Este trabalho é dedicado aos meus pais: Jorge e Toyomi
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que sempre me estimularam e que me deram
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condições para eu estar aqui neste momento.
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As minhas irmãs, Karin, Carla e Theri que s
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As minhas irmãs, Karin, Carla e Theri que s
As minhas irmãs, Karin, Carla e Theri que sempre
empre
empre
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estiveram ao meu lado, me apoiando sempre.
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E a minha
E a minha
E a minha
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( (
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avó,
avó,in memorian)
avó,
in memorian)
in memorian)
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a todos os seus ensinamentos...
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A eles sou eternamente grata.
A eles sou eternamente grata.
A eles sou eternamente grata.
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“Não importa quantos passos você deu para trás, o importante
“Não importa quantos passos você deu para trás, o importante
“Não importa quantos passos você deu para trás, o importante
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é quantos passos agora você vai dar para frente.”
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é quantos passos agora você vai dar para frente.”
Santo Agostinho
Santo Agostinho
Santo Agostinho
Santo Agostinho
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia, UNICAMP, por permitir acesso ao conhecimento.
À FAPESP e ao CNPq, pela concessão da bolsa de mestrado, que propicionaram a execução deste trabalho (Processo 06/53143-0)
Aos Laboratórios Citoquímica, Imunocitoquímica e Criométodos e ao Laboratório Genômica e Expressão onde este trabalho foi realizado.
Ao meu orientador, Prof. Áureo Tatsumi Yamada pela oportunidade de cursar o mestrado, pela orientação nos momentos difíceis e preocupação à minha formação acadêmica e até pessoal. Pelo exemplo de seriedade, dedicação, segurança e profissionalismo. Pelas inúmeras oportunidades que me proporcionou nestes três anos de convivência, por me dar liberdade de seguir os meus passos e estimular minha vida científica de uma maneira muito especial, por saber dar valores, por fazer os meus olhos brilharem, pela amizade, pela inestimável convivência e simplesmente por acreditar em mim. Muito obrigada.
Ao Prof Paulo P. Joazeiro, pela amizade, pela dedicação e preocupação à minha formação acadêmica e pessoal. Por ter me inserido e encaminhado ao Prof Áureo, quando eu estava mais perdida durante a época da graduação.
Ao Prof Dr. Gonçalo Amarante G. Pereira, pela amizade, pelos ensinamentos na área da Biologia Molecular, ao acesso do Laboratório Genômico e Expressões para a realização deste trabalho, pela atenção concedida e pelos momentos descontraídos.
Ao Prof Fernando Costa, que permitiu o meu acesso ao Hemocentro/UNICAMP para a utilização de equipamentos para a realização deste trabalho.
Ao Prof Chandrakant Tayade, pela maneira que me acolheu em seu laboratório, dando toda atenção e incentivo que proporcionaram a execução de parte de nossos trabalhos.
À Profa Lúcia Elvira Álvares, pela amizade, pelas sugestões para superar as dificuldades e pela atenção concedida.
Aos membros da pré-banca: Profa. Dra. Silvia Daher, Profa. Dra. Wirla Maria Silva Cunha Tamashiro e Prof Dr Gonçalo Amarante G. Pereira pelas sugestões feitas na análise prévia deste trabalho.
À amiga Ana pela orientação inicial, por ter cedido e dividido a sua bancada comigo por 3 anos. Muitas horas de conversas, conselhos e amizade verdadeira nesta caminhada.
Às amigas Nicola, Joselyn e Sonya, pelo apoio para realização de parte deste trabalho, pela enorme paciência e por proporcionar meu rápido entrosamento no laboratório, no departamento. Pelos ótimos momentos que vocês me proporcionaram durante a minha estadia em Guelph, jamais esquecerei.
À Profa Maria Alice da Cruz –Höfling, Profa. Sarah Arana, Profa. Ivanira José Bechara, Profa. Carla Beatriz Collares Buzato e Prof. Luis Antônio Violin Dias Pereira pela agradável convivência, apoio e terem participado de inúmeras maneiras da minha formação acadêmica.
Aos funcionários do DHE/IB/UNICAMP, Baltazar, Marta, Raquel pelo auxílio técnico e convivência.
Ao técnico do DHE/IB/UNICAMP, Juvani, pela amizade, pela enorme eficiência e pelo carinho.
À secretária do DHE/IB/UNICAMP Rita que sempre me ajudou com muita simpatia, do DBC/IB/UNICAMP, Lílian pelo carinho nos momentos difíceis e por toda a sua compreensão e do “Biomedical Science Institute. OVC. University of Geulph, Canadá”, Kim Best pelo carinho, pela calorosa recepção na minha chegada em Guelph, pelas caronas nos dias frios e pela amizade. E a Frances pelo carinho e simpatia.
Aos técnicos do “Biomedical Science Institute. OVC. University of Guelph, Canadá” pela convivência e colaboração para realização de parte deste trabalho.
Aos amigos Vini, Helena, Patrícia pelas inúmeras ajudas e conselhos nos experimentos, pela amizade.
À Silva, Jorge Mondego, Javier, Ramon, Marcelo, Leandro pela amizade, pelos conselhos técnicos, pelo apoio para realização deste trabalho e principalmente nos momentos críticos nos experimentos.
À amiga Pati, pelo carinho, pelos conselhos, sinceridade, pela ajuda. Por ter estado ao meu lado sempre nesta jornada profissional e pessoal, muito obrigada pelo ombro amigo.
À amiga Marlúcia, pelo carinho, conselhos e amizade nesta caminhada.
Aos amigos Juares e Renata, pela enorme bondade, pelo carinho. Por ter estado e dado o apoio nas horas mais inseguras.
À amiga Claudinha, em tão pouco tempo fez a diferença nas nossas vidas no laboratório. Pelos inúmeros lanchinhos, pela enorme bondade e por ter estado ao meu lado em algumas noites e madrugadas. À amiga Petra, pela amizade, pelo carinho, pela alegria, pela sinceridade e pelas longas horas de conversas e conselhos.
Á amiga Marcia, pela amizade, pelo carinho, pela força. Por ter me acolhido muito bem no laboratório, pela orientação, pelos conselhos.
Aos amigos de departamento Didi, Julio, Aline, Carol, Eliana, Carla, Débora, Denner, Aline, Mariana, Leslivan (Levi!), Sílvio, Marília, Thalita, Renata pela amizade, pelo apoio e agradável convivência nos últimos anos.
Aos amigos do LGE, Silvia, Ramon, Jorge, Marcelo, Leandro, Javier, Dani, Isa, Paulo, Deyse, Marcela, Alinne, Lucas, Sula, Gleidson, Raissa, Carlinha, Ana Paula, Joan, Eliane, Andrea, Welbe pela amizade, pela cooperação e que me proporcionaram ótimos momentos no laboratório e fora dele também.
Aos queridos amigos Fabiana, Pati, Lú, Hellen, Carol, Sol, Dani, Nívea, Fernando, Li, Gustavo, Joseane, Robertinha, Marikota pela amizade, por estarem ao meu lado sempre. Àqueles com quem choro, lamento, dou risadas, faço festa, comemoro. Amigos intensamente presentes em minha vida.
Aos amigos Furtado pela amizade, carinho, acolhimento, apoio e compreensão.
As minhas irmãs Karin, Carla, Theri e meu cunhado Ricardo que sempre me ajudaram em tudo nesta minha árdua caminhada desde a minha vinda a Campinas e agora no final, na conclusão desta tese. Muito obrigada, sempre!
Aos meus pais Jorge e Toyomi. Agradeço não só por tudo que significam em minha vida, por todo o carinho, amor, dedicação, entrega e sacrifícios por esses anos, mas principalmente, por terem acreditado em mim, por terem me dado a chance de ir atrás dos meus sonhos, mesmo que muitas vezes temessem que talvez este não fosse o melhor caminho.
Há sempre o receio e a real possibilidade de que alguém muito importante não tenha sido mencionado, uma vez que foram muitas pessoas envolvidas e que, de alguma forma, mesmo que não o saibam, contribuíram ao longo do desenvolvimento deste trabalho. Obrigada a todos que torceram por mim.
E aos camundongos que juntamente com as suas crias tiveram suas vidas sacrificadas para a realização deste trabalho.
Obrigada!!! Obrigada!!! Obrigada!!! Obrigada!!!
RESUMO
As células natural killer uterinas (uNK) atuam na modulação da interface materno-fetal e homeostasia do útero gestante, sem desencadear a atividade citolítica típica de uma resposta imune inata. Contudo, ao provocar uma lesão cirúrgica no embrião (LCE) ocorrem alterações no comportamento das células uNK de camundongos e possível indução da atividade citolítica. O presente trabalho avaliou a expressão gênica de mediadores relacionados tanto com a ativação, quanto efetores da atividade citotóxica das células uNK no útero gestante de camundongos frente à anomalia provocada pela LCE. Foram avaliadas as expressões dos genes perforina, granzima-A, IFN-γ, IL-15, IL-18, TNF-α, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L através do RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) semi-quantitativo, a partir do RNAtotal obtido de homogenados teciduais da região mesometrial (RM) dos sítios uterinos de camundongos no 9º dia de gestação normal e grupos de animais submetidos à LCE nos períodos de 0,5, 1, 2, 6, 12 e 24 horas pós-LCM e, de RNA obtido de células uNK isoladas de animais gestantes normais. Foram investigadas também as diferenças nas expressões dos genes DAP12, IFN-γ e TNF-α em RNA extraídos de células uNK imaturas e maduras microdissecadas de criocortes da RM pela microscopia de captura a laser (LCM) e avaliadas pelo qRT-PCR (quantitative Real Time-PCR). Os resultados do RT-PCR confirmam a expressão de todos os genes avaliados nos homogenados da RM e nas células uNK isoladas não foram detectadas apenas os genes da IL-15 e IL-2. Pela análise semi-quantitativa dos amplicons do RT-PCR os genes das proteínas citolíticas, granzima-A e perforina, juntamente com citocinas pró-inflamatórias IFN-γ e TNF-α apresentaram aumentos significativas em 1h após a LCE e redução para níveis próximos do animal normal nos períodos após 6h da LCE. O aumento na expressão destes genes relacionado com a resposta imune inata das células NK, sugere uma rápida mudança do comportamento das células uNK em resposta à LCE, cujas ativações podem envolver a expressão do gene DAP12 que também mostra tendências de aumento nos mesmos períodos pós-LCE. Por outro lado, a expressão dos genes IL-15, IL-2, IL-18 e IL-6 relacionada com a migração, proliferação e diferenciação das células uNK não teve uma variação significativa entre as amostras de gestação normal e pós-LCE. Do sistema Fas/FasL, a redução significante do FasL resulta na regulação negativa da indução de morte celular por apoptose das células uNK, podendo prolongar a viabilidade destas células no ambiente uterino alterado pela LCE. Estes resultados comprovam que a LCE induz uma rápida regulação positiva da expressão dos genes relacionados com mecanismos de citotoxicidade da resposta imune inata das células uNK. Pelas análises dos genes DAP12, TNF-α e IFN-γ através do qRT-PCR do RNA extraído de células uNK isoladas pela LCM identificaram-se diferenças nas expressões destes genes entre as células uNK imaturas e maduras classificadas atualmente por critérios morfológicos. As diferenças de expressões comprovam a ocorrência de subpopulações com heterogenidade funcional não atribuível apenas a subtipos de estágios de diferenciação celular e com possíveis domínios de distribuição específica no ambiente uterino.
Palavras chave: Células natural killer uterina, gestação anormal, homeostase uterina, interface materno-fetal, RT-PCR
Abstract
The uterine natural killer cells (uNK) actively modulate the maternal-fetal interface and homeostasis of pregnant uterus, without triggering the typical cytolytic activity of innate immune response. However, experimentally induced embryo lesion in the pregnant mouse uterus, changes the uterine homeostasis with commitment of uNK cell and possible induction of its cytolytic activity. The present work evaluated the gene expression of mediators related either to the activation and effectors molecules of uNK cells cytotoxic activity. It was evaluated the genes of perforin, granzyme-A, IFN-γ, IL-15, IL-18, TNF-α, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), using RNA isolated from normal pregnant mice uterus on gestational day (gd) 9 and after 0.5, 1, 2, 6, 12 and 24h of abnormal pregnancy provoked by surgical lesion of the embryo (SLE) and also from RNA obtained from uNK cells isolated from normal pregnant mice. Differences in the DAP12, IFN-γ and TNF-α genes expressions were also investigated with RNA isolated from immature and mature subtypes of uNK cells dissected from cryosections of mesometrial regions in the laser capture microscope (LCM) and evaluated by quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR). The results of RT-PCR confirmed the expression of all genes evaluated in the uterine tissue homogenates and in the uNK cells were not detected the only expression of IL-15 and IL-2 genes. By semi-quantitative analysis of RT-PCR amplicons, the genes of cytolytic proteins, granzymes-A and perforin all together with pro-inflammatory cytokines IFN-γ and TNF-α showed significant increasing at 1h after SLE and decreasing to the level near of normal pregnancy after 6h of SLE. The increasing expression of these genes related to innate immune response of NK cells suggest the quick changes of uNK cells behavior in response to the SLE, which activation could involve the expression of DAP12 gene that also showed increasing at the same period after SLE. On the other hand, the expression of IL-15, IL-2, IL-18 and IL-6 genes related to the migration, proliferation and differentiation of uNK cells did not showed significant differences among the SLE samples and normal pregnancy. The significant decreasing of FasL after SLE could down regulate the triggering of apoptotic cell death pathway in the uNK cells and therefore, increasing the viability of these cells in the uterine microenvironment affected by SLE. These results prove that SLE induces fast up-regulation genes expression related to the cytotoxic pathway of uNK cells innate immune response ability. Based on analysis of qRT-PCR of DAP12, TNF-α and IFN-γ genes performed with RNA obtained from uNK cells dissected in the LCM, it was identified differences in the expression of these genes between now a days classified as immature and mature forms of uNK cells. These expressions differences attest the occurrence of functionally heterogeneous subpopulations of uNK cells not restricted to the differentiation stages and possible specific distribution domains in the uterine environment.
Key words: Uterine-NK cell, pregnant uterus, uterine homeostasis, maternal-fetal interface, RT-PCR
Lista de acrônimos e abreviaturas
µm – micrômetro
BLAST - Basic Local Alignment Search Tool BLAT - BLAST-Like Alignment Tool
BSA – Albumina sérica bovina CD - cluster of differentiation
cDNA - DNA complementar (é o DNA sintetizado por uma molécula de RNA mensageiro numa reação catalizada pela enzima transcriptase reversa)
CEEA – Comitê de Ética na Experimentação Animal CSF-1 – fator estimulador de colônia-1
DC – células dendríticas
DEPC – DiEthylPyroCarbonate dg – dia de gestação
DNAse – enzima que degrada o DNA dNTP - Desoxirribonucleotídeos Fosfatados ELISA - Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EtBr – brometo de etídeo
FAS – receptor que induz a apoptose celular, expressos na superfície celular de células T e outros tipos celulares.
FASL – proteína que se liga no FAS h – horas
HLA - Human Leukocyte Antigens (Sistema de antígenos associados aos leucócitos humanos)
IFN-g – Interferon gamma IL - Interleucina
iNOS – óxido nitrico isoforma induzível KAR – killer activator receptor
Kg – kilogramas
LCM – Laser capture microdissection Lectina DBA – Lectina Dolichos biflorus LIF – fator inibidor da leucemia
LPS – lipoproteína lipase mg – miligramas
MHC – complexo principal de histocompatibilidade min. – minutos
MLAp- Agregado linfocitário mesometrial associado a gravidez MOPS – 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid buffer
MPC - magneto concentrador de partículas Nac Gal – N-acetil galactosamina
NCAM - Neural Cell Adhesion Molecule
NCBI – National Center for Biotechnology Infromation NK- Natural Killer
NO- oxido nítrico
o
.C – graus Celsius
PBS – tampão fosfato-salina pNK – células NK periféricas
qRT-PCR – quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction RM – Região mesometrial
RNA total – inclui: RNA transportador, RNA ribossomal, RNA mensageiro RNAm – RNA mensageiro
RT-PCR - Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction STAT – sinal de transdução e ativador de transcrição
TA – temperatura ambiente TBS – Tampão Tris-HCl salina Th – T helper
Tm - melting temperature
TNF-a – Fator de necrose tumoral-α uNK – Natural Killer uterina
ÍNDICE Página
Agradecimentos vii
Resumo ix
Abstract x
Lista de acrônimos e abreviaturas xi
1. Introdução 1
2. Objetivos 15
2.1 Objetivos Específicos 16
3. Materiais e Métodos 19
3.1 Animais 20
3.2 Coletas e processamento dos materiais 20
3.2.1 Indução de lesão cirúrgica do embrião (LCE) 20
3.2.2 Processamento dos materias 21
3.2.3 Processamento histológico e citoquímica com lectina DBA 22
3.2.3.1 Embebição em parafina 22
3.2.3.2 Criocortes para LCM 22
3.3 Obtenção de células uNK isoladas 23
3.4 Captura de células a partir da microdissecção a laser 25
3.5 Extração do RNA e obtenção do cDNA 25
3.5.1 Homogenado uterino e das células uNK isoladas 25
3.5.2 Células dissecadas no LCM 27
3.6 Quantificação e avaliação do RNA total 27
3.7 Síntese de cDNA 28
3.8 Reverse transcriptase-protein-chain reaction semi-quantitativo (RT-PCR) 29
3.8.1 Confecção dos “primers” 29
3.8.2 Amplificação dos transcritos - PCR 30
3.8.2.1 Eletroforese em gel de agarose 30
3.8.2.2 Otimização da temperatura de anelamento e número de ciclos para PCR 31 3.8.2.3 Eletroforese em gel de agarose e quantificação do produto do PCR 32
3.9 PCR em tempo real 33
3.9.1 Primers 33
3.9.1.1 Determinação da eficiência dos primers 33
3.9.2 PCR quantitativo em tempo real 34
4. Resultados 37
4.1 Análise morfológica 38
4.2 Avaliação qualitativa e quantitativa do RNA extraído do homogenado tecidual do útero e das células uNK isoladas
38
4.2.1 Homogenados teciduais do útero 38
4.2.2 Células uNK isoladas 39
4.2.3 Padronizações das condições do PCR 39
4.3 PCR semi-quantitativo 40
4.3.1 Perfis de expressão no homogenado total da região mesometrial 40
4.3.2 Perfis de expressão nas células uNK isoladas 44
4.4 Microdissecção de células uNK no LCM 44
4.5 Síntese e quantificação do cDNA das células uNK obtidas no LCM e padronização das condições do qRT-PCR
45 4.6 QRT-PCR do RNA extraído das células uNK dissecadas a partir do LCM dos genes
DAP12, IFN-γ e TNF-α 45 5 Discussão 47 6 Conclusões 63 7. Anexos 67 8 Referências 95
1 – Introdução
Em meados do século passado, o imunologista Peter Medawar (1953 apud Billington W., 2003) apontou o enigma imunológico central da gravidez como um paradoxo: o organismo materno não rejeita o embrião alogênico, em oposição a um dos pilares da Imunologia: a capacidade do sistema imune de discriminar antígenos "self" e "non-self" (ABBAS et al 2003).
A gestação é uma condição fisiológica com mudanças nas respostas imunológicas e endócrinas, envolvendo interação entre os numerosos mecanismos promovidos pelas diferentes células presentes na interface materno-fetal, resultando na tolerância materna ao feto (HATTHACHOTE et al, 1999; LIN et al, 2000). Nesta interface, o trofoblasto protagoniza a invasão do endométrio e consolida a placenta hemocorial em roedores e primatas, incluindo humanos, num ambiente receptivo e favorável sob influência de diversos mediadores químicos de ação parácrina e endócrinas produzidos pelas diversas células de origem imune e não imune (LIN et al 2000; SAITO et al 2003; SAITO et al 2005; ZENCLUSSEN et al 2005).
Concomitantemente, o ambiente uterino no início da gestação, tanto em humanos quanto em roedores, favorece a migração e diferenciação de células Natural Killer (NK) com características peculiares e específicas da gestação (MOFFETT-KING A, 2002). De fato, em humanos, a população leucocitária predominante (70-80%) encontrada no primeiro trimestre na decídua são as células Natural Killer uterina (uNK) CD3 -/CD56bright+/CD16-, (VASSILIADOU et al, 1998; SLUKVIN et al, 1996) ao lado de populações minoritárias de linfócitos T, macrófagos e células dendríticas (DCs) somando, estas três últimas, ou 20% restantes (VASSILIADOU, 1998; SLUKVIN, 1996). Em camundongos ocorre igualmente a incidência de populações leucocitárias transitórias na decídua uterina sendo identificada a predominância das células uNK, em detrimento de outras populações leucocitárias (CROY et al 1997, PAFFARO et al 2003).
Dados experimentais demonstram a capacidade inequívoca das células uNK em produzir citocinas e fatores de crescimento que contribuem para a homeostase do ambiente uterino. Dentre as citocinas produzidas pelas células uNK estão a interleucina-1 (IL-1), o fator inibidor da leucemia (LIF), fator estimulador de colônia-1(CSF-1) (CROY et al
1991), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) (PARR et al, 1995), interferon-γ (IFN-γ) (CROY et al, 1993, PLATT & HUNT, 1997, PLATT & HUNT, 1998; ASHKAR & CROY, 1999), fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF) (WANG et al 2000) e óxido nítrico (NO) (TRANGUCH, 2003). Porém, inúmeras questões permanecem como um enigma na imunologia da reprodução. São elas: a) quais as razões que levam ao grande acúmulo de células uNK?; b) a célula uNK é um potencial efetor da resposta imune inata no ambiente uterino durante a gestação? e c) quais os mecanismos envolvidos na sua regulação?
Células NK no ambiente uterino durante a gestação
As células Natural Killer (NK) constituem uma classe de linfócitos envolvidas na imunidade inata promovendo uma primeira importante linha de vigilância imune. Elas são caracterizadas pela expressão de uma isoforma de molécula de adesão NCAM, a CD56, ausência de CD3, além de uma grande variedade de receptores de ativação que, estimuladas pelos ligantes específicos, desencadeiam a atividade citotóxica e/ou produção de citocinas e quimiocinas (MORRETA et al, 2004). Estas atividades das células NK também são reguladas pela expressão de receptores inibitórios que controlam os sinais mediados pelos receptores de ativação (MORRETA et al 2004; CHIESA et al, 2005).
As células NK são encontradas no sangue periférico (pNK) constituindo cerca de 10-15% dos linfócitos circulantes e nos órgãos linfóides secundários, de onde podem migrar para áreas infectadas ou com reações inflamatórias (FERLAZZO et al, 2004). As células pNK são representadas por dois subtipos diferentes: as CD56dim e CD56bright constituindo ~90 e 10%, respectivamente. O subconjunto maior (CD56dim) formado principalmente pelas células Killers é também CD16+ e perforina+ (MIAZA et al, 1993), nos quais, o CD16 tem alta afinidade com receptor FcRIII responsável pela citotoxicidade celular dependente de anticorpo (LANIER, 2003). E o subconjunto menor CD56bright produz e secreta principalmente citocinas.
recrutadas para o sítio de implantação do embrião, constituindo o tipo celular dominante das células imunes materna na decídua basal a partir do início da gestação (MOFFETT-KING, 2002) e diminuindo em número após o terceiro trimestre da gestação. As células NK presentes no útero são diferentes tanto fenotipicamente quanto funcionalmente das células NK periféricas (pNK).
Estudos de imunofenotipagem e funcionalidade revelaram que as células uNK se assemelham às células pNK, porém, apresentam algumas diferenças. Primeiro, quanto à diferença na quantidade de células: 15% dos linfócitos circulantes são células NK, enquanto as células uNK representam ~80% do número total das células imunes presentes no ambiente uterino. Segundo, quanto aos estudos de microarranjos: 3% dos 10.000 genes estudados apresentaram diferenças significativas entre as células pNK e uNK (KOOPMAN et al, 2003). Terceiro, quanto às diferentes subpopulações de células NK definidas pela expressão de CD56/CD16, as células uNK sendo CD56bright CD16dim(COOPER et al, 2001) apresentando baixa atividade citotóxica e elevada produtoras de citocinas. Tais características consubstanciam a hipótese de que as células uNK pertencem a uma subclasse de células NK distinta das periféricas. As diferenças entre as pNK e as uNK sugerem fortemente que estas últimas possam exercer funções diferentes das pNK, relacionadas com a manutenção da homeostasia da interface materno-fetal no útero gestante, promovendo a angiogênese, a manutenção da decídua e o desenvolvimento da placenta (ASHKAR et al, 2003).
Em camundongos não foram caracterizados os receptores homólogos das CD56, porém, as uNK apresentam glicoproteínas de superfície celular reativas à lectina DBA (Dolichos biflorus), enquanto as pNK não expressam tais glicoproteínas (PAFFARO et al, 2003).
Os estudos realizados em diversas linhagens de camundongos imunodeficientes, transgênicos e knockout têm contribuído substancialmente para avaliar a participação das células uNK na gestação. Tem sido sugerido que as células uNK se originam de linfócitos precursores oriundos tanto da medula óssea (PEEl et al, 1983), quanto de órgãos linfóides secundários (CHANTAKRU et al 2001, 2002). As células uNK migram para proliferar e se diferenciam no estroma endometrial da região mesometrial de cada sítio de implantação embrionária (PEEl et al, 1983, STEWART, 1984, PAFFARO et al, 2003). Uma área
restrita da região mesometrial, junto ao miométrio, que também acumula as células uNK em roedores é denominada de agregado linfocitário mesometrial associado à gravidez (MLAP – mesometrial lymphoid aggregated to pregnancy) (CROY, 2000). O restante do endométrio compreende a decídua basal a partir da segunda metade da gestação em camundongos. Neste local, as células uNK de camundongo são passíveis de serem identificadas a partir do 5º dia de gestação (dg) (ASHKAR et al 2003, PAFFARO et al, 2003) como células linfóides pequenas, sem grânulos ou acúmulo de glicogênio no citoplasma (PAFFARRO et al, 2003). Entre o 9o e o 12o dg ocorre a maior concentração destas células na sua forma diferenciada (PEEL, 1989; DELGADO et al, 1996, PAFFARO et al, 2003). As células uNK plenamente diferenciadas são identificadas como células globosas com 20 a 50 µm diâmetro, ocasionalmente binucleadas e contêm inúmeros grânulos citoplasmáticos (PARR et al, 1990a; PAFFARO et al, 2003). O conteúdo destes grânulos tem sido caracterizado como semelhante ao das demais células NK, sendo identificadas as perforinas, granzimas, proteoglicanas e uma gama variada de enzimas hidrolíticas lisossomais tanto em roedores (PARR et al, 1990; COPI 2006), quanto em humanos (KONNO et al, 1999; RUKAVINA et al, 2000; SAKAI et al, 2004) que constituem o arsenal citolítico em potencial para atuar na resposta imune do tipo inata. Após o 12o dg inicia-se um gradual declínio na incidência desta população celular que prossegue até o fim da gestação desaparecendo no útero pós-parto (CROY et al, 1997, PAFFARO et al, 2003).
A perforina é a mediadora citolítica principal dos linfócitos T citotóxicos e das células NK (LIU et al, 1995; CROY e KASSOUF, 1989; PARR et al, 1990). Estudos que envolveram a ativação das células pNK por IL-2 e IL-12 (LENHMANN et al, 2001) demonstraram o aumento da ligação de perforina com a célula alvo e conseqüentemente o aumento da lise pela ação desta molécula citotóxica. Com relação às células uNK esperava-se igual competência funcional das pNK, porém as uNK não medeiam espontaneamente a lise da célula alvo em ensaios citolíticos comumente utilizado para pNK (CROY e KASSOUF, 1989; PARR et al, 1990). Em humanos, esta baixa citotoxicidade natural apresentada pelas uNK tem sido atribuída a baixa expressão do receptor CD16 em relação às pNK, cujo estímulo induz a atividade lítica das NK (BIASSONI et al, 1999). Por
comprovam a atividade citotóxica das células uNK na gestação. Tal fato deve-se à dificuldade na obtenção de materiais humanos na gestação normal e, sobretudo em situações que antecipem uma perda gestacional.
As células NK possuem receptores que induzem tanto a inibição, quanto a ativação das funções relacionadas com as respostas imunes. No camundongo o receptor Ly49 e no humano o receptor KIR (killer inhibitory receptor) são produtos da família de genes de receptores de células NK que reconhecem os antígenos MHC de classe I. A ativação do receptor NKG2D (formalmente conhecido por KLRK1), constitutivamente expressa em todas as células NK de camundongo e em humanos, promove a sinalização através de DAP12 e DAP10 que resulta na produção de citocinas e na citotoxicidade destas células (GILFILLAN et al, 2002; DIEFENBACH et al, 2002). DAP12 é uma molécula homodemérica transmembrana do tipo-I ligada por pontes de sulfeto (type I transmembrane disulphide-linked homodimer) com um segmento ITAM na sua porção citoplasmática (LANIER et al, 1997) . O segmento ITAM associado com múltiplos receptores de ativação das células NK, incluindo LY49D e Ly49H (KLRA8), CD94/NKG2C (KLRD1/KLRC2)e CD94/NKG2E (KLRD1/KLRC3) em camundongo e KIR2DS2, CD94/NKG2Ce NKp44 em humanos (LANIER et al, 2000; SMITH et al, 1998). A associação de DAP12 com estes receptores de ativação é essencial para fosforilação de DAP12 em seguida à mobilização de cálcio intracelular levando a produção de citocinas e ativando a citotoxicidade desta célula (ORTALDO et al, 1999). Experimentos realizados por Xie e colaboradores (2005) demonstraram que a via de ativação nas células uNK dependia mais do DAP12 do que do Dap10 quando estimulado com anticorpos FcRγ/CD3ζ havendo um aumento na expressão de IFN-γ e da sua citotoxicidade.
O mecanismo molecular geral que permite as células NK reconhecerem as células alvos e ativarem sua ação citotóxica baseia-se na expressão de um repertório de proteínas transmembrana que atuam como receptores inibidores KIR e/ou ativadores KAR (killer activator receptor), presentes em sua superfície (LAINER, 1998a). O repertório completo não é conhecido, porém, as células uNK de humanos expressam os receptores KIR, os quais reconhecem como ligantes as moléculas dos HLA-G e HLA-E do MHC-II não clássicas expressas pelo trofoblasto (LAINER, 1998). Esse reconhecimento entre as células uNK e o trofoblasto constitui o principal mecanismo conhecido envolvido na tolerância
materno-fetal, pelo qual a mãe controla a implantação da placenta alogênica (KING et al, 2000), uma vez que esta interação é do tipo inibidora da atividade citolítica. A molécula Ly-49 é o receptor correspondente do KIR expresso em camundongos e provavelmente deve estar envolvida no reconhecimento das células trofoblásticas, sem induzir a atividade citotóxica das uNK nesta interação (KING et al, 2000). Embora seja atraente a hipótese do envolvimento das células uNK nas ocorrências de anomalias de gestação resultando em abortos ou interrupções da gestação, não se tem relatos experimentalmente comprovados sobre o envolvimento destas células.
Por outro lado, vários relatos salientam que as células uNK atuam favoravelmente para o desenvolvimento pleno da gestação, contribuindo, entre outros, com o desenvolvimento da placenta (CROY et al, 2003a), na manutenção da decídua, na angiogênese da interface materno-fetal (GUIMOND et al, 1999) e no controle da invasão do trofoblasto (MOFFETT-KING, 2002). As células uNK seriam ainda responsáveis pela modulação da resposta imune adaptativa e na regulação da homeostase do ambiente uterino pela produção significativa de citocinas (SAITO, 1993).
As células uNK têm a capacidade de produzir inúmeras citocinas, que podem também ser produzidas pelas células do embrião, linfócitos periféricos, macrófagos, células endometriais, etc. As citocinas atuam como moduladores da resposta imune, mas com ações peculiares na gestação (SCHAFER-SOMI, 2003). Dentre as citocinas produzidas pelas células uNK estão: a interleucina -1 (IL-1), fator inibidor da leucemia (LIF), CSF-1 (CROY et al, 1991), fator de necrose tumoral-α (TNFα) (PARR et al, 1995), interferon-γ (IFN-γ) (CROY e KISO, 1993; PLATT e HUNT,1997; PLATT e HUNT, 1998; ASHKAR e CROY, 1999), fator de crescimento de endotélio vascular (VEGF) (WANG et al, 2000) e óxido nítrico (NO) (TRANGUCH et al, 2003).
Mediadores da interface materno-fetal
Durante a gestação em humanos, as células trofoblásticas que revestem o embrião alogeneico invadem a decídua materna, sem que ocorra a ativação do sistema imune
permite a completa compreensão da biologia da gestação normal e suas implicações relacionadas com a gestação e patologias ainda são limitadas (LOBO et al, 2004; KRISTINA et al, 2001). Dados experimentais indicam que citocinas desempenham um papel importante na manutenção da gestação, modulando sistemas imunológico e endócrino (SAITO et al, 2000; TROWSDALE et al, 2006). E devido à expressão de genes paternos, o feto e a placenta têm sido tradicionalmente considerados como sendo análogos a aloenxertos e, portanto, sujeitos a rejeição como em um órgão transplantado (TANGRI et al, 1993). No entanto, esta resposta não se observa no decurso de uma gestação normal.
Citocinas é um termo genérico empregado para designar um extenso grupo de moléculas envolvidas na emissão de sinais entre as células durante o desencadeamento das respostas imunes, regulando a intensidade, a duração desta resposta, recrutando células efetoras para as áreas onde se desenvolvem respostas e induzir a geração e maturação de novas células a partir de precursores (CAVAILLON et al, 2005). As citocinas podem induzir efeitos diferentes sobre as mesmas células alvos separadamente ou simultaneamente no tempo. Podem também influir na ação de outras citocinas de forma antagônica ou sinérgica. Estes fatores podem ser produzidos por diferentes tipos celulares como monócitos, macrófagos, linfócitos e outras que não sejam leucócitos (CAVAILLON et al, 2005).
As citocinas têm uma variedade de funções no sistema reprodutivo, participando no recrutamento de leucócitos durante a implantação na angiogênese e remodelação das artérias espirais, na decidualização, na implantação do embrião e na manutenção do ambiente uterino como um todo. A produção de citocinas no endométrio pode ser diretamente regulada pelos hormônios esteróides durante a gestação, ou indiretamente pelos processos como a fertilização, a implantação, o crescimento do útero e na defesa imune (KELLY et al, 2001).
Mosmann e colaboradores (1986) classificaram as células T helper CD4+ em dois tipos celulares quanto a sua atividade e secreção de proteínas. As células Th1 produzem IL-2, IFN-γ e TNF-α, como células efetoras da resposta imune, enquanto as células Th2 secretam IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, estando envolvidas na produção e supressão de anticorpos. Esta nomenclatura foi posteriormente estendida e adaptada para as células T CD8+ que foram classificadas em TC1 e TC2 pelo perfil de citocinas produzidas.
Higuma-Myojo e colaboradores (2005) propuseram que as células NK também poderiam ser classificadas de NK1, NK2, NK3 e NKr1 de acordo com perfil de citocinas produzidas. Devido a estas classificações, o conceito ampliado para os termos Th1 e Th2 estão também relacionados às categorias de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias, além dos tipos celulares que as produzem.
De acordo com Lauwerys e colaboradores (1999) e Saito (2003) o balanço e a relação entre as citocinas Th1 e Th2 presentes na interface materno-fetal são os fatores determinantes para o sucesso da gestação ou a sua interrupção. O paradigma do balanço Th1/Th2 preconiza que as citocinas do tipo Th-1 (IFN-γ, TNF-α, interleucina-2 (IL-2)) induzem a imunidade celular ativando e aumentando a atividade citotóxica de macrófagos, os linfócitos T CD8+ e das células NK, enquanto as do tipo Th-2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, IL13) induzem a resposta imune humoral com produção de anticorpos (SAITO et al, 2003). Ainda neste paradigma Th1/Th2 sugere-se que o estabelecimento de uma gestação é caracterizado pelos baixos níveis de citocinas Th1 (IFN-γ e TNF-α), que em níveis elevados seriam abortivos em uma variedade de modelos animais, inclusive em humanos. Experimentos em ratos sugerem que o sucesso de uma prenhez deve-se a dominância de citocinas do tipo Th-2 (LIN et al, 2000), enquanto que a prenhez anormal (aborto, restrição de crescimento) ocorreria devido ao aumento das citocinas Th-1 (WEGMANN, 1987).
No entanto, a relação materno-fetal não se resume simplesmente a uma tolerância materna para um tecido estranho. Envolve uma série de intricadas interações mútuas de citocinas e células, que regem o sistema imune regulando-o no diálogo materno-fetal (MOFFETT-KING, 2002; CHAOUAT et al, 2002). Wu e colaboradores (2006) mostraram que as citocinas Th1 não podem ser ignoradas no sucesso de uma gestação, pois seus representantes como as citocinas IFN-γ e TNF-α produzidas pelas células uNK embora consideradas citocinas abortíferas, também são muito importantes na remodelação das artérias espirais no início da gestação, mantendo a integridade da decídua em camundongos. Níveis normais de TNF-α combinado com doses elevadas de IFN-γ são compatíveis com a prenhez saudável em camundongos.
Assim, tanto citocinas Th1 pro-inflamatórias, como as citocinas Th2 antiinflamatórias, podem determinar o sucesso ou o insucesso da gestação, e o paradigma
gestação, não se coaduna com os conhecimentos atuais. O conceito de complementaridade e cooperação entre as citocinas Th1/Th2 é mais condizente com a realidade (SAITO et al, 2003; BELARDELLI et al, 1995)
As células do endométrio produzem uma citocina chave para a diferenciação e crescimento das células uNK: a interleucina 15 (IL-15) (YE et al, 1996; 2000, KITAYA et al, 2000, OKADA et al, 2000). Esta citocina foi a primeira referida como fator de crescimento das células T e posteriormente, como sendo essencial para o desenvolvimento das células NK (MROZEK et al, 1996). No útero de camundongo a transcrição de IL-15 precede a decidualização, sendo em humanos detectados tanto o RNA mensageiro quanto a proteína da IL-15 no endométrio não-gradívico, decídua e placenta. Além disso, foi detectada também a sua presença nos macrófagos uterinos, células estromais, âmnio e corion (VERMA et al, 2000; YE et al, 1996, KITAYA et al, 2000; ZOUBAS et al, 2001). Estudos recentes demonstraram que IL-15 é absolutamente essencial para o suporte da diferenciação das células uNK no útero em decidualização (ASHKAR et al 2003), regulação positiva da expressão de perforinas e granzimas (LIU et al 1989), sem contudo induzir sua atividade citotóxica (VERMA et al, 2000, YE et al, 1996 e ALLEN et al, 1998). Análises dos sítios de implantação de camundongo IL15-/- revelam que a completa ausência de células uNK, assim como, em patologias com ausência total de células uNK, resultam na não modificação das estruturas das artérias espirais, desenvolvimento reduzido da decídua e a ausência do desenvolvimento do MLAp no interior da cavidade uterina. Isto compromete a viabilidade do feto ou sobrevivência pós-natal.
Durante a gestação normal em camundongos, 90% do IFN-γ encontrado do início até o meio da gestação na decídua basal são derivados das células uNK (ASHKAR et al, 1999; ASHKAR et al, 2000). Nos experimentos utilizando ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), IFN-γ foi encontrado a partir do 6odg, com o nível máximo no 10odg, seguido de declínio após este período nas células uNK (ASHKAR et al, 2000). Esta citocina é importante na vascularização (angiogênese), na maturação da decídua e no desenvolvimento da placenta-fetal (ASHKAR et al, 2000, PAFFARRO, 2002). O IFN-γ atua diretamente sobre as células trofoblásticas, ativando a sinalização do STAT-1 nas células trofoblásticas placentárias para a produção do óxido nítrico via iNOS (LEANZA et al, 2004). Ain e colaboradores (2003) demonstraram que camundongos com deficiência na
sinalização do IFN-γ apresentam maior invasão do trofoblasto na decídua mesometrial comparados com camundongos selvagens. De fato, na ausência do IFN-γ ocorrem alterações importantes no endométrio, tais como: modificações nas artérias deciduais, hipo-celularidade ou necrose da decídua e menor desenvolvimento da placenta e do feto (ASHKAR et al, 2000; CROY et al, 2003).
No período de pré-implantação detecta-se a ocorrência de IL-18 no ambiente uterino. Experimentalmente verificou-se que os macrófagos seriam os principais produtores da IL-18 em resposta a lipopolissacarídeos (LPS). Estes, por sua vez, estimulariam a produção de IFN-γ pelas células uNK (DINARELLO et al, 1998), mas as células T, B, dendríticas e NK também a secretam (OSTOJIC et al, 2003). Níveis elevados de IL-18 promovem uma forte ativação nas células NK e provavelmente uma excessiva produção de IFN-γ, podendo refletir no controle inadequado da proliferação e ativação das células NK. Em gestações de humanos que apresentaram complicações no primeiro e segundo trimestre da gestação foram encontrados níveis elevados de IL18 (IDA et al 2000). A associação de IL-18 com outras citocinas, por exemplo, IL-12, pode induzir o aborto em camundongos (ZENCLUSSEN et al, 2002). Mas, por outro lado, nos sítios de implantação de camundongos deficientes em IL-18 observaram-se que não ocorria o espessamento adequado das artérias espirais (TAKEDA et al, 1998), sugerindo que a IL-18 participe nos eventos de remodelação da decídua, como por exemplo, a modificação das artérias espirais no início da gestação juntamente com o IFN-γ.
A IL-6 é uma citocina multifuncional, produzida por diferentes tipos celulares incluindo células do sistema imune, fibloblastos, células endoteliais, adipócitos e miócitos (Papanicolaou et al, 1998).
IL-6 não é expresso constitutivamente, ela é sempre induzida e produzida em resposta aos inúmeros estímulos inflamatórios (Wilson et al, 2001). IL-6 é geralmente considerada uma citocina pró-inflamatória. Mas foi demostrado em camundongo knock-out que ela possui propriedades anti-inflamatória (Xing et al 1998; WEGMANN et al, 1993), sendo regulada por hormônios como o estrógeno e progesterona durante a gestação (DE M et al, 1993). O papel da sua expressão durante a gestação ainda não está muito claro.
na programação do trabalho de parto (GRAVETT et al, 1994). Nos estudos em humanos, a síntese de lL-6 tem sido descrita na decídua durante o início da gestação. Além disso, demonstrou-se que IL-6 induz a liberação de gonadotrofina coriônica humana do trofoblasto, conduzindo uma cascata subseqüente na síntese de progesterona, liberando as citocinas Th2. No entanto, há trabalhos que a classificam como uma citocina pró-inflamatória pela sua participação em abortos recorrentes, infecções uterinas (ZENCLUSSEN et al, 2003), sendo produzidas por macrófagos, células deciduais, trofoblasto e mastócitos.
Interações Fas/FasL são sugeridas como um mecanismo potencialmente envolvido na tolerância imune na interface do trofoblasto e da decídua (MOR et al, 1998; KAUNMA et al, 1999), sendo a expressão FasL detectada em regiões de contato direto do tecido placentário com o endométrio. Hunt et al (1997) detectaram a expressão da proteína e do seu RNAm no 6o-10odg em epitélio glandular de camundongo e nas células deciduais. Entre o 12º -14º dg esta expressão mudou para as células trofoblásticas da placenta que limitam os espaços sanguíneos e as células endoteliais da placenta do feto. FasL foi também encontrado nas células trofoblásticas dos vilos e extravilos o primeiro trimestre de gestação em humanos (KUSAKABE et al, 2005). Células uNK apresentam receptor Fas para FasL e a indução de apoptose nas células uNK estaria relacionada com o sistema FasL/Fas, modulando negativamente a resposta imune inata destas células (KUSAKABE et al, 2005). As uNK são capazes de produzir também o FasL (KUSAKABE et al, 2005) e geralmente este é armazenado em grânulos nas células T CD8+ e NK, que sob estímulos adequados podem ter ação autócrina (BLOTT et al, 2001). Não há, contudo, relatos sobre possíveis alterações do sistema Fas/FasL na imunomodulação das células uNK da interface materno-fetal em gestação anômala.
Considerações finais
É notório, portanto, que as células NK são importantes produtoras de citocinas e além de apresentarem o potencial de lisar às células alvos em resposta à ativação da imunidade adaptava e inata. Porém, cada uma dessas atividades é dependente de um estímulo específico, ou de um conjunto destes que estimulariam ou inibiriam a produção de
citocinas ou outros fatores que favorecem a homeostasia na interface materno-fetal no ambiente uterino gestante, decorrente de uma cascata de respostas intracelulares e/ou intercelular. Qualquer distúrbio nesta cascata de informações interdependentes, envolvendo uma ampla gama de células que atuam como coadjuvantes na gestação pode resultar na interrupção da gestação ou insucesso reprodutivo, e o mapa destas interações é apenas parcialmente conhecido até o momento. A dificuldade em completar este mapa de interações está na complexidade do ambiente que envolve múltiplas populações celulares em um processo dinâmico e contínuo, aliado a falta de modelos experimentais que permitam isolar parte dos elementos envolvidos nestes processos, ou reproduzir situações de anormalidade experimentalmente controlados deste ambiente.
Roman (2001) desenvolveu um modelo experimental de interrupção gestacional em camundongos através da lesão cirúrgica do embrião. Neste modelo, comprovou-se que a lesão do embrião suscita alterações morfológicas nas células uNK com a perda do conteúdo dos grânulos citolíticos em intervalos de tempo inferior a 1 hora pós-lesão. Copi e colaboradores (2006) utilizando o mesmo modelo de lesão embrionária demonstraram que dentre os conteúdos dos grânulos, a perforina, a enzima catepsina D e proteoglicanas são eliminadas rapidamente pelas células uNK, sugerindo que a liberação destes conteúdos estejam envolvidos na atividade citolítica destas células. Copi (2006) sugere que a liberação destes mediadores possa contribuir para o desencadeamento da degeneração generalizada constatada histologicamente no sítio uterino após 12 a 24 horas da lesão embrionária (Roman, 2001).
Outros modelos de indução experimental de anomalia da gestação que provocam o aborto adotam a inoculação sistêmica de agentes, como o lipopolissacarídio-LPS (Ogando et al, 2003). Porém este procedimento induz além do efeito no útero gestante, uma ação sistêmica com resposta do sistema imune distribuído em diversos órgãos. Este efeito, não permite confinar ou delimitar o fenômeno ao ambiente uterino, e muito menos às populações específicas presentes neste ambiente. Desta forma, do conhecimento atual não há outros modelos que permitam manipular e simular o ambiente uterino de gestação anômala que envolva diretamente a resposta das células uNK.
célula-células uNK em diversos mecanismos de imunomodulação envolvendo o ambiente uterino e o feto alogênico. Porém, muitos dos mecanismos são ainda hipotéticos e sem comprovação experimental, particularmente em situações envolvendo a gestação anômala, onde as interações devem sofrer alterações conjuntas e/ou em cascata que resultam no desequilíbrio da homeostasia da interface materno-fetal do útero gestante.
A elucidação e compreensão dos mecanismos envolvidos nas diversas vias de interação notadamente interdependente, como aquelas que ocorrem no ambiente complexo da interface materno-fetal do útero gestante de animais, encontra ainda a limitação de meios de identificar e acompanhar passo a passo todas as intersecções dos mecanismo envolvidos. Neste contexto, a avaliação da expressão gênica é o meio prospectivo de amplitude maior, permitindo determinar em primeira instância as respostas celulares reguladas positiva e negativamente em determinados estados funcionais. A sensibilidade do método de Reação em Cadeia de Polimerase Via Transcriptase Reversa (RT-PCR) permite ainda avaliar os níveis de expressão dos genes ativados/inativados de forma comparativa em situações funcionais distintas.
Neste sentido, presumindo-se a capacidade das células uNK de desencadearem a resposta imune inata pela ativação do seu potencial citotóxico, o presente trabalho avaliou através do método de RT-PCR, as expressões dos genes codificadores de DAP12, TNF-α, IFN-γ, perforina, granzima-A, IL-18, IL-6, Fas, FasL, IL-15 e IL-2 na interface materno-fetal do útero gestante de camundongos normal e as suas variações temporais sob situação de estresse provocado pela lesão embrionária, com o intuito de melhor compreender os mecanismos fisiológicos e patológicos da interação entre o organismo materno e feto no ambiente uterino.
2 - OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo avaliar as expressões dos genes codificadores de TNF-α, IFN-γ, perforina, granzima-A, IL-18, IL-6, Fas, FasL, IL-15, IL-2 e DAP12, relacionados com a resposta imune inata das células uNK no útero de camundongos gestantes normais e as variações quando submetidas ao estresse provocado pela lesão embrionária.
2.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Avaliação qualitativa da expressão dos genes codificadores de TNF-α, IFN-γ, perforina, granzima-A, IL-18, IL-6, Fas, FasL, IL-15, IL-2 e DAP12 a partir do RNA total extraído de células uNK purificadas e íntegras.
2. Avaliação semi-quantitativa por RT-PCR (Reação em Cadeia de Polimerase Via Transcriptase Reversa) das expressões dos genes TNF-α, IFN-γ, perforina, granzima-A, IL-18, IL-6, Fas, FasL, IL-15, IL-2 e DAP12 em amostras de homogenados coletados da região mesometrial dos sítios de desenvolvimento embrionário de camundongos no 9º dg normal e dos sítios submetidos à lesão cirúrgica do embrião obtidos nos seguintes intervalos após lesão: 0,5h, 1h, 2h, 6h, 12h e 24h;
3. Analisar pelo qRT-PCR (Reação em Cadeia de Polimerase em tempo real - Quantitativo ) se existem subtipos funcionais distintos de células uNK no ambiente uterino
entre células uNK imaturas e maduras isoladas através da microdissecção a laser (LCM- Laser Capture Microdissection) presentes no sítio de desenvolvimento embrionário normal do 9º dg.
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – ANIMAIS
Foram utilizados camundongos machos e fêmeas virgens da linhagem SWISS, com idade de 10 a 12 semanas, provenientes do CEMIB/UNICAMP e camundongos machos e fêmeas virgens da linhagem C57BL/J (B6), com idade aproximadamente de 10 a 12 semanas, provenientes do Jackson Laboratory (USA), mantidos em gaiolas com acesso à água e alimentação ad libitum e em ambiente com temperatura e iluminação controladas. As fêmeas foram acasaladas com machos de mesma linhagem e na manhã em que foi encontrado o tampão vaginal, considerou-se o primeiro dia de gestação (dg).
Os animais da linhagem SWISS foram manipulados no Biotério do Departamento de Histologia e Embriologia, IB, UNICAMP, enquanto os animais da linhagem C57BL/6 foram manipulados e utilizados no Biotério do Ontário Veterinary School, University of Guelph, Guelph, Canadá.
3.2 – COLETAS E PROCESSAMENTO DOS MATERIAIS
3.2.1 - INDUÇÃO DE LESÃO CIRURGICA DO EMBRIÃO (LCE)
As fêmeas SWISS e da linhagem C57BL/J (B6) no 9ºdg foram anestesiadas com injeção intraperitoneal de Quetamina (Agribrands do Brasil) (100-200mg/Kg) e Cloridrato
dos cornos uterinos e uma vez constatada a presença de sítios de desenvolvimento embrionário, procedeu-se a lesão cirúrgica dos embriões (LCE) por meio da introdução de uma agulha hipodérmica (15x5) através da parede uterina do lado antimesometrial em profundidade não superior a 2mm. As lesões foram realizadas em sítios de implantação alternados de ambos os cornos uterinos, totalizando 5 a 6 sítios embrionários lesionados em cada animal. Após este procedimento, as incisões cutâneas e da fáscia muscular foram suturadas com fio cirúrgico.
3.2.2 - PROCESSAMENTO DOS MATERIAS
As fêmeas SWISS submetidas a LCE foram sacrificadas por deslocamento cervical nos períodos de 0,5horas (h), 1h, 2h, 6h, 12h e 24h pós-lesão e os cornos uterinos foram removidos rapidamente e mantidos em solução de Hanks (Sigma, St Louis, USA) refrigerado a 4ºC. As amostras foram coletadas de pelo menos 4 animais no 9º dg normal e em cada um dos períodos pós-LCE.
Os sítios uterinos submetidos a LCE dos grupos experimentais foram separados dos cornos uterinos e dissecados isolando-se a porção mesometrial. Para verificar se o isolamento da porção mesometrial estava isento do embrião e dos anexos, para posterior padronização da dissecção, foi separado aleatoriamente um sítio de implantação do embrião do animal normal para processamento histológico convencional de embebição em parafina.
Os sítios de implantação destinados a obtenção do homogenado celular foram dissecados e imediatamente congelados em N2 e mantidos a -70ºC para posterior extração
do RNA.
3.2.3 - PROCESSAMENTO HISTOLÓGICO E CITOQUÍMICA COM LECTINA DBA
3.2.3.1 – PARA EMBEBIÇÃO EM PARAFINA
Os fragmentos dos sítios uterinos dissecados, conforme obtido em 3.2, foram fixados por imersão durante 24 h em solução de paraformaldeído 4% (Sigma, St Louis, USA) em tampão fosfato-salina (PBS) 0,1M pH 7,4 desidratados em etanol e diafanizados em xilol. Após embebição em parafina (Histosec, Merck, Brasil), cortes de 5 µm de espessura foram coletados em lâminas histológicas silanizadas.
Os cortes desparafinizados foram processados para citoquímica com a lectina Dolichos biflorus (DBA) de acordo com a técnica descrita por Paffaro et al (2003). As análises e a documentação digital foram realizadas no fotomicroscópio Eclipese 800 (Nikon, Japan) acoplado com câmara Cool-Snap e programa de tratamento de imagem da Image Pro-Plus (USA).
Os sítios uterinos coletados das fêmeas C57BL/6 destinados para LCM foram embebidos no meio de OCT (Cryomatrix, ThermoShandon, Pittsburg, PA, USA) em criomoldes, congelados a -20oC e mantidos a -80oC até o momento do uso. Os criocortes dos sítios de desenvolvimento embrionário no 9ºdg foram obtidos no criostato Leica CM3050S (Leica Microsystems Inc., Richmond Hill, ON, Canada) com 5 µm de espessura. Os cortes foram mantidos a temperatura ambiente (TA) por 1 min para secar o OCT e fixados com álcool 70% utilizando água livre de nuclease (Gibco/Invitrogen Corporation) durante 30 segundos (seg). Em seguida, foram lavados com água livre de nuclease e com TBS 0,05M, pH 7,6 (DakoCytomation Denmark A/S) por 30 seg. e em seguida incubados em TBS 0,05M pH 7,6 com albumina sérica bovina a 1% (Fisher Scientific, Pitsburgh) por 5 min a TA. Depois de lavadas com TBS 0,05M, pH 7,6 por três vezes, foram incubadas com lectina DBA 1:200 em TBS 0,05M, pH 7,6 por 5 min a TA. Os cortes foram lavados com TBS 0,05M, pH 7,6 três vezes e incubados com estreptoavidina conjugada com Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA) diluída a 1:200 em TBS 0,05M, pH 7,6 por 5 min a TA. Após lavagens com TBS 0,05M, pH 7,6 três vezes, os cortes foram desidratados em cada gradiente crescente de álcool de 75 a 100%, a seguir foram mantidos por 5 min em xilol (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada), foram secas por 5 min na capela. As lâminas foram colocadas em caixa de lâminas com sulfato de cálcio anidro (Dirierite) (Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada) e imediatamente processadas no microscópio de captura por microdissecção a laser (LCM).
Camundongos fêmeas SWISS foram sacrificadas no 9o dg por deslocamento cervical e em seguida laparotomizadas para remoção dos cornos uterinos. Os cornos uterinos foram dissecados e a região mesometrial de cada sítio de desenvolvimento embrionário removido e imerso em solução Hank´s. Para o isolamento das células uNK utilizou-se esferas magnéticas revestidas com lectina Dolichos biflorus biotinado (DBA, Sigma, ST. Louis, USA) como preconizado por Lima (2002). Em resumo, este método consiste-se em recortar os fragmentos da região mesometrial com auxílio de lâminas de barbear, suspender o macerado em 1ml de DNAse (1000UN) (Sigma Co, St Louis/USA) em solução Hanks, e homogeneizar por aspiração sucessiva com micropipetas (1mL). Em seguida, a suspensão celular foi filtrada em telas de nylon com malhas de 80µm e centrifugado a 300g por 10min, a 4oC. Lavou-se o sedimento celular através de duas centrifugações sucessivas em PBS contendo albumina sérica bovina (BSA) a 1%. Associou-se a suspensão celular com esferas magnéticas (Dynal, France), conjugada com lectina DBA de acordo com as instruções do fabricante. As células associadas com as esferas revestidas com a lectina DBA foram imobilizadas no MPC (magnetic particle concentrator – Dynal, France). As células imobilizadas em PBS/BSA foram lavadas e em seguida tratadas com N-acetil galactosamina (Nac Gal) (Sigma Co, St Louis/USA) na concentração de 0,1M para dissociação das esferas magnéticas. Após dissociação, a suspensão celular contendo apenas as células uNK foi transferida para outro tubo de eppendorf, ressuspendidas em PBS e quantificadas em câmara de Newbauer. Após nova centrifugação, o sobrenadante foi descartado e ao sedimento contendo a totalidade das células adicionou-se Trizol para realizar a extração de RNA total das células uNK.
3.4 - CAPTURA DE CÉLULAS A PARTIR DA MICRODISSECÇÃO A LASER
Para a microdissecção das células destinadas à obtenção de RNA para RT-PCR em tempo real quantitativo foram seguidas as recomendações descritas por Pinzani (2006). Utilizou-se de 9 a 12 criocortes de cada animal para microdissecção de cerca de 200 células uNK imaturas e 200 células uNK maduras, distinguindo-as segundo a classificação morfológica e localização destas células no sítio uterino conforme descrito por Paffaro e colaboradores (2003) (Figura 1a, b). Foi utilizado o microscópio de dissecção a laser Arcturus® PixCell II system (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) acoplado com sistema de fluorescência, do Departamento de Patologia da Universidade de Guelph. As células marcadas positivamente pela lectina DBA-fluoresceina foram capturas utilizando pulsos (= shots) de laser de 50, 100 ou 200 de 70 a 85mW com duração de 0,7 a 0,9 ms, depois demarcadas em imagens de fluorescência e coletadas em tampas CapSure™ HS (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) e rapidamente processadas conforme procedimento do item 3.5.2
3.5 – EXTRAÇÃO DO RNA E OBTENÇÃO DO cDNA
3.5.1 – DO HOMOGENADO UTERINO E DAS CÉLULAS uNK ISOLADAS
Os fragmentos da região mesometrial dos sítios uterinos dissecados de animais em gestação normal em cada um dos períodos pós-LCE obtidos em 3.2, foram transferidos
para um tubo eppendorf (1,5 mL) e adicionados o reagente TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) para homogeneização no homogeneizador rotativo (Glas-Col) por 1 minuto em banho de gelo, a baixa rotação. Foram transferidos para um tubo de 1,5ml livre de RNAse e DNAse e homogeneizados em Vórtex por 1 minuto para que houvesse a completa lise celular e o fragmento da região mesometrial foram macerados.
Em seguida as amostras homogeneizadas foram incubadas por 5 min a TA para permitir a completa dissociação dos complexos nucleoprotéicos. Para cada 300µL do homogenado adicionou-se 200 µL de clorofórmio (JT Baker) e homogeneizado em Vortex durante 30 seg. Após 3 min de repouso em TA, foram centrifugadas por 15 min a 12.000g a 4oC. A fase aquosa foi transferida para tubo eppendorf de 1,5mL. À fase aquosa acrescentou-se 1 ml de álcool isopropílico (J.T.Baker), e após homogeneização suave, as amostras foram mantidas em repouso por 12 h a -20oC.
Após este período, as amostras foram centrifugadas a 12.000g por 10 min a 4oC e após completa remoção do sobrenadante, adicionou-se 1 mL de etanol (J.T.Baker) a 70% e H20/DEPC (Sigma) gelado para nova centrifugação por 10 min a 7.500g a 4oC. Os
sobrenadantes das amostras foram descartados e ao sedimento foram adicionados 1ml de etanol absoluto (J.T.Baker) a -20oC e constatada a soltura do sedimento do fundo do tubo após agitação no Vortex, centrifugou-se a 7500 g a 4oC por 10 min. O sedimento obtido foi solubilizado em 40 µL de H20/DEPC, quantificadas em espectofômetro (NanoDrop-100
Spectrophotometer) através da relação da densidade óptica nos comprimentos de onda de 260nm e 280 nm. Alíquotas destas soluções de RNA foram ajustadas na concentração de 2µg/µl em H20/DEPC e estas foram mantidas congeladas a -80o C até o momento do uso.
A extração do RNA das células uNK isoladas seguiu o mesmo procedimento, exceto quanto à etapa da precipitação do RNAtotal, sendo adicionado 1,5µl de acrilamida linear (20µg/ml) para obter uma maior eficiência na precipitação do RNAtotal.
3.5.2 – CÉLULAS DISSECADAS NO LCM
Para a extração de RNA total das 200 células dissecadas de cada amostra obtida no LCM, seguiu-se o protocolo do fabricante do PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus Biosciense, Mt View, CA).
3.6 – QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DO RNA TOTAL
Para verificar a integridade do RNA total obtido em 3.3, 2,0µL das amostras 3.5.1 foram incubadas por 10 minutos a 65ºC em uma solução tampão composta por: 3,0µL de MOPS (10x) (3-[N-morpholino]propanesulfonic acid), 5,0µL de formaldeído (Sigma), 12,5µL de formamida (Sigma), 2,5µL de brometo de etídeo (EtBr) + tampão de corrida (Loading buffer). Ao término deste tratamento, incubou-se por 2 min a 0 ou 4ºC
As amostras foram corridas em um gel desnaturante utilizando 1% de agarose (LGC Biotecnologia – Biologia Molecular/ Grupo Ciambarella) em 41,5 mL DEPC, 5 mL MOPS 10%, 3,5 ml de formaldeído, a 65V por 45 min em uma cuba de eletroforese. Para a captura de imagem digital da banda utilizou-se o fotodocumentador Image Master VDS – Pharmacia Biotech para observar a integridade do RNAtotal.
3.7 – SÍNTESE DE cDNA
3.7.1 - MATERIAIS DO HOMOGENADO E DAS CÉLULAS ISOLADAS
A partir de 2µg de RNA total obtido em 3.3, foram obtidos os cDNA utilizando-se o kit SuperScript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) adotando-se os procedimentos recomendados nas instruções do fabricante.
3.7.2 – MATERIAIS DO LCM
Foram utilizados 5µl de cada amostra de RNA total obtido em 3.5.2 como molde para a transcrição reversa. A síntese de cDNA foi realizada de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante do Kit QuantiTect Whole Transcriptome (Qiagen) para amostras com concentração reduzida de RNA, adotando a incubação final para a amplificação do cDNA de 8 horas a 30oC.
Para a quantificação do cDNA no espectofotômetro GeneQuant Pro (AmershanPharmac Biotech, Cambridge, Inglaterra), as amostras foram diluídas 1:50. Para confirmar a qualidade do cDNA sintetizado, foram realizadas reações de PCR em tempo real (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) utilizando-se um par de primers específicos para o gene β-actina de expressão constitutiva e, como molde, os cDNA sintetizados. Utilizou-se o QuantiTect SYBR Green PCR (Qiagen) em um volume final de 20ul,
reações foi de 95ºC por 10 seg., 58ºC por 5 seg., e 72ºC por 20 seg. A curva de desnaturação foi programada de 70ºC-95ºC a uma taxa de 0,1ºC por seg., e a última etapa de resfriamento de 40ºC.
3.8 - REVERSE TRANSCRIPTASE - POLYMERASE CHAIN REACTION SEMI-QUANTITATIVO (RT-PCR)
3.8.1 – CONFECÇÃO DOS “PRIMERS”
Para o RT-PCR semi-quantitativo foram utilizados os pares de primer sense e anti-sense específicos para os genes de camundongos de: IL-15, IFN-γ, Perforina, Granzima A, IL-18, IL-6, Fas, DAP-12, TNF-α, FasL, IL-2 e β-actina.
Alguns dos primers utilizados foram baseados em seqüências descritas na literatura, enquanto outros foram desenhados a partir da confirmação da adequação da seqüência proposta utilizando o banco de dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Utilizaram-se os programas Primer 3 e o Primer Express versão 2.0 (Apllied Biosystems), Operon Molecules for life. As principais características dos primers desenhados pelo programa foram: apresentar quantidade de CG entre 45 e 65%, não permitir a formação de dímeros, ou estrutura secundária e apresentar temperatura de anelamento (Tm melting temperature) entre 58 e 60oC de acordo com o algarítimo nearest neighbor (BRESLAUER et al., 1986). Além disso, a fim de evitar uma eventual co-amplificação de DNA genômico contaminante, a maior parte dos pares de primer foi desenhada em exons diferentes. Para
confirmar se estes primers eram específicos para o gene alvo, foram verificados no Gene Bank do NCBI e/ou UCSC Genome Bioinformatics Site (http://genome.ucsc.edu/) utilizando o programa de alinhamento computacional BLAST e BLAT, respectivamente. As seqüências dos primers IL-15, IFN-γ, Perforina, Granzima A, IL-18, IL-6, Fas, DAP-12, TNF-α, FasL, IL-2 e β-actina, foram confeccionadas pelas empresas Imprint do Brasil ou Sinapse Biotecnologia conforme constam na tabela 1.
3.8.2 – Amplificação dos transcritos - PCR
Para o PCR foram utilizados o Kit Taq-DNA polimerase (Invitrogen) com protocolo ajustado para uso de volume final de 10µL para cada reação, no termociclador (GeneAmp PCR System 9700 – Applied Biosystems). Os ajustes no protocolo visaram a realização da reação na concentração final de 1x para o tampão de reação da enzima Taq (Invitrogen), 1,5mM de MgCl2, 0,2mM de dNTP (1,2MmM, Invitrogen), 3 pmol/ul dos primer sense e
anti-sense, 1 µl da enzima Taq Polimerase e 0,6 µl cDNA.
O programa de ciclagem utilizado nas reações foi de 94oC por 2 min, número de ciclos foi correspondente à padronização da curva de ciclagem de cada primer realizado a 94oC por 45 seg., Tm por 45 seg. e 72oC por 1 min e, após os ciclos, 72oC por 5 min.
