2.1. Procedimento com os animais.
Todos os experimentos descritos neste trabalho foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal da Universidade Estadual de Maringá. Foram utilizados vinte e cinco ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, com 90 dias de idade. O diabetes foi induzido através da administração endovenosa de 35 mg kg-1 do peso corporal de estreptozootocina (Sigma, St. Louis, MO, USA), dissolvida em solução tampão de 10 mmol l -1
(pH 4.5), após um jejum de 14 horas. A injeção com estreptozootocina resultou na síndrome diabética com poliúria, polifagia e polidpsia. A glicemia (Bergmeyer e Bernt, 1974) de cada animal foi avaliada no quarto dia após a indução do diabetes, obtendo-se o valor médio de 486.9 ± 14.25 mg/dl. Os ratos foram divididos em cinco grupos: normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com L-glutamina (NG), diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com L-glutamina, a partir do 4° (DG4) ou 45° dia da indução do diabetes
(DG45). A quantidade de alimento ingerido, de água consumida e urina eliminada foi avaliada durante cinco dias da última semana de cada mês com utilização de gaiolas metabólicas.
Os animais foram mantidos em caixas individuais, recebendo água e alimento (Nuvital® lab) ad libitum, com fotoperíodo (6:00 am – 6:00 pm) e temperatura ambiente (24ºC±2ºC) controladas. Parte dos animais recebeu ração suplementada (1%) com L- glutamina (Ajinomoto, Tokyo, Japan), preparada semanalmente.
Aos 210 dias os animais foram anestesiados com tiopental (40 mg kg-1 do peso corporal) e o sangue coletado por punção cardíaca para dosagem da glicose (Bergmeyer e Bernt, 1974).
2.2. Imunolocalização da miosina-V (Drengk et al., 2000)
Os ratos foram perfundidos com 250 ml de solução fixadora contendo periodato de sódio (10 mM), lisina (75 Mm), paraformaldeído (1%) tampão fosfato (37 mM), pH 7,4 e posteriormente com solução salina 1.1 %. Imediatamente após a perfusão, os íleos foram removidos, lavados com solução salina, abertos e imersos na mesma solução fixadora por 1 hora. Depois, os segmentos foram desidratados em etanol (50, 70, 80, 90 e 100%) permanecendo em cada solução por 10 minutos, diafanizados em xilol (10 minutos), reidratados com etanol 100, 95, 90, 80, 70% e estocados em etanol 70%. Em seguida, os segmentos foram dissecados sob estereomicroscópio com trans-iluminação, através da remoção da túnica mucosa e tela submucosa, obtendo preparados totais da túnica muscular. Os preparados totais foram lavados duas vezes em tampão fosfato salinado (PBS) 0,1 M, pH 7,4 e bloqueados por 1 hora com PBS, albumina soro bovina (BSA) 2 % (Sigma, St. Louis, MO, USA), soro de cabra 2 % e Triton-X-100 0,5 % (Sigma, St. Louis, MO, USA), à temperatura ambiente (TA). Em seguida, os segmentos foram incubados em TA (24 hs) em solução contendo anticorpo primário anti-miosina-V 1:750 (obtido de coelho) diluído em
PBS, BSA 2%, Triton-X-100 (0,1%) e soro de cabra (2%), em tubos eppendorf. Após a incubação, os preparados totais foram lavados duas vezes em PBS + Triton-X-100 0,1% e duas vezes em solução de PBS + Tween 0,05%. Em seguida, foram incubados em anticorpo secundário (anti coelho) conjugado com peroxidase 1: 1000 (Pierce, Rockford, USA) à TA sob agitação por 24 hs. A seguir, foram lavados quatro vezes, durante 15 minutos, em PBS + Tween 0,05%. Os preparados foram revelados com diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, USA) e montados com glicerol gel. O controle negativo foi realizado com a omissão do anticorpo primário.
2.2.2. Anticorpo miosina V
Anticorpo anticauda policlonal, gerado contra a proteína recombinante miosina-V da galinha foi caracterizado previamente (Espreafico et al., 1992). Um fragmento cDNA (que corresponde aos aminoácidos 899-1830) de um clone miosina-V cauda do cérebro de galinha foi subclonado dentro do vetor pGEX para gerar uma Glutationa transferase (GST)/ miosina cauda medial (que corresponde aos aminoácidos 1117-1435) proteína em fusão em bactéria XL1Blue. Esta GST/miosina-V cauda medial foi purificada sobre resina glutationa. Esta proteína em fusão foi usada como um antígeno para produção de anticorpo em coelhos. O soro imune foi purificado sobre uma coluna de proteína com afinidade PLM/miosina-V cauda para enriquecer IgG anticorpos direcionados contra a miosina-V cauda medial. Anticorpos secundários conjugados com peroxidase soro anticoelhos IgG foram usados (Pierce, Rockford, USA).
2.3. Analise quantitativa
A análise quantitativa foi realizada na região intermediária da circunferência intestinal (60º a 120º; 240º a 300º), considerando-se como 0º a inserção do mesentério
(Miranda-Neto et al., 2001; Zanoni et al., 2005). Os neurônios foram contados com auxílio de microscópio BX40 Olympus sob objetiva de 40X. Foram contados 40 campos microscópicos aleatórios em cada preparado total. A área de campo microscópico foi de 0.229 mm2.
2.4. Análise morfométrica
As imagens foram capturadas por câmera de alta resolução e transferidas para computador. O perfil celular (µm2) de 100 corpos celulares em cada animal, num total de 500 neurônios para cada grupo estudado foi mensurado através de programa computadorizado de análises de imagens Image-Pro-Plus 4 (Media Cybernetics, USA). Os neurônios foram classificados em classes de 100 µm2 e foram obtidas as porcentagens de cada grupo para cada intervalo.
2.5. Análise estatística
Os dados foram analisados pelo método de quadrado mínimo, por meio de análise de variância (ANOVA), seguida de teste Tukey, que foi empregado como pós-teste para comparação de médias. Uma vez que as áreas dos corpos celulares dos neurônios não apresentavam uma distribuição normal, utilizamos a análise de variância e teste “t de Student” para comparação das médias. As análises foram realizadas com software Prisma 3.0. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± EP).
3. Resultados
Verificamos no presente estudo que os ratos diabéticos (grupos UD, DG4 e DG45) não ganharam peso na mesma proporção quando comparados aos animais dos grupos normoglicêmicos (N e NG) (p < 0,05) (tabela 1). A suplementação com L-glutamina não alterou o peso corporal final dos ratos dos grupos DG4 e DG45 quando comparados com os
animais do grupo UD (p > 0,05) (tabela 1). A condição diabética foi mantida durante o período de estudo, pois a glicemia apresentava-se elevada em todos os grupos diabéticos investigados. A síndrome diabética foi também confirmada pela presença de polifagia, poliúria e polidpsia (tabela 1). A suplementação com L-glutamina não reverteu estes parâmetros.
Com a técnica imunohistoquímica miosina-V, pudemos observar os três componentes do plexo mioentérico (Fig. 1). O plexo primário foi bem evidenciado, sendo constatada a presença de gânglios e fibras nervosas interganglionares. No trajeto das fibras nervosas do plexo primário observamos a presença de neurônios isolados. Os plexos secundários e terciários apresentavam-se bastantes evidentes. As fibras nervosas do plexo secundário corriam paralelamente às células musculares da camada circular da túnica muscular. O plexo terciário era formado por finas fibras nervosas, situadas entre os espaços deixados pelo plexo primário (Fig. 1). A Fig. 2 mostra os neurônios mioentéricos miosina-V imunoreativos observados nos cinco grupos (UN, NG, UD, DG4, DG45). Observamos uma diferente intensidade na marcação dos neurônios nos gânglios mioentéricos (Fig. 2).
Verificamos uma redução de 22,90% na densidade neuronal no íleo dos animais do grupo UD quando comparados aos normoglicêmicos não tratados (UN) e normoglicêmicos tratados com L-glutamina (NG) (p > 0,05). A densidade neuronal dos animais dos grupos DG4 e DG45 foi similar à observada nos diabéticos não tratados (UD) (p > 0,05) (Fig. 3).
A área do perfil celular dos neurônios imunoreativos miosina-V dos animais do grupo UD foi 4,6% maior em relação aos animais do grupo UN (p > 0,05) (tabela 2). A suplementação com L-glutamina (grupo DG4 e DG45) não alterou estes resultados, sendo observados valores semelhantes aos do grupo UD (p > 0,05). A maioria dos neurônios apresentava perfis celulares que variavam de 101 a 400 µm2 . A proporção de neurônios nesta
faixa para os grupos UN, NG, UD, DG4 e DG45 foi de 82,2%, 89,6%, 84,4%, 92,2% e 88,4% respectivamente, como mostra a Fig. 4.
4. Discussão
Nosso modelo de diabetes experimental mostrou-se eficiente, pois observamos aumento do consumo diário de água, ração, glicemia, além de menor peso corporal nos animais dos grupos UD, DG4 e DG45 quando comparado aos animais normoglicêmicos (grupos N e NG).
A técnica imunohistoquímica miosina-V foi utilizada para realizar a imunomarcação dos neurônios mioentéricos em preparados totais da túnica muscular (Drengk et al., 2000). Vários autores têm aplicado esta técnica de imunomarcação para evidenciação dos neurônios mioentéricos em diferentes regiões do trato gastrintestinal (Buttow et al., 2003, 2004; Zanoni et al., 2003, 2005; Schoffen et al., 2005). A miosina-V é uma versátil proteína motora e está envolvida no rápido transporte de vesículas dos dendritos para o axônio (Langford, 2002). Esta técnica é utilizada como marcador da população neural total em virtude de a miosina-V ser uma proteína motora e estar presente nos corpos celulares e fibras nervosas. Através desta técnica, podemos observar a organização do plexo mioentérico no íleo. Verificamos a presença dos três componentes (primário, secundário e terciário) que formam este plexo. Este arranjo assemelha-se àquele descrito inicialmente por Auerbach em 1864 e por vários outros autores posteriormente, incluindo Furness e Costa (1980). A diferente intensidade de marcação nos neurônios mioentéricos dentro dos gânglios foi evidenciada em todos os grupos estudados. Segundo Drengk et al. (2000), esta heterogeneidade na intensidade de coloração pode indicar diferentes níveis de atividade neuronal.
Verificamos redução do número de neurônios mioentéricos imunomarcados pela miosina-V no grupo UD na proporção de 22,90% quando comparados com os normoglicêmicos (N). Este resultado foi similar ao evidenciado por Zanoni et al. (2003) que verificaram redução de 24.4 % na densidade dos neurônios miosina-V imunoreativos do íleo de ratos diabéticos. Existem vários fatores que atuam na redução do número de neurônios mioentéricos. Dentre eles destacamos: a) - Aumento da atividade da aldose redutase que está associada com um aumento nos níveis de sorbitol e frutose (Ferraz et al., 1997). O acúmulo de sorbitol e frutose nos nervos leva a um decréscimo do mioinositol e conseqüente inibição da bomba Na+/K+ ATPase, resultando na retenção de Na+, causando edema, disjunção axo-glial e degeneração do nervo (Hosking et al., 1978; Clements e Rex, 1979; Finegold et al., 1983; Vinik, 1999; Afzaal et al., 2002). b) - Aumento do estresse oxidativo (Baynes, 1991, Vincent et al., 2004) que provoca um incremento na produção dos radicais livres. Os radicais livres provocam uma disfunção do tecido nervoso diabético diretamente através da peroxidação lipídica das membranas do axônio e das células de Schwann, levando a uma diminuição da função das células nervosas (Cameron et al., 1993) e/ou efeitos indiretos, que são gerados via vascular. Neste caso, a concentração elevada das lipoproteínas (LDL) no diabetes mellitus inibe o relaxamento do tecido vascular, pois quando estas são oxidadas tornam-se citotóxicas para vários tipos de células, incluindo as células endoteliais (Morel e Chilsom, 1989; Baynes, 1991). c) – Diminuição dos níveis de antioxidantes endógenos. Os níveis de glutationa se encontram reduzidos durante a hiperglicemia levando a um aumento nas espécies reativas de oxigênio (Parthiban et al., 1995; Greene et al., 1999; Vincent et al., 2004). A glutationa é um importante antioxidante na maioria das células de mamíferos (Vincent et al., 2004). Esta substância serve como um co-fator essencial para a enzima glutationa peroxidase, que remove hidroperoxidase, e a formação de glutationa oxidada (GSSG). A glutationa reduzida (GSH) é regenerada pela enzima glutationa redutase usando NADPH (Parthiban et al., 1995; Vincent
et al., 2004). Portanto, a hiperatividade da via poliol reduz os níveis de glutationa, levando a um aumento nas espécies reativas de oxigênio (Nakamura et al., 2002). Esta redução está relacionada ao aumento da atividade aldose redutase que consome NADPH, a qual também é requerida para a formação da glutationa reduzida (Tesfamariam, 1994; Giugliano et al., 1996). Com relação aos grupos diabéticos tratados com L-glutamina (DG4 e DG45), verificamos que a suplementação com L-glutamina não evitou a redução do número de neurônios mioentéricos, quando comparado ao grupo UD. Resultados semelhantes foram observados por Zanoni et al. (2003) no íleo de ratos diabéticos tratados com acido ascórbico. A suplementação com L-glutamina nos animais do grupo DG4 foi realizada para prevenir o desenvolvimento da neuropatia diabética. Nos animais do grupo DG45, a suplementação teve por objetivo atuar como um tratamento. Contudo, a suplementação com L-glutamina tanto na prevenção como na reversão desta patologia não foi positiva. Shotton et al. (2004) também analisaram a prevenção e a reversão do diabetes em nervos entéricos do íleo de ratos diabéticos com tratamento combinado de ácido α-lipólico e ácido γ-linolênico. Neste experimento, Shotton et al. (2004) examinaram imunohistoquimicamente nervos que expressam para o polipeptídeo vasoativo intestinal (VIP), peptídeos relatado-gene calcitonina (CGRP) e noradrenalina (NA). Verificou-se que as administrações de ácido α-lipólico e ácido γ-linolênico preveniram e reverteram parcialmente as mudanças induzidas pelo diabetes em nervos VIP e CGRP, embora individualmente nenhum tratamento foi efetivo.
A L-glutamina é um substrato energético muito importante para as células, sendo também precursora para nucleotídeos, glutamato e, em particular, para síntese de GSH. Este aminoácido durante o estresse catabólico apresenta sua concentração reduzida (Matés et al., 2002). Sabe-se que a GSH é um importante antioxidante para as células, mas durante o diabetes seus níveis apresentam-se reduzidos devido ao aumento de ROS. Portanto, a L-glutamina, sendo precursora da GSH (Amores-Sánchez e Medina, 1999), é metabolizada pelo
ciclo γ-glutamyl produzindo a GSH. Esta é produzida por glutamato, glicina e cisteína (Matés et al., 2002), os quais elevam a concentração da GSH e aumentam a produção de NADPH. Isso irá subseqüentemente aumentar a taxa de GSH/GSSH (Curi et al., 2005), ajudando a reduzir o quadro de ROS. Estudos executados por Roth et al. (2002) demonstraram que ratos alimentados com L-glutamina exibiram um aumento no conteúdo celular de GSH. Uma hipótese para nossos resultados não terem sido significativos com a suplementação da L-glutamina deve-se ao fato de vários mecanismos estarem produzindo ROS. Dentre estes estão: a via do poliol, a glicosilação autoxidativa, a redução dos antioxidantes e a redução da eficiência do sistema enzimático (Vincent et al., 2004). Portanto, um tratamento combinado de substâncias já estudadas individualmente (como o ácido ascórbico (Zanoni et al., 2003) ou acetil-l-carnitina (Miranda–Neto et al., 2005)) com a L-glutamina poderia ser efetivo, pois desta maneira os ROS seriam neutralizados por mecanismos diferentes.
Com relação a área do perfil neuronal, verificamos que não houve diferenças significativas quando os cinco grupos foram comparados. Ao considerarmos especificamente a condição do grupo UD com o grupo UN, verificamos que os neurônios miosina-V imunoreativos dos animais do grupo UD foram 4,6% maior em relação aos animais do grupo UN. Zanoni et al. (2003) também não observaram diferenças ao compararem o perfil celular dos neurônios mioentéricos miosina-V do íleo de ratos diabéticos com os ratos diabéticos tratados com ácido ascórbico. Por outro lado, neurônios VIP-érgicos e nitrérgicos observados por Zanoni et al. (2002) e (2003) no íleo respectivamente, apresentaram aumento da área nos ratos diabéticos e a suplementação com ácido ascórbico preveniu este aumento. Podemos inferir que o diabetes mellitus afeta de um modo diferente as subpopulações de neurônios mioentéricos, pois não verificamos alterações na área neuronal quando analisamos a população total de neurônios.
Ao analisarmos a distribuição da população neuronal em classes arbitrárias em intervalos de 100 µm2, verificamos que apesar da variabilidade observada no tamanho da área do perfil neuronal (47,301 a 855,102 µm2), a maioria dos neurônios em ambos os grupos apresentou uma área do perfil celular na faixa de 101 a 400 µm2. Isto indica a uniformidade na distribuição neuronal entre os grupos.
Em síntese, o presente resultado mostrou que a suplementação com L-glutamina (1%) não teve efeito sobre os neurônios mioentéricos miosina-V imuoreativos, evidenciado pelo fato de não se encontrar diferenças significativas entre o número total e área dos perfis celulares nos neurônios dos grupos diabéticos suplementados ou não com L-glutamina.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio da MSc. Priscila de Freitas, Maria Euride do Carmo Cancino, Maria dos Anjos Fortunato, Valdir Trombeli e José Antonio de Souza pelo excelente apoio técnico.
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Tabela 1- Glicemia (GI), peso corporal inicial e final (PCI e PCF), consumo diário água
(CDA), consumo diário de ração (CDR) e eliminação diária de urina (EDU) nos animais dos grupos: normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com glutamina (NG), diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com glutamina (DG4), diabéticos tratados com glutamina (DG45).Todos os resultados foram expressos como media ± EP da média.
Parámetros UN NG UD DG4 DG45 GI mg.dl-1 158.1 ± 9.3a 143.2 ± 7.1a 649.6 ± 36.5b 524.7 ± 44.8c 500.5 ± 28.4c PCI.g-1 330.6 ± 8.5a 300.3 ± 9.3a 314.8 ± 9.2a 328.0± 8.2a 312.4 ± 9.0a PCF.g-1 480.3 ± 10.7a 406.4 ± 13.4b 309. 3± 17.7c 292.1 ±10.9c 286.7 ± 18.5c CDA. ml-1 54.35 ± 2.6a 49.2 ± 1.35a 185.7 ± 11.7b 213.3 ± 7.0b 160.6 ± 5.0b CDR.g-1 32.1 ± 0.75a 28.77 ± 1.1a 50.8 ± 2.1b 54.82 ± 1.2b 48.3 ± 2.5b EDU.ml-1 12.82 ± 1.7a 10.7 ± 1.6a 101.7 ± 5.5b 127 ± 7.0c 88.7 ± 3.8b
Médias seguidas por letras diferentes na mesma linha são diferentes pelo teste de Tukey (p < 0,05).
Fig. 1. Micrografias mostrando os componentes do plexo mioentérico do íleo de ratos
evidenciados através da técnica imunohistoquímica miosina-V. Figuras A e B: 1- plexo primário; 2- plexo secundário; 3- plexo terciário; 4- neurônios isolados. Barra de calibração: (A) 50µm e (B) 30 µm.
Fig. 2. Micrografias do plexo mioentérico do íleo de ratos mostrando gânglios mioentéricos