3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – ANIMAIS
Foram utilizados camundongos machos e fêmeas virgens da linhagem SWISS, com idade de 10 a 12 semanas, provenientes do CEMIB/UNICAMP e camundongos machos e fêmeas virgens da linhagem C57BL/J (B6), com idade aproximadamente de 10 a 12 semanas, provenientes do Jackson Laboratory (USA), mantidos em gaiolas com acesso à água e alimentação ad libitum e em ambiente com temperatura e iluminação controladas. As fêmeas foram acasaladas com machos de mesma linhagem e na manhã em que foi encontrado o tampão vaginal, considerou-se o primeiro dia de gestação (dg).
Os animais da linhagem SWISS foram manipulados no Biotério do Departamento de Histologia e Embriologia, IB, UNICAMP, enquanto os animais da linhagem C57BL/6 foram manipulados e utilizados no Biotério do Ontário Veterinary School, University of Guelph, Guelph, Canadá.
3.2 – COLETAS E PROCESSAMENTO DOS MATERIAIS
3.2.1 - INDUÇÃO DE LESÃO CIRURGICA DO EMBRIÃO (LCE)
As fêmeas SWISS e da linhagem C57BL/J (B6) no 9ºdg foram anestesiadas com injeção intraperitoneal de Quetamina (Agribrands do Brasil) (100-200mg/Kg) e Cloridrato
dos cornos uterinos e uma vez constatada a presença de sítios de desenvolvimento embrionário, procedeu-se a lesão cirúrgica dos embriões (LCE) por meio da introdução de uma agulha hipodérmica (15x5) através da parede uterina do lado antimesometrial em profundidade não superior a 2mm. As lesões foram realizadas em sítios de implantação alternados de ambos os cornos uterinos, totalizando 5 a 6 sítios embrionários lesionados em cada animal. Após este procedimento, as incisões cutâneas e da fáscia muscular foram suturadas com fio cirúrgico.
3.2.2 - PROCESSAMENTO DOS MATERIAS
As fêmeas SWISS submetidas a LCE foram sacrificadas por deslocamento cervical nos períodos de 0,5horas (h), 1h, 2h, 6h, 12h e 24h pós-lesão e os cornos uterinos foram removidos rapidamente e mantidos em solução de Hanks (Sigma, St Louis, USA) refrigerado a 4ºC. As amostras foram coletadas de pelo menos 4 animais no 9º dg normal e em cada um dos períodos pós-LCE.
Os sítios uterinos submetidos a LCE dos grupos experimentais foram separados dos cornos uterinos e dissecados isolando-se a porção mesometrial. Para verificar se o isolamento da porção mesometrial estava isento do embrião e dos anexos, para posterior padronização da dissecção, foi separado aleatoriamente um sítio de implantação do embrião do animal normal para processamento histológico convencional de embebição em parafina.
Os sítios de implantação destinados a obtenção do homogenado celular foram dissecados e imediatamente congelados em N2 e mantidos a -70ºC para posterior extração
do RNA.
3.2.3 - PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO E CITOQUÍMICA COM LECTINA DBA
3.2.3.1 – PARA EMBEBIÇÃO EM PARAFINA
Os fragmentos dos sítios uterinos dissecados, conforme obtido em 3.2, foram fixados por imersão durante 24 h em solução de paraformaldeído 4% (Sigma, St Louis, USA) em tampão fosfato-salina (PBS) 0,1M pH 7,4 desidratados em etanol e diafanizados em xilol. Após embebição em parafina (Histosec, Merck, Brasil), cortes de 5 µm de espessura foram coletados em lâminas histológicas silanizadas.
Os cortes desparafinizados foram processados para citoquímica com a lectina Dolichos biflorus (DBA) de acordo com a técnica descrita por Paffaro et al (2003). As análises e a documentação digital foram realizadas no fotomicroscópio Eclipese 800 (Nikon, Japan) acoplado com câmara Cool-Snap e programa de tratamento de imagem da Image Pro-Plus (USA).
Os sítios uterinos coletados das fêmeas C57BL/6 destinados para LCM foram embebidos no meio de OCT (Cryomatrix, ThermoShandon, Pittsburg, PA, USA) em criomoldes, congelados a -20oC e mantidos a -80oC até o momento do uso. Os criocortes dos sítios de desenvolvimento embrionário no 9ºdg foram obtidos no criostato Leica CM3050S (Leica Microsystems Inc., Richmond Hill, ON, Canada) com 5 µm de espessura. Os cortes foram mantidos a temperatura ambiente (TA) por 1 min para secar o OCT e fixados com álcool 70% utilizando água livre de nuclease (Gibco/Invitrogen Corporation) durante 30 segundos (seg). Em seguida, foram lavados com água livre de nuclease e com TBS 0,05M, pH 7,6 (DakoCytomation Denmark A/S) por 30 seg. e em seguida incubados em TBS 0,05M pH 7,6 com albumina sérica bovina a 1% (Fisher Scientific, Pitsburgh) por 5 min a TA. Depois de lavadas com TBS 0,05M, pH 7,6 por três vezes, foram incubadas com lectina DBA 1:200 em TBS 0,05M, pH 7,6 por 5 min a TA. Os cortes foram lavados com TBS 0,05M, pH 7,6 três vezes e incubados com estreptoavidina conjugada com Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) diluída a 1:200 em TBS 0,05M, pH 7,6 por 5 min a TA. Após lavagens com TBS 0,05M, pH 7,6 três vezes, os cortes foram desidratados em cada gradiente crescente de álcool de 75 a 100%, a seguir foram mantidos por 5 min em xilol (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada), foram secas por 5 min na capela. As lâminas foram colocadas em caixa de lâminas com sulfato de cálcio anidro (Dirierite) (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada) e imediatamente processadas no microscópio de captura por microdissecção a laser (LCM).
Camundongos fêmeas SWISS foram sacrificadas no 9o dg por deslocamento cervical e em seguida laparotomizadas para remoção dos cornos uterinos. Os cornos uterinos foram dissecados e a região mesometrial de cada sítio de desenvolvimento embrionário removido e imerso em solução Hank´s. Para o isolamento das células uNK utilizou-se esferas magnéticas revestidas com lectina Dolichos biflorus biotinado (DBA, Sigma, ST. Louis, USA) como preconizado por Lima (2002). Em resumo, este método consiste-se em recortar os fragmentos da região mesometrial com auxílio de lâminas de barbear, suspender o macerado em 1ml de DNAse (1000UN) (Sigma Co, St Louis/USA) em solução Hanks, e homogeneizar por aspiração sucessiva com micropipetas (1mL). Em seguida, a suspensão celular foi filtrada em telas de nylon com malhas de 80µm e centrifugado a 300g por 10min, a 4oC. Lavou-se o sedimento celular através de duas centrifugações sucessivas em PBS contendo albumina sérica bovina (BSA) a 1%. Associou-se a suspensão celular com esferas magnéticas (Dynal, France), conjugada com lectina DBA de acordo com as instruções do fabricante. As células associadas com as esferas revestidas com a lectina DBA foram imobilizadas no MPC (magnetic particle concentrator – Dynal, France). As células imobilizadas em PBS/BSA foram lavadas e em seguida tratadas com N-acetil galactosamina (Nac Gal) (Sigma Co, St Louis/USA) na concentração de 0,1M para dissociação das esferas magnéticas. Após dissociação, a suspensão celular contendo apenas as células uNK foi transferida para outro tubo de eppendorf, ressuspendidas em PBS e quantificadas em câmara de Newbauer. Após nova centrifugação, o sobrenadante foi descartado e ao sedimento contendo a totalidade das células adicionou-se Trizol para realizar a extração de RNA total das células uNK.
3.4 - CAPTURA DE CÉLULAS A PARTIR DA MICRODISSECÇÃO A LASER
Para a microdissecção das células destinadas à obtenção de RNA para RT-PCR em tempo real quantitativo foram seguidas as recomendações descritas por Pinzani (2006). Utilizou-se de 9 a 12 criocortes de cada animal para microdissecção de cerca de 200 células uNK imaturas e 200 células uNK maduras, distinguindo-as segundo a classificação morfológica e localização destas células no sítio uterino conforme descrito por Paffaro e colaboradores (2003) (Figura 1a, b). Foi utilizado o microscópio de dissecção a laser Arcturus® PixCell II system (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) acoplado com sistema de fluorescência, do Departamento de Patologia da Universidade de Guelph. As células marcadas positivamente pela lectina DBA-fluoresceina foram capturas utilizando pulsos (= shots) de laser de 50, 100 ou 200 de 70 a 85mW com duração de 0,7 a 0,9 ms, depois demarcadas em imagens de fluorescência e coletadas em tampas CapSure™ HS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) e rapidamente processadas conforme procedimento do item 3.5.2
3.5 – EXTRAÇÃO DO RNA E OBTENÇÃO DO cDNA
3.5.1 – DO HOMOGENADO UTERINO E DAS CÉLULAS uNK ISOLADAS
Os fragmentos da região mesometrial dos sítios uterinos dissecados de animais em gestação normal em cada um dos períodos pós-LCE obtidos em 3.2, foram transferidos
para um tubo eppendorf (1,5 mL) e adicionados o reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) para homogeneização no homogeneizador rotativo (Glas-Col) por 1 minuto em banho de gelo, a baixa rotação. Foram transferidos para um tubo de 1,5ml livre de RNAse e DNAse e homogeneizados em Vórtex por 1 minuto para que houvesse a completa lise celular e o fragmento da região mesometrial foram macerados.
Em seguida as amostras homogeneizadas foram incubadas por 5 min a TA para permitir a completa dissociação dos complexos nucleoprotéicos. Para cada 300µL do homogenado adicionou-se 200 µL de clorofórmio (JT Baker) e homogeneizado em Vortex durante 30 seg. Após 3 min de repouso em TA, foram centrifugadas por 15 min a 12.000g a 4oC. A fase aquosa foi transferida para tubo eppendorf de 1,5mL. À fase aquosa acrescentou-se 1 ml de álcool isopropílico (J.T.Baker), e após homogeneização suave, as amostras foram mantidas em repouso por 12 h a -20oC.
Após este período, as amostras foram centrifugadas a 12.000g por 10 min a 4oC e após completa remoção do sobrenadante, adicionou-se 1 mL de etanol (J.T.Baker) a 70% e H20/DEPC (Sigma) gelado para nova centrifugação por 10 min a 7.500g a 4oC. Os
sobrenadantes das amostras foram descartados e ao sedimento foram adicionados 1ml de etanol absoluto (J.T.Baker) a -20oC e constatada a soltura do sedimento do fundo do tubo após agitação no Vortex, centrifugou-se a 7500 g a 4oC por 10 min. O sedimento obtido foi solubilizado em 40 µL de H20/DEPC, quantificadas em espectofômetro (NanoDrop-100
Spectrophotometer) através da relação da densidade óptica nos comprimentos de onda de 260nm e 280 nm. Alíquotas destas soluções de RNA foram ajustadas na concentração de 2µg/µl em H20/DEPC e estas foram mantidas congeladas a -80o C até o momento do uso.
A extração do RNA das células uNK isoladas seguiu o mesmo procedimento, exceto quanto à etapa da precipitação do RNAtotal, sendo adicionado 1,5µl de acrilamida linear (20µg/ml) para obter uma maior eficiência na precipitação do RNAtotal.
3.5.2 – CÉLULAS DISSECADAS NO LCM
Para a extração de RNA total das 200 células dissecadas de cada amostra obtida no LCM, seguiu-se o protocolo do fabricante do PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus Biosciense, Mt View, CA).
3.6 – QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DO RNA TOTAL
Para verificar a integridade do RNA total obtido em 3.3, 2,0µL das amostras 3.5.1 foram incubadas por 10 minutos a 65ºC em uma solução tampão composta por: 3,0µL de MOPS (10x) (3-[N-morpholino]propanesulfonic acid), 5,0µL de formaldeído (Sigma), 12,5µL de formamida (Sigma), 2,5µL de brometo de etídeo (EtBr) + tampão de corrida (Loading buffer). Ao término deste tratamento, incubou-se por 2 min a 0 ou 4ºC
As amostras foram corridas em um gel desnaturante utilizando 1% de agarose (LGC Biotecnologia – Biologia Molecular/ Grupo Ciambarella) em 41,5 mL DEPC, 5 mL MOPS 10%, 3,5 ml de formaldeído, a 65V por 45 min em uma cuba de eletroforese. Para a captura de imagem digital da banda utilizou-se o fotodocumentador Image Master VDS – Pharmacia Biotech para observar a integridade do RNAtotal.
3.7 – SÍNTESE DE cDNA
3.7.1 - MATERIAIS DO HOMOGENADO E DAS CÉLULAS ISOLADAS
A partir de 2µg de RNA total obtido em 3.3, foram obtidos os cDNA utilizando-se o kit SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) adotando-se os procedimentos recomendados nas instruções do fabricante.
3.7.2 – MATERIAIS DO LCM
Foram utilizados 5µl de cada amostra de RNA total obtido em 3.5.2 como molde para a transcrição reversa. A síntese de cDNA foi realizada de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante do Kit QuantiTect Whole Transcriptome (Qiagen) para amostras com concentração reduzida de RNA, adotando a incubação final para a amplificação do cDNA de 8 horas a 30oC.
Para a quantificação do cDNA no espectofotômetro GeneQuant Pro (AmershanPharmac Biotech, Cambridge, Inglaterra), as amostras foram diluídas 1:50. Para confirmar a qualidade do cDNA sintetizado, foram realizadas reações de PCR em tempo real (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) utilizando-se um par de primers específicos para o gene β-actina de expressão constitutiva e, como molde, os cDNA sintetizados. Utilizou-se o QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen) em um volume final de 20ul,
reações foi de 95ºC por 10 seg., 58ºC por 5 seg., e 72ºC por 20 seg. A curva de desnaturação foi programada de 70ºC-95ºC a uma taxa de 0,1ºC por seg., e a última etapa de resfriamento de 40ºC.
3.8 - REVERSE TRANSCRIPTASE - POLYMERASE CHAIN REACTION SEMI- QUANTITATIVO (RT-PCR)
3.8.1 – CONFECÇÃO DOS “PRIMERS”
Para o RT-PCR semi-quantitativo foram utilizados os pares de primer sense e anti- sense específicos para os genes de camundongos de: IL-15, IFN-γ, Perforina, Granzima A, IL-18, IL-6, Fas, DAP-12, TNF-α, FasL, IL-2 e β-actina.
Alguns dos primers utilizados foram baseados em seqüências descritas na literatura, enquanto outros foram desenhados a partir da confirmação da adequação da seqüência proposta utilizando o banco de dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Utilizaram-se os programas Primer 3 e o Primer Express versão 2.0 (Apllied Biosystems), Operon Molecules for life. As principais características dos primers desenhados pelo programa foram: apresentar quantidade de CG entre 45 e 65%, não permitir a formação de dímeros, ou estrutura secundária e apresentar temperatura de anelamento (Tm melting temperature) entre 58 e 60oC de acordo com o algarítimo nearest neighbor (BRESLAUER et al., 1986). Além disso, a fim de evitar uma eventual co-amplificação de DNA genômico contaminante, a maior parte dos pares de primer foi desenhada em exons diferentes. Para
confirmar se estes primers eram específicos para o gene alvo, foram verificados no Gene Bank do NCBI e/ou UCSC Genome Bioinformatics Site (http://genome.ucsc.edu/) utilizando o programa de alinhamento computacional BLAST e BLAT, respectivamente. As seqüências dos primers IL-15, IFN-γ, Perforina, Granzima A, IL-18, IL-6, Fas, DAP-12, TNF-α, FasL, IL-2 e β-actina, foram confeccionadas pelas empresas Imprint do Brasil ou Sinapse Biotecnologia conforme constam na tabela 1.
3.8.2 – Amplificação dos transcritos - PCR
Para o PCR foram utilizados o Kit Taq-DNA polimerase (Invitrogen) com protocolo ajustado para uso de volume final de 10µL para cada reação, no termociclador (GeneAmp PCR System 9700 – Applied Biosystems). Os ajustes no protocolo visaram a realização da reação na concentração final de 1x para o tampão de reação da enzima Taq (Invitrogen), 1,5mM de MgCl2, 0,2mM de dNTP (1,2MmM, Invitrogen), 3 pmol/ul dos primer sense e
anti-sense, 1 µl da enzima Taq Polimerase e 0,6 µl cDNA.
O programa de ciclagem utilizado nas reações foi de 94oC por 2 min, número de ciclos foi correspondente à padronização da curva de ciclagem de cada primer realizado a 94oC por 45 seg., Tm por 45 seg. e 72oC por 1 min e, após os ciclos, 72oC por 5 min.
O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose de 1 e 3,0%, para os amplicons ≥ 250pb e ≤ 249pb, respectivamente, e este foi corado com brometo de etidio. Alíquotas de 3µL do produto de PCR em 3.3.3.2 e 0,5µL de Loading buffer foram aplicadas no gel. As corridas foram realizadas no aparelho de eletroforese (Bio-raid Laboratories) a 75 volts. Utilizou-se 6µL marcador λ-Hind III (1mg/12µL) ou 2µL de TrackI100bp DNA Ladder (Invitrogen) como referência.
Para a captura de imagem digital da banda e a análise densiométrica utilizou-se o fotodocumentador Image Master VDS – Pharmacia Biotech e o programa Image Master VDS Software – Pharmacia Biotech, respectivamente.
3.8.2.2 – OTIMIZAÇÃO DA TEMPERATURA DE ANELAMENTO E NUMERO DE CICLOS PARA PCR
A partir dos dados de temperatura de anelamento (Tm) fornecidos pelo fabricante para cada primer (sense, anti-sense) testaram-se as melhores condições de temperatura para otimização das amplificações no PCR (Tabela 2). O número ideal de ciclos de cada conjunto de cDNA/primer foi estabelecido a partir da obtenção da curva de saturação da reação com o kit de Taq-polimerase (Invitrogen) utilizado, procurando-se os ciclos correspondes a 75% do valor arbitrário do platô. Para o estabelecimento desta curva foram realizadas reações de PCR para cada gene de interesse, sendo 8 amostras do animal controle e 8 amostras do animal tratado, coletando-se amostras com intervalos de 3 ciclos a partir do 18º ciclo até o 39º ciclos e analisadas em eletroforese de gel de agarose para
conferir o tamanho do amplicon. Através da densitometria das respectivas bandas (vide item 3.5.3) gerou-se a curva de saturação e determinou-se o número de ciclos ideal para as análises comparativas para cada gene em estudo.
3.8.2.3 – ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE E QUANTIFICAÇÃO DO PRODUTO DO PCR
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose de 1 e 3,5%, para os amplicons ≥ 250pb e ≤ 249pb, respectivamente. Alíquotas de 3µL do produto de PCR e 0,5µL de Loading buffer foram aplicadas e as corridas realizadas no aparelho de eletroforese (Bioraid Laboratories) a 75 volts. Utilizou-se 6µL marcador λ-Hind III (1mg/12µL) ou 2µL de TrackI100bp DNA Ladder (Invitrogen) como referência e corados com brometo de etídio (0.5µg/ml ).
Para avaliar comparativamente as amostras das expressões dos genes em estudo, os valores da densidade ótica (DO) de cada um dos genes de cada amostra foram divididos pela DO correspondente da β-actina adotado como controle interno. Paralelamente foi calculada a média do DO das amostras de cada lote experimental e estas foram comparadas. Para a captura de imagem digital da banda e cálculo da análise densitométrica utilizou-se o fotodocumentador Image Master VDS – Pharmacia Biotech e o programa Image Master VDS Software – Pharmacia Biotech, respectivamente.
submetidos às análises estatísticas ANOVA para avaliar as significâncias das diferenças entre as amostras seguida pela análise estatística Tukey.
3.9 - PCR EM TEMPO REAL
3.9.1 – PRIMERS
Para o RT-PCR em tempo real foram utilizados os pares sense/anti-sense de primer específicos para camundongos de: TNF-α, DAP12, IFN-γ. Estes foram desenhados segundo os critérios do item 3.8.1 (Tabela 1).
3.9.1.1 - DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DOS PRIMERS
Reações de PCR quantitativo, contendo 0,05 pmol de primer, foram realizadas utilizando-se como templantes uma mistura de cDNA provenientes de todas as amostras de células uNK isoladas pela microdissecção a laser. Esta mistura de cDNA foi diluída em série (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9). A análise de regressão linear dos valores de Cps em função do logaritmo da respectiva diluição forneceu o coeficiente angular da reta (a, em y=ax+b) que foi utilizado para cálculo da eficiência do produto pelos primers, na seguinte fórmula que o software RealQuant 1.01 (Roche Diagnsotics, Lval, OC, Canada) gerou:
Ef(%) = (Ef-1)x100
O coeficiente do gene endógeno, β-actina, foi comparado com todos os coeficientes de eficiência dos genes alvos.
Após a obtenção de todas as padronizações executou-se PCR em tempo real para todos os genes em duplicatas de todas as amostras para minimizar o erro experimental.
A quantificação relativa foi analisada utilizando o método de “Secound Derivate Maximum” no software RealQuant LightCycler 01 (Roche Diagnsotics, Lval, OC, Canadá). A razão das expressões entre os genes alvos e a β-actina foram consideradas como sendo a relativa expressão do mRNA. As eficiências dos primer foram calculadas para garantir que o primer fosse adequado na comparação da transcrição dos genes.
3.9.2 – PCR QUANTITATIVO EM TEMPO REAL
As reações de PCR em tempo real foram realizadas em duplicata nas amostras obtidas em 3.7.2, utilizando o QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen) em um volume final de 20µl, contendo os primers sense/anti-sense 0,5pmol/µl e 2 µl d cDNA. Todas as amplificações foram realizadas no aparelho Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada, com os ajustes de ciclagem em: desnaturação à 95ºC por 10 seg., 58ºC por 5 seg, e 72ºC por 20 seg. (anelamento dos primers e elongação)(a abreviação de segundos tem ou não o ponto seg.). A curva de desnaturação foi programada de 70ºC-95ºC uma taxa de 0,1ºC por seg., e a última etapa de resfriamento de 40ºC. Foram realizados, também, controles da
amplificação na ausência de molde (cDNA), denominado NTC (Non Template Control) e o controle positivo a Stardat Curve.
Foi definido um threshold cycle (ciclo onde a fluorescência se encontra estatisticamente acima do background) de 0,03 na fase exponencial de amplificação do gene a partir de intersecção deste com a curva de amplificação e se obteve os Crossing point (Cp: definido como sendo o ponto em que a fluorescência aumenta logo acima do background da fluorescência) das amostras, usando o software LightCycler 3.5 (Roche Molecular Biohemicals). A quantificação das amostras foi realizada usando a β-actina como controle endógeno (housekeeping).
Em experimentos de PCR em tempo real deve-se considerar a possibilidade da variação da concentração inicial de cDNA na análise dos dados provenientes de duas ou mais amostras. Desta forma, para que os dados possam ser comparados, é necessário que estes sejam previamente normalizados, ou seja, a expressão do gene alvo foi determinada em função da expressão do gene controle.
4 – RESULTADOS
4.1 – ANÁLISE MORFOLÓGICA
As análises histológicas dos fragmentos uterinos coletados dos sítios de desenvolvimento embrionário de animais em gestação normal demonstraram que os tecidos e estruturas são correspondentes à região mesometrial. Estes fragmentos continham o endométrio e o miométrio (fig. 1a) isentos de embrião ou anexos fetais, que pelo plano de dissecção eram mantidos na metade anti-mesometrial de cada sítio de desenvolvimento embrionários.
Pela reação citoquímica, constatou-se a presença de células lectina DBA positivas, correspondentes às células uNK, amplamente distribuídas no interior da região dissecada (fig 1b). Baseado nestas observações, adotou-se este plano de dissecção para todas as coletas dos sítios de desenvolvimento embrionário, tanto do útero de camundongos no 9º dg normais, quanto dos grupos experimentais submetido à lesão cirúrgica do embrião (LCE), assim como, nas amostras utilizadas para o isolamento das células uNK.
4.2 – AVALIAÇÃO QUALITATIVA E QUANTITATIVA DO RNA TOTAL EXTRAÍDO DO HOMOGENADO TECIDUAL DO ÚTERO E DAS CÉLULAS uNK ISOLADAS
4.2.1 - HOMOGENADOS TECIDUAIS DO ÚTERO
As extrações de RNA totais realizadas na região mesometrial dissecadas de três sítios de desenvolvimento embrionário de cada um dos animais tanto em gestação normal no 9º dg, quanto dos grupos pós-LCE, apresentaram concentrações variadas (tabela 3) de acordo com as leituras espectrofotometricas em λ= 260nm e 280 nm. As amostras com razão 260/280nm inferior a 1,6 foram descartadas para as análises subseqüentes, assegurando-se,
As eletroforeses do RNA total destas amostras em gel de agarose demonstraram