não houve tal associação (p=0,889), ou seja, tanto o número de voluntárias normotensas e de voluntárias hipertensas eram similares entre peri e pós-menopausa. E ainda, quando testada a possibilidade através do χ2 de no grupo de voluntárias pós-menopausa haver maior quantidade de mulheres hipertensas medicadas, não encontramos tal associação (p=0,872). O que nos permitiu juntar as voluntárias normotensas e hipertensas e fazer a análise estatística dividindo o grupo em: perimenopausa (n=42) e pós-menopausa (n=54) (dados ilustrados nas tabelas 3 e 4).
A tabela 5 mostra a idade, características antropométricas, cardiovasculares (PA auscultatória), hormonais, glicemia de jejum e perfil lipídico das voluntárias de ambos os grupos. Dentro dos critérios de inclusão, como esperado a média de idade e os valores de LH e FSH são maiores nas voluntárias que já se encontram no período pós-menopausa. Contudo, os demais parâmetros antropométricos, cardiovasculares e o perfil lipídico não apresentaram diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Entretanto, os dados da glicemia de jejum apresentam-se maiores no grupo de voluntárias pós-menopausa.
Tabela 3. Avaliação da associação das variáveis independentes: ausência/presença da patologia e período pós-menopausa.
NT HT P
PÓS-MENOPAUSA
Não 29 (69,0%) 13 (31,0%) 0.889
Sim 38 (70,4 %) 16 (29,6%)
Tabela 4. Avaliação da associação das variáveis independentes: uso ou não do medicamento e período pós-menopausa.
s/ Medicamento c/ Medicamento p
PÓS-MENOPAUSA
Não 34 (43,6%) 44 (56,4%) 0.872
Tabela 5. Características antropométricas, cardiovasculares, hormonais, glicemia de jejum e
perfil lipídico das voluntárias perimenopausa e pós-menopausa.
PARÂMETROS Perimenopausa
n=42
Pós-Menopausa
n=54
Δ (%)
Idade (anos) 46,9±0,7 57,9±0,8* -
IMC (Kg/m2) 26,5±0,4 26,1±0,4 -1,5
CA (cm) 82,5±1,2 83,5±1,3 1,3
PAS (mmHg) 113,7±2,5 119,9±2,2 5,5
PAD (mmHg) 74,9±1,6 74,8±1,1 -0,1
LH (mIU/mL) 20,7±3,7 35,7±4,4* 72.0
FSH (mIU/mL) 22,7±2,0 58,9±3,9* 159.0
Glicemia (mg/dL) 89,2±1,1 93,0±1,4† 4.3
CT (mg/dL) 199,8±4,7 202,7±4,0 1.4
HDL-colesterol (mg/dL) 46,0±0,8 46,7±0,8 1.4
LDL-colesterol (mg/dL) 131,6±4,1 131,3±4,0 -0.2
Triglicerídeos (mg/dL) 110,6±7,7 121,6±10,6 9.8
VLDL-colesterol (mg/dL) 22,1±1,5 24,3±2,1 9.9
Os dados estão expressos em média±erro padrão da média.
IMC: índice de massa corporal; CA: circunferência abdominal; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica, LH: hormônio luteinizante; FSH: hormônio folículo
estimulante, CT: colesterol total.
†p<0.05; *p<0.01. (Diferença estatisticamente significativa entre normotensas e hipertensas).
da SOD apresentou-se significativamente menor nesse grupo quando comparadas às voluntárias na perimenopausa (Figura 14).
A análise da atividade da ECA circulante e os peptídeos do sistema renina-angiotensina em ambos os grupos mostrou que a atividade da ECA é maior nas voluntárias na pós-menopausa e que as concentrações de Ang-(1-7) são menores nesse grupo. Observamos um aumento de 17,9% e 31,0% para as concentrações de Ang I e Ang II nas voluntárias pós-menopausa, respectivamente, mas esses dados não apresentaram significância na análise estatística (Figura 15).
Figura 15. Concentração de nitrito/nitrato (NOx-), atividade da SOD, atividade da catalase e
concentrações de MDA das voluntárias na perimenopausa (n=42) e pós-menopausa (n=54). Os valores
representam as médias±erro padrão da média. †p<0.05; *p<0.01. '= 40.0%
0 5 10 15 20 25 11,24±0,71 15,74±1,38
*
N O x - (µ M ) 0 5 10 15 2025 '= -23.4%
19,13±1,49 14,65±1,61 † Perimenopausa Pós-Menopausa S O D (U /m l)
'= -1,4%
0 10 20 30 40 50 34,11±2,01 33,63±2,58 C a ta la s e (n m o l/m in /m L )
'= -1,1%
Figura 16. Atividade da ECA, concentrações de Angiotensina I, Angiotensina II, Angiotensina-(1-7) das
voluntárias perimenopausa (n=42) e pós-menopausa (n=54). Os valores representam as médias±erro
padrão da média. *p<0.01; †p<0.05.
A tabela 6 apresenta os dados de correlação entre a idade, PAS, PAD e os peptídeos do sistema renina-angiotensina em voluntárias na perimenopausa e na pós-menopausa. Em mulheres na perimenopausa, observamos correlação significativa e positiva entre Idade e Ang I; PAS e Ang I, PAS/ PAD com os três peptídeos do sistema renina-angiotensina. Em voluntárias na pós-menopausa, a idade correlacionou-se positivamente com a PAS. Ainda, a PAS foi correlacionada positivamente com os três peptídeos do sistema renina-angiotensina analisados e a PAD apenas com Ang-(1-7) nessas voluntárias.
'= 17,9%
0 100 200 300 400 500 110,52±12,90 130,29±25,36 A n g I (p m o l/m L )
'= 9,2%
0 100000 200000 300000 400000 Perimenopausa Pós-Menopausa 307515±8485 335669±7067
*
At iv id a d e E CA ( uF/ m in/ m L )'= 31,0%
0 100 200 300 400 500 211,83±21,99 277,48±26,42 A n g II ( p m o l/m L )
'= -31,1%
Tabela 6. Dados de correlação em voluntárias nos períodos de perimenopausa e pós-menopausa.
PERIMENOPAUSA PÓS-MENOPAUSA
PARÂMETROS r PARÂMETROS r
Idade Ang I 0,42** Idade PAS 0,46**
Ang I 0,41** Ang I 0,42**
PAS Ang II 0,32** PAS Ang II 0,46**
Ang-(1-7) 0,32** Ang-(1-7) 0,30*
Ang I 0,32*
PAD Ang II 0,30* PAD Ang-(1-7) 0,34*
Ang-(1-7) 0,38*
PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; Ang II: angiotensina I; Ang I:
Tabela 7. Características antropométricas, cardiovasculares, hormonais, glicemia de jejum e perfil lipídico de voluntárias NORMOTENSAS na perimenopausa e na pós-menopausa.
PARÂMETROS Perimenopausa
(n=29)
Pós-Menopausa
(n=38)
Δ (%)
Idade (anos) 46,4±0,8 56,4±0,9* -
IMC (Kg/m2) 26,2±0,5 25,9±0,5 -1,0
CA (cm) 81,7±1,4 83,0±1,4 1,5
PAS (mmHg) 105,7±1,7 112,9±1,9* 6,8
PAD (mmHg) 70,3±1,4 72,4±1,1 3,0
LH (mIU/mL) 19,7±4,7 36,0±2,7* 83,1
FSH (mIU/mL) 18,4±4,4 56,7±4,7* 208,5
Glicemia (mg/dL) 88,7±1,4 91,3±1,5 2,9
CT (mg/dL) 203,0±5,8 199,4±4,8 -1,7
HDL-colesterol (mg/dL) 46,3±0,9 46,7±1,0 1,0
LDL-colesterol (mg/dL) 134,3±4,9 131,0±4,4 -2,4
Triglicerídeos (mg/dL) 112,5±9,6 105,6±9,6 -6,1
VLDL-colesterol (mg/dL) 22,5±1,9 21,1±1,9 -6,1
Os dados estão expressos em média±erro padrão da média.
IMC: índice de massa corporal; CA: circunferência abdominal; PAS: pressão arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica; LH: hormônio luteinizante; FSH: hormônio folículo
estimulante, CT: colesterol total.
*p<0.01. (Diferença estatisticamente significativa entre normotensas perimenopausa e pós-menopausa).
voluntárias foram agrupadas, a atividade da SOD dentro do grupo de voluntárias normotensas apresentou-se menor no período da menopausa em relação à perimenopausa (Figura 16).
Figura 17. Concentração de nitrito/nitrato (NOx-), atividade da SOD, atividade da catalase e
concentrações de MDA das voluntárias normotensas perimenopausa (n=29) e pós-menopausa (n=38). Os
valores representam as médias±erro padrão da média. †p<0.05.
Com relação à atividade da ECA circulante e os peptídeos do sistema renina-angiotensina, não observamos diferença estatisticamente significativa para nenhum dos parâmetros analisados (Figura 17).
'= 25,0% 0 5 10 15 20 25 10,79±0,84 13,49±1,07 NO x - ( µ M ) 0 5 10 15 20
25 '= -17,2%
19,84±1,99 16,42±2,08
† NT - PerimenopausaNT - Pós-Menopausa
S O D ( U /m l) '= -2,5% 0 10 20 30 40 33,14±2,13 32,29±2,65 C at al ase ( n m o l/ m in /m L ) '= -2,8% 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 8,14±0,51 7,91±0,51
NT - Perimenopausa NT - Pós-Menopausa
M
DA (
µ
Figura 18. Atividade da ECA, concentrações de Angiotensina I, Angiotensina II, Angiotensina-(1-7) das
voluntárias normotensas perimenopausa (n=29) e pós-menopausa (n=38). Os valores representam as
médias±erro padrão da média. '= -31,9% 0 100 200 300 400 500 84,33±15,89 57,39±6,82 A n g I (p m o l/m L ) '= 5,3% 0 100000 200000 300000 400000
NT - Perimenopausa NT - Pós-Menopausa
310827±11335 327419±8897 At iv id ad e E CA ( u F /mi n /mL ) '= 11,7% 0 100 200 300 400 500 184,04±24,49 205,60±18,47 A n g II (p m o l/m L ) '= -34,3% 0 100 200 300 400 500
NT - Perimenopausa NT - Pós-Menopausa
Também avaliamos as voluntárias hipertensas divididas nos períodos de perimenopausa e pós-menopausa. Nesse grupo, foi realizado o teste de qui-quadrado (χ2) para avaliar se havia associação entre mulheres hipertensas na pós-menopausa e uso de medicamentos para o tratamento da hipertensão arterial. Observamos que não houve tal associação (p=0,958), ou seja, tanto a quantidade de voluntárias hipertensas na perimenopausa (n=6) quanto a de voluntárias hipertensas na pós-menopausa (n=8) que faziam uso de medicamento para o tratamento da hipertensão arterial eram similares entre os grupos. E ainda, quando testada a possibilidade através do χ2 de no grupo de voluntárias pós-menopausa haver maior quantidade de mulheres medicadas que faziam uso do bloqueador de receptor AT1, não encontramos tal associação (p=0,237). O que nos permitiu juntar as voluntárias hipertensas e fazer a análise estatística, sem a interferência dos medicamentos, dividindo o grupo em: HT - perimenopausa (n=13) e HT - pós-menopausa (n=16) (dados ilustrados nas tabelas 8 e 9).
A tabela 10 mostra a idade, características antropométricas, cardiovasculares (PA auscultatória), hormonais, glicemia de jejum e perfil lipídico das voluntárias que foram divididas em perimenopausa e pós-menopausa. Como esperado, novamente a média de idade e os valores FSH são maiores nas voluntárias hipertensas que já se encontram na pós-menopausa. Ainda, os dados da glicemia de jejum apresentam-se maiores nessas voluntárias. No entanto, os demais parâmetros antropométricos, cardiovasculares e o perfil lipídico não apresentaram diferença estatisticamente significativa entre os grupos, apesar dos níveis de triglicerídeos e VLDL-colesterol estarem 48,8% mais altos no grupo de voluntárias hipertensas e os triglicerídeos estarem acima dos níveis desejados.
Tabela 8. Avaliação da associação das variáveis independentes para as voluntárias hipertensas: uso ou não do medicamento e período pós-menopausa.
s/ Medicamento c/ Medicamento p
HT - PÓS-MENOPAUSA
Não 5 (38,5%) 8 (61,5%) 0,958
Tabela 9. Avaliação da associação das variáveis independentes para as voluntárias hipertensas: uso ou não de bloqueadores do receptor AT1 e período pós-menopausa.
s/ Bloq. Recep. AT1 c/ Bloq. Recep. AT1 p
HT - PÓS-MENOPAUSA
Não 8 (38,1%) 13 (61,9%) 0,237
Sim 5 (62,5%) 3 (37,5%)
Tabela 10. Características antropométricas, cardiovasculares, hormonais, glicemia de jejum e perfil lipídico das voluntárias HIPERTENSAS no período de perimenopausa e pós-menopausa.
PARÂMETROS Perimenopausa
(n=13)
Pós-Menopausa
(n=16)
Δ (%)
Idade (anos) 48,1±1,3 61,4±1,1* -
IMC (Kg/m2) 27,1±0,6 26,4±1,0 -2,3
CA (cm) 84,5±2,4 85,9±2,9 1,6
PAS (mmHg) 131,5±4,2 136,5±3,4 3,9
PAD (mmHg) 85,1±1,9 80,3±1,9 -5,6
LH (mIU/mL) 22,9±6,3 34,8±2,3 52,0
FSH (mIU/mL) 32,4±10,1 64,6±7,1* 99,7
Glicemia (mg/dL) 90,2±1,6 97,2±2,9† 7,8
CT (mg/dL) 192,5±8,0 210,3±7,1 9,2
HDL-colesterol (mg/dL) 45,5±1,6 46,5±1,5 2,3
LDL-colesterol (mg/dL) 125,8±7,6 132,1±8,5 5,0
Triglicerídeos (mg/dL) 106,5±13,3 158,6±25,4 48,8
VLDL-colesterol (mg/dL) 21,3±2,7 31,7±5,1 48,8
Os dados estão expressos em média±erro padrão da média.
estimulante; CT: colesterol total. †p<0.05; *p<0.01. (Diferença estatisticamente significativa entre hipertensas perimenopausa e pós-menopausa).
Figura 19. Concentração de nitrito/nitrato (NOx-), atividade da SOD, atividade da catalase e
concentrações de MDA das voluntárias hipertensas perimenopausa (n=13) e pós-menopausa (n=16). Os
valores representam as médias±erro padrão da média. *p<0.01; †p<0.05.
'= 86,0% 0 5 10 15 20 25 12,20±1,34 22,69±4,06 † NO x - ( µ M ) 0 5 10 15 20
25 '= -41,7%
17,61±1,99 10,26±1,85
HT - Perimenopausa HT - Pós-Menopausa * S O D ( U /m l) '= 2,3% 0 10 20 30 40 50 36,21±4,47 37,04±6,29 C a ta la s e ( n m o l/m in /m L ) '= 4,0% 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 9,14±0,99 9,51±0,65
HT - Perimenopausa HT - Pós-Menopausa
M
DA (
µ
