Pesquisa exploratória, de caráter experimental que avaliou a eficácia do cupuaçu como agente cicatrizante em feridas cutâneas, induzidas cirurgicamente no dorso de cobaias, para avaliar o tempo de cicatrização, as variações macroscópicas e microscópicas do tecido cicatricial.
Experimento animal
Foram utilizados vinte ratos Wistar, machos, adultos, com peso variando entre 200 a 250 gramas, aclimatados no biotério da UNINOVAFAPI, distribuídos em cinco gaiolas nas quais receberam ração e água a livre demanda diariamente e distribuídos aleatoriamente, em ambiente com temperatura controlada (22ºC) e ciclo caro/escuro de 12h. Neste local os animais foram mantidos durante todo o período experimental e foram coletados os dados para avaliação clínica e histológica. O material foi analisado em um Laboratório particular do município de Teresina. Estes provenientes do criador Francisco de Assis da Silva Filho (CPF 809. 789. 833-00). Foram alocados em quatro grupos. Grupo controle tratado com água destilada, grupo teste tratados com Theobroma glandiflorum, sendo este subdivido em três grupos: Puro, 1/1 e 1/2. Cada grupo contendo 5 animais.
Preparo do material e formulações
Foi preparada uma formulação a partir da semente do cupuaçu (Theobroma grandiflorum), obtido através da secagem e trituração das sementes.
Por se tratar de uma substancia oleaginosa, não diluente em água, foi preciso adicionar DMSO (Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo) para formulação das concentrações de 1:1 e 1:2 conforme a figura 1.
O DMSO é um líquido orgânico, límpido, incolor, ligeiramente oleoso, sem odor em sua forma pura, derivado da lignina. Sua molécula, C2H6SO, é anfipática com grande domínio polar e a presença de dois grupos metil, apolares, resulta em solubilidade tanto em meio aquoso como em meio orgânico (PICOLI, 2015).
Para o preparo da formulação de 1/1 foi utilizado 500 mg da pomada, 100 µl de DMSO e 400 µl de água destilada, já na formulação de 1/2 foram utilizados 1000 mg da pomada, 300 µl de DMSO e 1700 µl de água destilada.
Tratamento
Os animais foram submetidos à anestesia intraperitoneal. Após a administração, realizou-se a epilação por tração manual no dorso de cada animal, para ter uma melhor visualização da lesão confeccionada posteriormente, de 1 cm no centro da área epilada. Logo após foi iniciado o tratamento dos animais, cada um a seu grupo correspondente. Grupo controle 50 µL de água destilada, grupo puro 50 mg da pomada pura e grupos 1/1 e 1/2 50 µL das formulações correspondentes. Figura 2.
Figura 1. Formulação das concentrações 1/1 e 1/2.
Adição da substancia pura, DMSO e água destilada.
Figura 2. Fotografia da área epilada por tração manual (A). Lesão 1 cm no dorso do animal (B).
Após a administração os animais foram alojados em gaiolas individuas As aplicações foram repetidas diariamente, sempre no mesmo horário.
Análise dos dados
Todos os animais tiveram suas lesões fotografadas com celular modelo O Samsung Galaxy J2. Câmera de 5 megapixel. Os dados assim obtidos do processo de cicatrização, no 7º, 14º e 21º dias. A avaliação da cicatrização foi realizada em todos os animais mediante a mensuração da área de retração do ferimento com um paquímetro digital.
Estatística
Os resultados de todas as fases foram expressos com a média e erro padrão da média para todos os experimentos. Os dados paramétricos analisados pela ANOVA, seguido pelo teste t-Student-Newman-Keuls como post hoc teste. Por sua vez os dados não paramétricos foram analisados pelo teste de qui-quadrado pelo software GraphPad Prisma® 5.00. As diferenças serão consideradas significativas quando p<0,05.
Aspectos éticos
O estudo foi realizado no Laboratório de cirurgia experimental do Centro Universitario UNINOVAFAPI. O estudo foi aprovado pelo CEUA da IES com este número de protocolo 007p-v3/18.
RESULTADOS
Evolução pós operatório e exame da ferida.
O ato operatório de todos os animais transcorreu sem complicações. Todos os ratos recuperam-se bem da anestesia. Não houve óbitos. As avaliações clínicas diárias mostraram adequada recuperação, com manutenção do estado geral, presença de atividade física e disposição para alimentar-se no grupo controle e os grupos teste.
A evolução da ferida cutânea nos ratos do grupo controle e nos grupos Treobroma glandiflorum mostrou exsudação e formação de crostas delicadas até o 7º dia de pós-operatório. A partir do 7º dia, houve espessamento da crosta, que passou a destacar espontaneamente a partir do 14º dia; evoluindo para epitelização no 21º dia de pós-operatório, com crescimento de pelos em torno da lesão (Figuras 3, 4 ,5 e 6).
Na avaliação macroscópica, observou-se que nenhum animal apresentou secreção purulenta na ferida e houve formação de crosta, que é resultado do preenchimento da lesão por coágulos de fibrina e exsudatos (Correa, 2016).
A área da ferida diminuiu gradativamente com a evolução do tempo. Como pode ser observado no gráfico, as áreas das feridas diminuíram progressivamente de maneira significativa em ambos os grupos com a evolução.
Figura 3. CN. A 7ª dia, B 14ª dia e C 21ª dia. Figura 4. Puro. A 7ª dia, B 14ª dia e C 21ª dia.
Podemos verificar que após uma semana (7 dias) do tratamento da lesão com a substância pura (6,44 ± 1,01) o correu uma contração significativa (p>0,05), bem como na concentração de 1/1 (7,25 ± 1,36) quando comparado com o grupo controle negativo (9,62 ± 0,09). Não foi verificado diminuição da área de contração nos animais tratados com a concentração de 1/2 (9,90 ± 0,05). Com 14 dias de tratamento foi observado redução significativa (p>0,05) para todas as concentrações testadas (puro: 3,03 ± 0,43; 1/1: 2,50 ± 0,58; 1/2: 3,45 ± 0,76) em relação ao grupo controle negativo (6,24 ± 0,65), bem como foi verificado após 21 dias de tratamento para todas as doses testadas (puro: 0,28 ± 0,28; 1/1: 1,08 ± 0,32; 1/2: 1,51 ± 0,83) em comparação ao grupo controle (4,21 ± 0,69).
Avaliação microscópica
Na análise dos cortes histológicos, verificou-se ao fim dos 21 dias pós- cirúrgico, a fase de remodelação do processo de cicatrização normal do tecido.
Gráfico 1. Medida da contração da área cirúrgica dos ratos entre os grupos controle (Cn)
Evidenciou um epitélio bem formado, fibras colágenas, capilares, pelos, glândulas sebáceas e inervações. Grupo controle negativo (CN) apresentou um epitélio mais fino e sem formação de queratina e poucos capilares, assim, uma cicatrização mais tardia. Já o grupo puro (GP) apresentou um tecido totalmente hígido, configurando assim, uma cicatrização completa (Figuras 7, 8, 9 e 10).
Figura 8. Grupo Puro. A e B Tecido completamente hígido. Espessa camada de
epitélio e espessa camada de queratina. Tecido conjuntivo com bastante fibras colágenas. Aumento (40x).
Figura 7. CN. Formação de pelo; fina camada de
epitélio, poucos capilares e ausência de queratina. Configura uma cicatrização tardia. Aumento (4x).
DISCUSSÃO
Segundo Fleck (2012), o cupuaçú é rico em fitoesteróis, ou esteróis vegetais (poliesteróis combatem radicais livres), que beneficia a pele seca e danificada e polifenóis que combate os danos dos radicais livres e ácidos graxos. Os ácidos gordurosos contidos na manteiga cupuaçu protegem e hidratam a pele, sendo esses de cadeia longa que são, na verdade, triglicerídeos que possuem um equilíbrio de ácidos graxos saturados e insaturados que proporcionam manteiga baixo ponto de fusão, facilitando a rápida absorção pela pele, agindo à nível celular regula a atividade da camada lipídica, estimulano processo cicatricial.
Figura 9. G 1/1. Δ Glândulas sebáceas e folículo piloso. Formação de inervação. Aumento
(10x). (A) e G 1/1. Espessa camada de epitélio e filetes de queratina. Aumento (40x). (B).
Figura 10. G 1/2 . Δ Folículo piloso. Fibras colágenas . Aumento (10x). (A) e G 1/2 Capilares (vaso
Do mesmo modo que o própolis o cupuaçu apresenta em sua constituição esteroides vegetais, flavonoides mais especificamente os, que são considerados os principais responsáveis pelos efeitos terapêuticos da própolis, possuindo ação antibacteriana, antiviral, antioxidante, cicatrizante, imunomoduladora, antiinflamatória, analgésica, regenerativa de cartilagens e ossos e vasodilatadora (Batista, 2015).
O rato da linhagem wistar é amplamente utilizado em estudos experimentais (Crisci, 2015). Escolhido por ser de pequeno porte, de fácil aquisição e padronização no que diz respeito à idade, peso, sexo, alojamento, alimentação, cuidados de limpeza e manipulação experimental. Ele ainda apresenta boa resistência à manipulação e agressão cirúrgica, às infecções e podem ser utilizados em amostras significativas.
Muitas pesquisas que envolvem fitoterápicos são desenvolvidas em decorrência de informações terapêuticas obtidas do conhecimento da medicina popular (Marteline, 2018). O estudo dos fitoterápicos é extremamente complexo, pois diante da grande variedade de plantas com propriedades terapêuticas, muito ainda se tem a descobrir sobre os princípios ativos, isolamento, mecanismo de ação e efeitos colaterais (Macedo et al., 2017).
A revisão da literatura médica nas bases de dados da PubMed, MEDLINE, SciELO, não identificou nenhum trabalho clínico ou experimental que tenha avaliado o Theobroma gradiflorum no processo de cicatrização de ferida aberta no dorso de ratos. Desta forma, parece justificável, a realização do presente estudo.
A pomada tanto na forma pura, quanto diluída mostrou-se eficaz no tratamento. Os resultados mostraram que esta solução apresentou eficiência significativa no auxílio da reparação cicatricial de feridas cutâneas em ratos, corroborando com alguns estudos com plantas da mesma família, como a Malva. Ecker et al. (2015) aponta que esta planta apresenta atividade inibitória contra algumas infecções, demonstrando assim, um grande potencial anti-inflamatório, devido a substâncias como a mucilagem, flavonóides e taninos, que podem ajudar na cura de feridas.
Em todos os animais do grupo teste (Puro, 1/1 e 1/2) comparada as lesões controle e Theobroma grandiflorum, nota-se que houve diferenças entre elas, já que as lesões tratadas com o Theobroma grandiflorum apresentaram crosta mais espessa, indicando assim que ocorreu uma reparação tecidual mais acelerada. Em
estudo semelhante (Correa et al., 2016), observou na avaliação macroscópica, que nenhum animal apresentou secreção purulenta na ferida e houve formação de crosta, que é resultado do preenchimento da lesão por coágulos de fibrina e exsudatos.
Avaliação histopatológica
A última fase do processo de cicatrização é a colageneização, fase em que ocorre a maturação e remodelagem da matriz extracelular. Esta etapa é caracterizada pela grande e acelerada deposição de colágeno na lesão e é durante este período que a cicatriz adquire sua máxima resistência tênsil (Medeiros, 2016). Com relação à colageneização, ver-se uma colageneização acentuada em todos os grupos.
Na fase de remodelação, o colágeno é o principal componente da derme, sendo que nesta etapa ocorre a mudança do tipo de colágeno que a compõe. Onde a disposição do colágeno tipo III é inicialmente abundante, mas vai sendo degradado ao longo do processo de cicatrização. Em contraponto, o colágeno de Tipo I vai tendo sua produção aumentada por ação dos fibroblastos (Szwed, 2015).
A camada córnea mais externa da pele, é formada por queratinócitos que perderam suas organelas e núcleo, apresentam forma achatada e destacam-se da pele no processo de renovação celular. As células que a compõem são constituídas predominantemente por queratina, uma proteína que confere elasticidade e resistência (Pavani, 2016).
O grupo CN além de apresentar uma fina camada de epitélio, ainda apresentou uma formação sutil de queratina, o que demonstra uma cicatrização mais tardia. O que colabora com a análise amostral do gráfico,
pois ao fim dos 21 dias apresentou uma média de retração de (4,21 ± 0,69).
O emprego do Theobroma gradiflorum no processo de cicatrização de feridas cutâneas em seres humanos permanece ainda campo aberto a estudos, no entanto é importante que se amplie o estudo experimental em animais com dosagens menores, além do isolamento do componente ou componentes do responsáveis pela influência positiva no processo de reparação de tecidos.
Os resultados do presente estudo permitem concluir que o uso tópico Theobroma gradiflorum apresenta efeito significativo na cicatrização da pele de ratos em relação à área cirúrgica, sugerindo efeito benéfico do processo cicatricial. Novas pesquisas devem ser conduzidas de maneira criteriosa quanto à caracterização do produto utilizado, bem como o seu mecanismo de ação, favorecendo, dessa forma, um maior interesse de indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de produtos fitoterápicos com qualidade comprovada, servindo como incentivo para realização de estudos posteriores.
REFERENCIAS
Assis M, Morelli-Amaral V, Pimenta, F (2015). Grupos de pesquisa e sua produção científica sobre plantas medicinais: um estudo exploratório no Estado do Rio de Janeiro. Revista Fitos 9(1):1-72.
Correa J, Monteiro E, Pavanelli M, Biazon A (2016). Influência do extrato hidroetanólico das folhas de Tropaeolum majus na restauração tecidual em lesões cutâneas. Revista Saúde e Pesquisa 9(1): 101-109.
Crisci A, Cassemiro C, Borges C, Oliveira F, Jorge M (2015). Avaliação da exposição e da interrupção da nicotina durante a cicatrização em ratos wistar. Revista Saúde e Pesquisa 1(8): 85-95.
Ecker A, Martinsa I, Kirscha L, Lima L, Stefenonb L, Mozzini C (2015). Efeitos benéficos e maléficos da Malva sylvestris. Journal of Oral Investigations 4(1):39-43.
Fleck C, RN, BSN, MBA, APN/CNS, ET/WOCN, CWS, CFCN, DNC, FACCWS,Mackenzie Newman, MS (2012). Advanced Skin Care – A Novel Ingredient. Journal of the American College of Clinical Wound Specialists 4:92– 94.
Hasenclever L , Paranhos J, Costa C, Cunha G, Vieira D (2017). A indústria de fitoterápicos brasileira: desafios e oportunidades. Ciência & Saúde Coletiva. 22(8):2559-2569.
Lima I, Nascimento L, Silva M (2016). Comercialização de Plantas Medicinais no Município de Arapiraca-AL. Revista Brasileira de Plantas Medicinais., 2(18): 462-472.
Macedo J, Pereira I, Oliveira A, Magalhães M (2017). Eficácia da fitoterapia no processo de cicatrização tecidual de pacientes com diagnóstico de diabetes mellitus. Portuguese ReonFacema 3(1): 396-400.
Martelli A, Andrade T, Santos G (2018). Perspectivas na utilização de fitoterápicos na cicatrização tecidual: revisão sistemática. Arch Health Invest 7(8): 344-350. Medeiros A, Dantas A (2016). Cicatrização das feridas cirúrgicas. Journal of surgical
and clinical research 7(2): 87-102.
Pavani A, Fernandes T(2017). Plasma rico em plaquetas no rejuvenescimento cutâneo facial: uma revisão de literatura. Revista UNINGÁ 1(29):227-236.
Picoli T, Barbosa J, Vargas G, Hübner S, Fischer G (2015). Toxicidade e eficiência do dimetilsulfóxido (dmso) no congelamento de células madin-darby bovine kidney (mdbk). Science And Animal Health 3(2): 159-168.
Szwed D, Santos V (2015). Fatores de crescimento envolvidos na cicatrização de pele. Caderno da Escola de Saúde 15(1): 7-17.
Xangai G, Araújo A, Pereira T, Araújo L, Vargas, C, Colla E., Silva J (2015). Produtos Brasileiros patenteados por estrangeiros: Biopirataria - Um estudo bibiográfico. INTESA – Informativo Técnico do Semiárido 9 (2):30-36.