UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E MORFOMÉTRICA DOS NEURÔNIOS
MIOENTÉRICOS MIOSINA-V IMUNOREATIVOS E DA TÚNICA MUCOSA DO ÍLEO DE RATOS DIABÉTICOS SUPLEMENTADOS COM GLUTAMINA
ELEANDRO APARECIDO TRONCHINI
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ DEPARTAMENTO DE FARMACIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E MORFOMÉTRICA DOS NEURÔNIOS
MIOENTÉRICOS MIOSINA-V IMUNOREATIVOS E DA TÚNICA MUCOSA DO ÍLEO DE RATOS DIABÉTICOS SUPLEMENTADOS COM GLUTAMINA
ELEANDRO APARECIDO TRONCHINI
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas (área de concentração: Produtos Naturais Biologicamente Ativos), da Universidade Estadual de Maringá-UEM, para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora:
Prof.ªDr.ª Jacqueline Nelisis Zanoni
Foi na família que aprendi a amar e ser amado. Foi a família que fez nascer em mim a auto estima, sem a qual não poderia ter chegado tão longe.
É na família que recebo carinho nas horas mais difíceis.
É na família que vivo meus momentos de maior alegria
É na família que busco inspiração para lutar sempre É na família que aprendi a amar e ser amado
Há em certas pessoas uma energia muito forte, tornando aqueles que a possuem seres especiais como você JACQUELINE NELISIS ZANONI que durante esse tempo soube conduzir os trabalhos com firmeza e sensibilidade. Nesse período à conheci, passei a admira-la e me tornei fã incondicional de alguém que tomei a liberdade de chamar de AMIGA porque essa é a única palavra que pode definir alguém com tamanha dedicação ao próximo.
AGRADECIMENTOS
Obrigado a todas as pessoas que participaram de forma direta ou indireta para a realização deste trabalho. Agradeço....
Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Maringá, pela oportunidade de realização do curso de mestrado e pelos serviços prestados, em especial à Helena, secretária do Departamento de Farmácia e Farmacologia.
Ao Dr. Roberto Barbosa Bazotte pelo constante incentivo e apoio prestado para mim desde que o conheci. Sua humildade e sabedoria me surpreendem a cada dia.
Aos docentes e funcionários do Departamento de Ciências Morfofisiológicas da Universidade Estadual de Maringá pelo apoio e colaboração.
Aos técnicos de laboratório Cleonira, Elizete, Eurides, Maria dos Anjos e Valdir pelo apoio técnico e pela amizade que mantivemos durante toda esta jornada.
Ao José Antonio pela ajuda na utilização dos equipamentos de análises de imagens.
À minha namorada (Aline) pelo amor, compreensão, companheirismo e incentivo principalmente nas decisões difíceis.
À meus tios (Andinéia e José) que não pouparam esforços em me incentivar desde a graduação até os dias de hoje.
À meus amigos irmãos Cristiano Tashima, Fernando Canas e João Paulo Schoffen por serem pessoas que estiveram a maior parte do tempo ao meu lado dando incentivo, novas idéias e ajudando nas decisões difíceis dessa jornada, sempre com humildade, sinceridade e sabedoria. Vocês são demais.
Aos amigos (as), Aline, Angélica, Angélica Cristina, Daniela, Diego, Éder, Fernanda, Ivan, Janine, Luciana, Marcela, Márcia, Priscila, Priscila Freitas, Renata e Thais que sempre me proporcionaram momentos de alegria, companheirismo e amizade tanto no local de trabalho quanto em outros locais.
À todos que embora não estejam citados aqui mas tiveram sua contribuição em meu trabalho.
RESUMO
técnica imunohistoquímica miosina-V. Para o estudo da proliferação celular da mucosa utilizamos sulfato de vincristina (1mg·/kg) (bloqueador do fuso mitótico). Cortes semi-seriados corados com hematoxilina e eosina (HE) foram utilizados para a determinação do índice metafásico, altura das vilosidades e a profundidade das criptas. Os cortes corados pelo método PAS foram utilizados para fazermos a estimativa do número de células caliciformes. O DM foi confirmado por elevados índices glicêmicos observado nos grupos UD, DG4 e DG45. Em decorrência do DM ocorreu uma redução no número de neurônios mioentéricos miosina-V imunoreativos do grupo UD e a suplementação com l-glutamina não evitou esta redução nos grupos DG4 e DG45 (p > 0,05). O índice metafásico e o número de células caliciformes não apresentaram diferenças significativas quando os grupos foram comparados (p > 0,05). Os animais do grupo DG4 e DG45 apresentaram vilos com alturas superiores a 45,5 % (p < 0,05) e 32,4 % (p > 0,05), respectivamente, quando comparados aos animais do grupo UD. As criptas analisadas apresentaram profundidade similar em todos os grupos estudados.
ABSTRACT
the PAS stained cuts to estimate the number of calyciform cells. DM was confirmed by the high levels of glycemia observed in groups UD, DG4 and DG45. Due to DM, there was a decrease in the number of myosin-V stained myenteric neurons of group UD. The l-glutamine supplementation did not prevent this reduction in groups DG4 and DG45 (p > 0.05). The metaphasic index and the number of calyciform cells showed no significant differences when the groups were compared (p > 0.05). Animals from group DG4 and DG45 presented villi 45.5% (p < 0.05) and 32.4% (p > 0.05) higher, respectively, when compared to animals from group UD. The analyzed crypts had similar depth in all of the studied groups.
APRESENTAÇÃO
A dissertação é composta por:
a) Revisão da literatura seguindo as normas da ABNT...14 b) Artigos científicos apresentados em português e em inglês, com suas respectivas
normas.
1) 1.1. Eleandro Aparecido Tronchinia, Cristiano Massao Tashimaa, Enilza Maria Espreaficob, Roberto Barbosa Bazottec, Jacqueline Nelisis Zanonia*. Avaliação quantitativa e morfométrica da população de neurônios mioentéricos imunoreativos à miosina-V do íleo de ratos diabéticos suplementados com L-glutamina. Redigido na forma exigida pela revista Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical (ISSN 1566-0702...30 1.2. Eleandro Aparecido Tronchinia, Cristiano Massao Tashimaa, Enilza Maria Espreaficob, Roberto Barbosa Bazottec, Jacqueline Nelisis Zanonia*.Quantitative and morphometrical evaluation of the myosin-stained myenteric neuron population of the ileum of diabetic rats supplemented with L-glutamine. Redigido na forma exigida pela revista Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical (ISSN 1566-0702)...54 2) 2.1. Eleandro Aparecido Tronchinia, Cristiano Massao Tashimaa, Roberto
Redigido na forma exigida pela revista Journal of Pharmacy and
Pharmacology (ISSN
0022-3573)...77 2.2. Eleandro Aparecido Tronchinia, Cristiano Massao Tashimaa, Roberto
Barbosa Bazotteb, Jacqueline Nelisis Zanonia*. Analysis of cell proliferation, villi and crypts morphormetry and goblet cell of the ileum mucosa of L-glutamine supplemented diabetic rats. Redigido na forma exigida pela revista Journal of Pharmacy and Pharmacology (ISSN
REVISÃO DA LITERATURA
O diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica caracterizada por hiperglicemia, resultante de déficit na secreção e/ou na ação da insulina, estando associada com alteração, disfunção e falência de vários órgãos, especialmente rins, nervos, coração e vasos sanguíneos (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 1997).
Esta patologia consiste em duas grandes categorias. A primeira é conseqüência de uma deficiência absoluta na secreção de insulina (diabetes tipo 1); a outra, mais comum, é uma combinação da resistência à ação da insulina e/ou inadequada resposta secretora de insulina (diabetes tipo 2) (WOLFF, 1993; DYCK; GIANNINI, 1996; AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 1997).
Ambos os tipos de diabetes a longo prazo podem acarretar complicações graves tais como: retinopatia, nefropatia e neuropatia. A maior parte das evidências experimentais e clínicas disponíveis sugerem que as complicações são uma conseqüência dos distúrbios metabólicos, principalmente da hiperglicemia (COTRAN et al., 1996; DYCK; GIANNINI, 1996; BERNSTEIN et al., 2002).
Dentre as complicações crônicas causadas pelo diabetes mellitus, as manifestações neurológicas são, provavelmente, as mais comuns, podendo afetar o sistema nervoso autonômico e periférico, prejudicando a qualidade de vida dos pacientes (McLAREN, 1976; VINIK, 1999).
Contudo, as neuropatias ocorrem no sistema nervoso periférico e atingem o sistema nervoso entérico. Alguns pacientes diabéticos apresentaram uma série de desordens no trato gastrointestinal, tais como: vômito, anorexia, naúsea, distensão abdominal, diarréia e constipação (KATZ; SPIRO, 1966; KARAKIDA et al., 1989; ZAUPA; ZANONI, 2000).
Segundo Hosking et al. (1978) as neuropatias gastrointestinais são as complicações crônicas mais comuns do diabetes mellitus. Vários autores demonstraram a redução no número de neurônios e alteração de seu tamanho em diversos segmentos intestinais de ratos diabéticos (ROMANO et al., 1996; ZANONI et al., 1997; HERNANDES et al., 2000). Karakida et al. (1989) também realizaram estudos com o trato gastrintestinal de ratos diabéticos e mostraram várias mudanças nos nervos entéricos, tais como: degeneração do axônio e redução no número de neurônios no plexo mioentérico.
O plexo mioentérico é uma rede de feixes de nervos e pequenos gânglios, localizados entre a camada muscular longitudinal e circular externa do intestino. O gânglio mioentérico varia em tamanho, forma e orientação, de espécie para espécie e de uma parte do intestino para outra (FURNESS; COSTA, 1980, 1987b; STERNINI, 1988).
Vários autores vêm analisando o comportamento destes neurônios em animais diabéticos induzidos por estreptozootocina. Eles observaram decréscimo da atividade neuronal, desenvolvimento de cromatólise seguida de mudanças degenerativas (MONCKTON; PEHOWICH, 1980) e redução na densidade neuronal, a curto ou a longo prazo, no estômago (FREGONESI et al., 2001), duodeno (BUTTOW et al., 1997), íleo (HERNANDES et al., 2000; ZANONI et al., 2003), ceco (ZANONI et al., 1997) e colo proximal (ROMANO et al., 1996).
modo, a diminuição nos níveis de glutationa reduzida aumenta a susceptibilidade das células endoteliais ao dano causado pelo estresse oxidativo (GIUGLIANO et al., 1996).
Tanto a glicose quanto a frutose podem sofrer glicolisação oxidativa. Contudo, a frutose é um substrato dez vezes melhor que a glicose para glicolisação autoxidativa (CAMERON; COTTER, 1997), uma fonte potencial para formação de radicais livres no diabetes (KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999). Este mecanismo é seguido por um processo no qual a glicose se liga quimicamente ao grupo amino de proteínas, sem a ajuda de enzimas. A glicose forma produtos de glicolisação quimicamente reversíveis com a proteína (bases de Schiff), que se reorganiza para formar produtos de glicolisação inicial do tipo Amadori mais estáveis e quimicamente reversíveis. Os produtos de glicolisação inicial (no colágeno e em outras proteínas de vida longa) presentes nos tecidos intersticiais e paredes dos vasos não sofrem dissociação e realizam uma lenta série de rearranjos químicos para formar produtos terminais de glicolisação avançada irreversível (AGE – advanced glycosylation end). Estes produtos se acumulam no transcorrer de toda vida na parede dos vasos (KIKUCHI et al., 2003; BAYNES, 1991). A formação dos AGEs pode induzir ligação covalente cruzada, resultando no endurecimento da parede do vaso (KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999).
Outro mecanismo importante é o estresse oxidativo. Quando associado ao diabetes mellitus, ele é aumentado e pode ter uma importante função na patogenia de complicações no diabetes como neuropatia e microangiopatia (VAN DAM et al., 1997; KUYVENHEVEN; MEINDERS, 1999;. HOUNSON et al., 2001; VINCENT et al., 2004). O estresse oxidativo aumentado pode ser resultado da alta produção de precursores de espécies reativas de oxigênio e/ou baixa eficiência de sistemas enzimáticos que os combatem (BAYNES, 1991;PARTHIBAN et al., 1995; VINCENT et al., 2004).
estabilidade é alcançada pela remoção de um elétron, ou de um par de elétrons de uma molécula circunvizinha. Na transferência do elétron seguinte, o radical livre original se torna estável. Porém, a molécula vira doadora, portanto, tem um elétron desemparelhado, que aumenta sua reatividade química. Deste modo, a presença de um único radical pode iniciar uma cadeia de reações de transferências de elétrons. Exemplos de espécies reativas de oxigênio: ânion superóxido (2O2-), hidroxila (OH-), óxido nítrico (NO), radical peróxido (ROO-), e o não-radical peróxido de hidrogênio (H2O2) (KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999). Estes radicais livres sofrem ação de sistemas enzimáticos como, por exemplo, a superóxido dismutase e hidroperoxidases (catálase e glutationa peroxidase) encontrados na mitocôndria e citosol.
A enzima superóxido dismutase catalisa a conversão de superóxido para peróxido hidrogênio e molécula de oxigênio:
2O2-- + 2H+→→ H2O2 + O2
A glutationa peroxidase metaboliza o peróxido de hidrogênio gerado pela superoxido dismutase, oxidando o tripeptídeo glutationa em uma forma oxidada:
GSH + H2O2 →→ GSSG + 2H2O
A catálase também transforma peróxido de hidrogênio em água e oxigênio (PARTHIBAN et al., 1995; KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999; McCORD, 2000).
A disfunção do tecido nervoso diabético pode ser provocada por efeitos diretos dos radicais livres. Eles se originam através da peroxidação lipídica das membranas do axônio e das células de Schwann, levando a uma diminuição da função das células nervosas (CAMERON et al., 1993) e/ou efeitos indiretos, que são gerados via vascular. Neste caso, a concentração elevada das lipoproteínas (LDL) no diabetes inibe o relaxamento do tecido vascular; quando estas são oxidadas tornam-se citotóxicas para vários tipos de células, incluindo as células endoteliais (MOREL; CHISOLM, 1989; BAYNES, 1991).
Outros mecanismos potenciais para o aumento do estresse oxidativo são a glicosilação autoxidativa (MARITIM et al., 2003), via do poliol, micro e macroangiopatia relacionada à hipóxia e alterações nos níveis de mediadores inflamatórios (BAYNES, 1991).
A deficiência do ácido γ-linolênico e N-acetil-L-carnitina também tem sido implicado como fator do desenvolvimento da neuropatia. O ácido linolênico é metabolizado em um importante ácido, constituinte de fosfolipídio da membrana neuronal e como um substrato para formação de prostaglandina E, o qual pode ter importante prevenção do nervo e fluxo sanguíneo. A conversão do ácido linolênico para dihomo-γ-linolênico e o subseqüente metabólito é prejudicado em pacientes diabéticos, possibilitando contribuir para a patogenia da neuropatia diabética (VINIK, 1999).
No diabetes mellitus as enzimas antioxidantes estão com seus níveis reduzidos e há um aumento na peroxidação lipídica (VIJAYALINGAM et al., 1996; CAMERON; COTTER, 1999; KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999). Dentre as enzimas antioxidantes que são afetadas em conseqüência do diabetes mellitus podemos citar a glutationa. A suplementação com glutamina pode ser promissora, visto que é precursora da glutationa e poderá atuar desta maneira na neuroproteção.
para vários tecidos (CURI et al., 2005). Este aminoácido é armazenado principalmente no músculo esquelético (75%) e fígado (25%) (VAHDAT et al., 2001). Seu peso molecular é 147,1 e pode ser sintetizado virtualmente por todos os tecidos do organismo. Na sua composição química encontramos: C (41,09%), H (6,9%), O (32,84%) e N (19,17%) (CURI, 2000). A glutamina tem um papel essencial, participando na manutenção da função de vários órgãos e células tais como: rins, intestino, fígado, coração, neurônios, linfócitos, macrófagos, células beta pancreática e adipócitos (CURI et al., 2005). Dentre suas muitas funções, este aminoácido serve como transportador primário de nitrogênio entre os tecidos. É também a principal fonte de energia para a rápida proliferação de células como, por exemplo, do epitélio intestinal, linfócitos ativados e fibroblastos (VAHDAT et al., 2001). Não é considerado um aminoácido essencial, pois pode ser sintetizado pelo organismo. Contudo, em algumas condições, como trauma, septicemia e câncer e, eventualmente, esforço físico extremo, a concentração intracelular e plasmática deste aminoácido sofre redução de até 50%. Assim, quando a demanda é maior que a produção, estabelece-se um quadro de deficiência de glutamina. Por esta razão, este aminoácido tem recebido a denominação de “condicionalmente essencial” (CURI, 2000).
O processo catabólico da glutamina adicional gera precursores para a síntese de moléculas chave, tal como a glutationa (CURI et al., 2005). Deste modo, o aminoácido é metabolizado através da enzima mitocôndrial fosfato-glutaminase, resultando em glutamato e amônia. Estes são transportados para o citosol onde o glutamato é usado na síntese de glutationa através do ciclo γ- glutamil. Na realidade, a glutamina sustenta o pool de glutamato intracelular e glutationa evitando sua depleção (AMORES-SÁNCHEZ; MEDINA, 1999; KIDD, 1997).
Figura 1. Esquema propõe interação metabólica entre neurônios e astrócitos referente à síntese de glutationa. A glutationa liberada pelo astrócito é substrato da ectoenzima y-GT. Os dipepitídeos CysGly, um produto da reação y-GT, servem como precursores neuronais da glutationa.
Fonte: Dringen et al. (1999).
Vários autores mostraram que a glutamina aumenta ou mantém os níveis da glutationa nas células. Roth et al. (2002) demonstraram que ratos tratados com glutamina apresentaram um aumento nos níveis de glutationa nas células. Flaring et al.(2003) também demonstraram que a suplementação com glutamina reduz a depleção da glutationa no músculo esquelético em humanos que sofreram trauma cirúrgico. Timothy et al. (1994) demonstraram que a suplementação com a glutamina em ratos mantém os níveis de glutationa durante a isquemia/reperfusão intestinal.
-glutamil-cisteína-glicina, considerado um dos mais importantes antioxidantes, e essencial para função de replicação da célula normal, antitoxina e cofator para enzima. Deste modo, como a cisteína contém um resíduo sulfídril que é facilmente oxidado, a glutationa se comporta como um eficiente redutor de espécie reativa de oxigênio. Em uma típica reação de redução, a espécie reativa de oxigênio está reduzida (e desativada) pela geração de uma ligação dissulfúrica entre duas moléculas de GSH, resultando assim em um par de glutationa oxidada. Uma vez que a espécie reativa de oxigênio foi desativada, duas moléculas de glutationa podem ser recuperadas pela reação de enzima catalisada através da glutationa redutase (AMORES-SÁNCHEZ; MEDINA, 1999). Esta enzima usa como fonte de elétrons a coenzima NADPH para que ocorra a reação como mostra a figura 2 (KIDD, 1997).
Vários estudos com o uso de glutationa já foram realizados. Segundo Bravenboer et al. (1992), o uso potencial de GSH em ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina é particularmente efetivo na prevenção da neuropatia diabética, mas seu valor é limitado quando a complicação já está presente. Ueno et al. (2002) demonstraram que o tratamento dietético com glutationa em ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina preveniu a disfunção neuronal e renal. Isto sugere uma potencial utilidade do tratamento dietético da glutationa para reduzir complicações diabéticas.
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Avaliação quantitativa e morfométrica da população de neurônios mioentéricos
imunoreativos à miosina-V do íleo de ratos diabéticos suplementados com L-glutamina
Eleandro Aparecido Tronchinia, Cristiano Massao. Tashimaa, Enilza Maria Espreaficob, Roberto Barbosa Bazottec, Jaqueline Nelisis Zanonia*
a
Departamento de Ciências Morfofisiológicas (DCM/UEM), Universidade Estadual de Maringá, 87020900 Maringá, PR, Brasil; bDepartamento de Biologia Celular e Molecular – USP – São Paulo; cDepartamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR, Brasil;
* Correspondência para o autor: Av. Colombo, 5790 – 87020-900 – Maringá, PR, Brasil. Tel. +55-044-32614705 Fax. +55- 044-32614340. E-mail: jnzanoni@uem.br
Número de tabelas: 2
Número de figuras: 4
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação com L-glutamina sobre os neurônios mioentéricos do íleo de ratos Wistar portadores de diabetes mellitus induzido por estreptozootocina. Os animais foram divididos em cinco grupos (n= 5): normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com L-glutamina (NG), diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com L-glutamina, a partir do 4° (DG4) ou 45° dia da indução do diabetes (DG45). O aminoácido foi adicionado à ração na quantidade de 1%. A técnica imunohistoquímica miosina-V foi utilizada para evidenciação dos neurônios mioentéricos. Foram avaliadas as áreas de corpos celulares de 500 neurônios em cada grupo estudado. A análise quantitativa foi realizada em uma área de 9.16 mm2 de cada íleo analisado. Observamos a organização do plexo mioentérico através da técnica miosina–V, onde visualizamos os plexos primário, secundário e terciário, além da presença de neurônios isolados no trajeto das fibras nervosas. Não houve diferença na densidade neuronal e na área do corpo celular dos neurônios mioentéricos miosina–V imunoreativos dos grupos DG4 e DG45 em relação ao grupo D. A suplementação com L-glutamina (1%) não causou efeito neuroprotetor sobre os neurônios miosina-V imunoreativos.
Palavras-chave: L-glutamina, diabetes mellitus, glutationa, íleo, miosina-V, plexo mioentérico, ratos, estreptozootocina.
1. Introdução
heterogêneo de desordens e apresenta uma gama extensa de anormalidades (Vinik e Mehrabyan, 2004), que podem afetar o sistema nervoso autonômico e periférico prejudicando a qualidade de vida (Vinik, 1999; Afzaal et al., 2002).
Diversos estudos vêm demonstrando alterações no plexo mioentérico de vários segmentos intestinais de ratos diabéticos, envolvendo não apenas a redução do número, mas também do tamanho dos neurônios (Romano et al., 1996; Zanoni et al., 1997; Hernandes et al., 2000; Furlan et al., 2002; Zanoni et al., 2003). Um importante fator relacionado a neuropatia diabética é o estresse oxidativo (Vinson et al., 1989; Baynes, 1991), que ocorre quando há um aumento de espécies reativas de oxigênio (EROS) (Parthiban et al., 1995; Kuyvenhoven e Meinders, 1999) e/ou uma redução da eficiência dos antioxidantes endógenos (Baynes, 1991; Kuyvenhoven e Meinders, 1999).
A L-glutamina é um aminoácido não essencial, armazenado principalmente no músculo esquelético (75%) e no fígado (25%). Dentre suas muitas funções, a L-glutamina serve como transportador primário de nitrogênio entre os tecidos e é a principal fonte de energia para a proliferação de células, tais como: do epitélio intestinal, linfócitos e fibroblastos (Vahdat et al., 2001). A L-glutamina é metabolizada através da fosfato-L-glutaminase, resultando em glutamato e amônia. O glutamato é transportado para o citosol e pode ser usado na síntese de glutationa (Amores-Sánches e Medina, 1999), mantendo assim a concentração de glutationa nas células.
O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação com L-glutamina sobre os neurônios mioentéricos imunomarcados pela miosina-V no íleo de ratos diabéticos induzidos pela estreptozootocina.
2. Materiais e métodos
2.1. Procedimento com os animais.
Todos os experimentos descritos neste trabalho foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal da Universidade Estadual de Maringá. Foram utilizados vinte e cinco ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, com 90 dias de idade. O diabetes foi induzido através da administração endovenosa de 35 mg kg-1 do peso corporal de estreptozootocina (Sigma, St. Louis, MO, USA), dissolvida em solução tampão de 10 mmol l -1
(DG45). A quantidade de alimento ingerido, de água consumida e urina eliminada foi avaliada durante cinco dias da última semana de cada mês com utilização de gaiolas metabólicas.
Os animais foram mantidos em caixas individuais, recebendo água e alimento (Nuvital® lab) ad libitum, com fotoperíodo (6:00 am – 6:00 pm) e temperatura ambiente (24ºC±2ºC) controladas. Parte dos animais recebeu ração suplementada (1%) com L- glutamina (Ajinomoto, Tokyo, Japan), preparada semanalmente.
Aos 210 dias os animais foram anestesiados com tiopental (40 mg kg-1 do peso corporal) e o sangue coletado por punção cardíaca para dosagem da glicose (Bergmeyer e Bernt, 1974).
2.2. Imunolocalização da miosina-V (Drengk et al., 2000)
PBS, BSA 2%, Triton-X-100 (0,1%) e soro de cabra (2%), em tubos eppendorf. Após a incubação, os preparados totais foram lavados duas vezes em PBS + Triton-X-100 0,1% e duas vezes em solução de PBS + Tween 0,05%. Em seguida, foram incubados em anticorpo secundário (anti coelho) conjugado com peroxidase 1: 1000 (Pierce, Rockford, USA) à TA sob agitação por 24 hs. A seguir, foram lavados quatro vezes, durante 15 minutos, em PBS + Tween 0,05%. Os preparados foram revelados com diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St. Louis, MO, USA) e montados com glicerol gel. O controle negativo foi realizado com a omissão do anticorpo primário.
2.2.2. Anticorpo miosina V
Anticorpo anticauda policlonal, gerado contra a proteína recombinante miosina-V da galinha foi caracterizado previamente (Espreafico et al., 1992). Um fragmento cDNA (que corresponde aos aminoácidos 899-1830) de um clone miosina-V cauda do cérebro de galinha foi subclonado dentro do vetor pGEX para gerar uma Glutationa transferase (GST)/ miosina cauda medial (que corresponde aos aminoácidos 1117-1435) proteína em fusão em bactéria XL1Blue. Esta GST/miosina-V cauda medial foi purificada sobre resina glutationa. Esta proteína em fusão foi usada como um antígeno para produção de anticorpo em coelhos. O soro imune foi purificado sobre uma coluna de proteína com afinidade PLM/miosina-V cauda para enriquecer IgG anticorpos direcionados contra a miosina-V cauda medial. Anticorpos secundários conjugados com peroxidase soro anticoelhos IgG foram usados (Pierce, Rockford, USA).
2.3. Analise quantitativa
(Miranda-Neto et al., 2001; Zanoni et al., 2005). Os neurônios foram contados com auxílio de microscópio BX40 Olympus sob objetiva de 40X. Foram contados 40 campos microscópicos aleatórios em cada preparado total. A área de campo microscópico foi de 0.229 mm2.
2.4. Análise morfométrica
As imagens foram capturadas por câmera de alta resolução e transferidas para computador. O perfil celular (µm2) de 100 corpos celulares em cada animal, num total de 500 neurônios para cada grupo estudado foi mensurado através de programa computadorizado de análises de imagens Image-Pro-Plus 4 (Media Cybernetics, USA). Os neurônios foram classificados em classes de 100 µm2 e foram obtidas as porcentagens de cada grupo para cada intervalo.
2.5. Análise estatística
Os dados foram analisados pelo método de quadrado mínimo, por meio de análise de variância (ANOVA), seguida de teste Tukey, que foi empregado como pós-teste para comparação de médias. Uma vez que as áreas dos corpos celulares dos neurônios não apresentavam uma distribuição normal, utilizamos a análise de variância e teste “t de Student” para comparação das médias. As análises foram realizadas com software Prisma 3.0. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± EP).
3. Resultados
animais do grupo UD (p > 0,05) (tabela 1). A condição diabética foi mantida durante o período de estudo, pois a glicemia apresentava-se elevada em todos os grupos diabéticos investigados. A síndrome diabética foi também confirmada pela presença de polifagia, poliúria e polidpsia (tabela 1). A suplementação com L-glutamina não reverteu estes parâmetros.
Com a técnica imunohistoquímica miosina-V, pudemos observar os três componentes do plexo mioentérico (Fig. 1). O plexo primário foi bem evidenciado, sendo constatada a presença de gânglios e fibras nervosas interganglionares. No trajeto das fibras nervosas do plexo primário observamos a presença de neurônios isolados. Os plexos secundários e terciários apresentavam-se bastantes evidentes. As fibras nervosas do plexo secundário corriam paralelamente às células musculares da camada circular da túnica muscular. O plexo terciário era formado por finas fibras nervosas, situadas entre os espaços deixados pelo plexo primário (Fig. 1). A Fig. 2 mostra os neurônios mioentéricos miosina-V imunoreativos observados nos cinco grupos (UN, NG, UD, DG4, DG45). Observamos uma diferente intensidade na marcação dos neurônios nos gânglios mioentéricos (Fig. 2).
Verificamos uma redução de 22,90% na densidade neuronal no íleo dos animais do grupo UD quando comparados aos normoglicêmicos não tratados (UN) e normoglicêmicos tratados com L-glutamina (NG) (p > 0,05). A densidade neuronal dos animais dos grupos DG4 e DG45 foi similar à observada nos diabéticos não tratados (UD) (p > 0,05) (Fig. 3).
faixa para os grupos UN, NG, UD, DG4 e DG45 foi de 82,2%, 89,6%, 84,4%, 92,2% e 88,4% respectivamente, como mostra a Fig. 4.
4. Discussão
Nosso modelo de diabetes experimental mostrou-se eficiente, pois observamos aumento do consumo diário de água, ração, glicemia, além de menor peso corporal nos animais dos grupos UD, DG4 e DG45 quando comparado aos animais normoglicêmicos (grupos N e NG).
et al., 2004). Portanto, a hiperatividade da via poliol reduz os níveis de glutationa, levando a um aumento nas espécies reativas de oxigênio (Nakamura et al., 2002). Esta redução está relacionada ao aumento da atividade aldose redutase que consome NADPH, a qual também é requerida para a formação da glutationa reduzida (Tesfamariam, 1994; Giugliano et al., 1996). Com relação aos grupos diabéticos tratados com L-glutamina (DG4 e DG45), verificamos que a suplementação com L-glutamina não evitou a redução do número de neurônios mioentéricos, quando comparado ao grupo UD. Resultados semelhantes foram observados por Zanoni et al. (2003) no íleo de ratos diabéticos tratados com acido ascórbico. A suplementação com L-glutamina nos animais do grupo DG4 foi realizada para prevenir o desenvolvimento da neuropatia diabética. Nos animais do grupo DG45, a suplementação teve por objetivo atuar como um tratamento. Contudo, a suplementação com L-glutamina tanto na prevenção como na reversão desta patologia não foi positiva. Shotton et al. (2004) também analisaram a prevenção e a reversão do diabetes em nervos entéricos do íleo de ratos diabéticos com tratamento combinado de ácido α-lipólico e ácido γ-linolênico. Neste experimento, Shotton et al. (2004) examinaram imunohistoquimicamente nervos que expressam para o polipeptídeo vasoativo intestinal (VIP), peptídeos relatado-gene calcitonina (CGRP) e noradrenalina (NA). Verificou-se que as administrações de ácido α-lipólico e ácido γ-linolênico preveniram e reverteram parcialmente as mudanças induzidas pelo diabetes em nervos VIP e CGRP, embora individualmente nenhum tratamento foi efetivo.
ciclo γ-glutamyl produzindo a GSH. Esta é produzida por glutamato, glicina e cisteína (Matés et al., 2002), os quais elevam a concentração da GSH e aumentam a produção de NADPH. Isso irá subseqüentemente aumentar a taxa de GSH/GSSH (Curi et al., 2005), ajudando a reduzir o quadro de ROS. Estudos executados por Roth et al. (2002) demonstraram que ratos alimentados com L-glutamina exibiram um aumento no conteúdo celular de GSH. Uma hipótese para nossos resultados não terem sido significativos com a suplementação da L-glutamina deve-se ao fato de vários mecanismos estarem produzindo ROS. Dentre estes estão: a via do poliol, a glicosilação autoxidativa, a redução dos antioxidantes e a redução da eficiência do sistema enzimático (Vincent et al., 2004). Portanto, um tratamento combinado de substâncias já estudadas individualmente (como o ácido ascórbico (Zanoni et al., 2003) ou acetil-l-carnitina (Miranda–Neto et al., 2005)) com a L-glutamina poderia ser efetivo, pois desta maneira os ROS seriam neutralizados por mecanismos diferentes.
Ao analisarmos a distribuição da população neuronal em classes arbitrárias em intervalos de 100 µm2, verificamos que apesar da variabilidade observada no tamanho da área do perfil neuronal (47,301 a 855,102 µm2), a maioria dos neurônios em ambos os grupos apresentou uma área do perfil celular na faixa de 101 a 400 µm2. Isto indica a uniformidade na distribuição neuronal entre os grupos.
Em síntese, o presente resultado mostrou que a suplementação com L-glutamina (1%) não teve efeito sobre os neurônios mioentéricos miosina-V imuoreativos, evidenciado pelo fato de não se encontrar diferenças significativas entre o número total e área dos perfis celulares nos neurônios dos grupos diabéticos suplementados ou não com L-glutamina.
Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio da MSc. Priscila de Freitas, Maria Euride do Carmo Cancino, Maria dos Anjos Fortunato, Valdir Trombeli e José Antonio de Souza pelo excelente apoio técnico.
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Tabela 1- Glicemia (GI), peso corporal inicial e final (PCI e PCF), consumo diário água
(CDA), consumo diário de ração (CDR) e eliminação diária de urina (EDU) nos animais dos grupos: normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com glutamina (NG), diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com glutamina (DG4), diabéticos tratados com glutamina (DG45).Todos os resultados foram expressos como media ± EP da média.
Parámetros UN NG UD DG4 DG45 GI mg.dl-1 158.1 ± 9.3a 143.2 ± 7.1a 649.6 ± 36.5b 524.7 ± 44.8c 500.5 ± 28.4c PCI.g-1 330.6 ± 8.5a 300.3 ± 9.3a 314.8 ± 9.2a 328.0± 8.2a 312.4 ± 9.0a PCF.g-1 480.3 ± 10.7a 406.4 ± 13.4b 309. 3± 17.7c 292.1 ±10.9c 286.7 ± 18.5c CDA. ml-1 54.35 ± 2.6a 49.2 ± 1.35a 185.7 ± 11.7b 213.3 ± 7.0b 160.6 ± 5.0b CDR.g-1 32.1 ± 0.75a 28.77 ± 1.1a 50.8 ± 2.1b 54.82 ± 1.2b 48.3 ± 2.5b EDU.ml-1 12.82 ± 1.7a 10.7 ± 1.6a 101.7 ± 5.5b 127 ± 7.0c 88.7 ± 3.8b
Fig. 1. Micrografias mostrando os componentes do plexo mioentérico do íleo de ratos
Fig. 2. Micrografias do plexo mioentérico do íleo de ratos mostrando gânglios mioentéricos
Fig. 3 - Número de neurônios mioentéricos imunomarcados pela
miosina-V em uma área de 9,16 mm2 observados no íleo de ratos. Grupos: normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com L-glutamina (NG), diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com L-glutamina (DG4), diabéticos tratados com L-glutamina (DG45). Todos resultados foram expressos como média ± erro padrão. n= 5 ratos por grupo. p > 0,05 quando todos grupos foram comparados
Tabela 2 – Médias e erros padrões da área dos corpos
celulares dos neurônios miosina-V imunoreativos nos grupos: normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com L-glutamina (NG), diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com L-glutamina (DG4), diabéticos tratados com L-L-glutamina (DG45). n= 5 ratos por grupo
Grupo Miosina-V UN 273.5 ± 17.17 NG 255.4 ± 5.268 UD 286.6 ± 11.59 DG4 285.5 ± 21.16 DG45 274 ± 12.91
Fig. 4 - Distribuição por tamanho dos neurônios mioentéricos imunomarcados pela
Quantitative and morphometrical evaluation of the myosin-stained myenteric neuron
population of the ileum of diabetic rats supplemented with L-glutamine
Eleandro Aparecido Tronchinia, Cristiano Massao Tashimaa, Enilza Maria Espreaficob, Roberto Barbosa Bazottec, Jacqueline Nelisis Zanonia *
a
Department of Morpho-physiological Sciences (DCM/UEM), State University of Maringá, 87020900 Maringá, PR, Brazil; bDepartment of Cellular and Molecular Biology - USP - São Paulo; cDepartment of Pharmacy and Pharmacology , State University of Maringá, Maringá, PR, Brazil;
* Corresponding Author: Av. Colombo, 5790 - 87020-900 - Maringá, PR, Brazil. Tel. +55-044-32614705 Fax. +55 - 044-32614340. E-mail: jnzanoni@uem.br
Number of tables: 2
Abstract
The objective of this work was to evaluate the effect of the L-glutamine supplementation on the myenteric neurons of the ileum of Wistar rats with diabetes mellitus induced by streptozotocin. The animals were divided in five groups (n = 5): non treated normoglycaemic (UN), normoglycaemic treated with L-glutamine (NG), non treated diabetics (UD), diabetics treated with L-glutamine, from the 4th (DG4) or 45th day of the diabetes induction (DG45). The amino acid was added to the diet at 1 %. The immunohistochemical technique myosin-V was used to stain the myenteric neurons. We assessed the cellular body areas of 500 neurons in each studied group. The quantitative analysis was carried out in an area of 9.16 mm2 of each analyzed ileum. We observed the organization of the myenteric plexus employing the myosin-V technique; we visualized the primary, secondary and tertiary plexus, besides the presence of isolated neurons in the nervous fibers path. There was no difference in the neuronal density and in the cellular body area of the myosin-stained myenteric neurons of groups DG4 and DG45 when compared to group D. The L-glutamine supplementation (1%) did not have a neuroprotector effect on the myosin-V stained myenteric neurons.
Keywords: L-glutamine, diabetes mellitus, glutathione, ileum, myosin-V, myenteric plexus, rats, streptozotocin.
1. Introduction
caused by the diabetes mellitus. The diabetic neuropathy is a heterogeneous group of disorders, with an extensive range of abnormalities (Vinik and Mehrabyan, 2004), that can affect the autonomous and peripheral nervous system harming the quality of life of individuals (Vinik, 1999; Afzaal et al., 2002).
Many studies have demonstrated alterations in the myenteric plexus of several intestinal segments of diabetic rats, not just regarding the reduction on the number, but also on the size of neurons (Roman et al., 1996; Zanoni et al., 1997; Hernandes et al., 2000; Furlan et al., 2002; Zanoni et al., 2003). An important factor related to the diabetic neuropathy is the oxidative stress (Vinson et al., 1989; Baynes, 1991), which happens when there is an increase of reactive oxygen species (ROS) (Parthiban et al., 1995; Kuyvenhoven and Meinders, 1999) and/or a reduction on the efficiency of the endogenous antioxidants (Baynes, 1991; Kuyvenhoven and Meinders, 1999).
L-glutamine is a non essential amino acid, stored mainly in the skeletal muscle (75%) and in the liver (25%). Among its multiple functions, the L-glutamine serves as primary carrier of nitrogen among the tissues and it is the main source of energy for the cells proliferation, in the intestinal epithelium, lymphocytes and fibroblasts (Vahdat et al., 2001). L-glutamine is metabolized through the phosphate-L-glutaminase, resulting in glutamate and ammonia. The glutamate is transported to the citosol and it can be used in the synthesis of glutathione (Amores-Sánches and Medina, 1999), thus, maintaining the glutathione concentration in the cells.
The objective of this work was to evaluate the effect of the L-glutamine supplementation on the myosin-V-stained myenteric neurons in the ileum of streptozotocin-induced diabetic rats.
2. Materials and methods
2.1. Procedure with the animals
(DG45). The amount of food intake, water consumption and eliminated urine were assessed for five days of the last week of every month, with use of metabolic cages.
The animals were kept in individual cages, receiving water and food (Nuvital® lab) ad libitum, with a photoperiod (6:00 am - 6:00 pm) and at controlled room temperature (24ºC±2ºC). Some animals were fed chow supplemented with L-glutamine (1%) (Ajinomoto, Tokyo, Japan), prepared weekly.
On the 210th day, the animals were anesthetized with sodium thiopental (40 mg kg-1 of body weight) and their blood collected by heart puncture to measure the glucose (Bergmeyer and Bernt, 1974).
2.2. Immunolocalization of myosin-V (Drengk et al., 2000)
Triton-X-100 (0.1%) and twice in the solution of PBS + Tween 0.05%. They were incubated in secondary antibodies (anti rabbit) conjugated with peroxidase 1:1000 (Pierce, Rockford, USA) at RT, by shaking for 24 h. They were then rinsed 4 times, during 15 minutes, in PBS + Tween 0.05%. The tissues were developed with diaminobenzidine (DAB) and mounted in glycerol gel. The negative control was performed with the lack of primary antibody.
2.2.2. Antibody myosin-V
The polyclonal antibody anticauda, generated against the chicken recombining protein myosin-V, has already been characterized previously (Espreafico et al., 1992). A cDNA fragment (that corresponds to the 899-1830 amino acids) of a myosin-V clone of the chicken brain caudal was sub cloned inside the pGEX vector to generate a Glutathione transferase (GST)/myosin medial cauda protein (that corresponds to the 1117-1435 amino acids) fused in XL1Blue bacteria. This GST/myosin-V medial cauda was purified on glutathione resin. This fusing protein was used as an antigen for the production of antibodies in rabbits. The immune serum was purified on a protein column with affinity to PLM/myosin-V cauda to enrich the IgG antibodies directed against the myosin-PLM/myosin-V medial cauda. Secondary antibodies conjugated with IgC anti rabbit peroxidase serum were used (Pierce, Rockford, USES).
2.3. Quantitative analysis
2.4. Morphometric analysis
The images were taken with a high-resolution camera and sent to a microcomputer. The cell profile (µm2) of 100 cell bodies for each animal was measured through the image-analyses software Image-Pro-Plus 4, in a total of 500 neurons for each studied group. Neurons were classified at 100 µ m2 classes and the percentage of each group was calculated for each interval.
2.5. Statistical analysis
The data were analyzed by the minimum squares method, through the Variance Analysis (ANOVA), followed by Tukey test, which was used as a post-test to compare the means. Since the areas of the cell bodies did not present a similar distribution, we employed the Variance Analysis and Student “t” test to compare the means. The analyses were carried out with the software Prisma 3.0. The results are shown as means ± standard error (M ± SE).
3. Results
We verified in this study that the diabetic rats (groups UD, DG4 and DG45) did not gain weight in the same proportion as the animals from the normoglycaemic groups (UN and NG) (p < 0.05) (table 1). The L-glutamine supplementation did not alter the final body weight of rats from groups DG4 and DG45 when compared to the animals from group UD (p > 0.05) (table 1). The diabetic condition was kept throughout the studied period, since glycaemia levels were maintained in all of the investigated diabetic groups. The diabetic syndrome was also confirmed by the polyphagia, polyuria and polydipsia (table 1). The L-glutamine supplementation did not alter these parameters.
ganglions and interganglion nerve fibers. Isolated neurons were observed in the path of the nerve fibers of the primary plexus. The secondary and tertiary plexuses were quite evident. The nerve fibers of the secondary plexus ran parallel to the muscular cells of the circular layer of the muscular tunica. The tertiary plexus was formed by fine nerve fibers, situated between the spaces left by the primary plexus (Fig. 1). Figure 2 shows the myenteric neurons stained by myosin-V found in the five groups (UN, NG, UD, DG4 and DG45). We observed a different intensity in the neurons staining in the myenteric ganglions (Fig. 2).
There was a 22.90% reduction in the neuronal density in the ileum of animals of group UD when compared to the non-treated normoglycaemic (UN) and the normoglycaemic treated with L-glutamine (NG) (p > 0.05). The neuronal density of animals of groups DG4 and DG45 was similar to that observed in the non-treated diabetics (UD) (p > 0.05) (Fig. 3).
The cell profile area of the myosin-V stained-neurons of animals of group UD was 4.6 % larger when compared to the animals of group UN (p > 0.05) (table 2). The L-glutamine supplementation (group DG4 and DG45) did not change these results, with means similar to group UD (p > 0.05). Most neurons had cell profiles that varied from 101 to 400 µm2. The proportion of neurons in this range for groups UN, NG, UD, DG4 and DG45 was of 82.2%, 89.6%, 84.4%, 92.2% and 88.4% respectively, as shown in Fig. 4.
4. Discussion
Our experimental model of diabetes was efficient, since there was an increase on the daily water consumption, food intake and glycaemia; the animals of groups UD, DG4 and DG45 had a smaller body weight when compared to the normoglycaemic animals (groups U N and NG).
this technique to stain myenteric neurons in different areas of the gastrintestinal tract (Buttow et al., 2003, 2004; Zanoni et al., 2003, 2005; Schoffen et al., 2005). The myosin-V is a versatile motor protein and it is involved in the fast transport of vesicles from the dendrites to the axon (Langford, 2002). This technique is used as marker of the overall neural population because the myosin-V is present in cell bodies and nerve fibers. With this technique, we are able to observe the organization of the myenteric plexus in the ileum. We verified the presence of the three components that compose this plexus (primary, secondary and tertiary). This arrangement resembles the one described initially by Auerbach in 1864 and by several other authors later, including Furness and Costa (1980). The different demarcation intensity in the myenteric neurons inside the ganglions was seen in all studied groups. According to Drengk et al. (2000), this heterogeneity in the coloration intensity may indicate different levels of neuronal activity.
membranes and the Schwann cells, causing a decrease on the function of nerve cells (Cameron et al., 1993) and/or indirect effects, that are vascular generated. In this case, the high concentration of lipoproteins (LDL) in the diabetes mellitus inhibits the vascular tissue relaxation, because when they are oxidized they become cytotoxic to several types of cells, including endothelial cells (Morel and Chilsom, 1989; Baynes, 1991). c) - decrease on the levels of endogenous antioxidants. The glutathione levels are reduced during the hyperglycaemia leading to an increase in the reactivate oxygen species (Parthiban et al., 1995; Greene et al., 1999; Vincent et al., 2004). Glutathione is an important antioxidant in most cells of mammals (Vincent et al., 2004). This substance serves as an essential cofactor for the glutathione peroxidase enzyme, which removes hydroperoxidase, and the formation of oxidized glutathione (GSSG). The reduced glutathione (GSH) is regenerated by the enzyme glutathione reductase using NADPH (Parthiban et al., 1995; Vincent et al., 2004). Therefore, the hyperactivity of the polyol pathway reduces the glutathione levels, causing an increase in the ROS (Nakamura et al., 2002). This reduction is related to the increase of the aldose reductase activity that consumes NADPH, which is also necessary for the formation of the reduced glutathione (Tesfamariam, 1994; Giugliano et al., 1996).
