CENTRO UNIVERSITÁRIO DE SAÚDE, CIÊNCIAS HUMANAS E TECNOLÓGICAS DO PIAUÍ- UNINOVAFAPI
COORDENAÇÃO DE BIOMEDICINA
ERICA CAROLINE DE LIMA DE SÁ
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CICATRIZANTE DO CUPUAÇU (THEOBROMA
GLANDIFLORUM) EM FERIDAS CUTANEAS INDUZIDAS EM RATOS WISTAR
TERESINA – PI 2018
ERICA CAROLINE DE LIMA DE SÁ
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CICATRIZANTE DO CUPUAÇU (THEOBROMA
GLANDIFLORUM) EM FERIDAS CUTANEAS INDUZIDAS EM RATOS WISTAR
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Centro Universitário de Saúde, Ciências Humanas e Tecnológicas do Piauí – UNINOVAFAPI como requisito parcial para
obtenção do Grau em Bacharel em
Biomedicina.
Orientadora: Msc. Janayna Batista Barbosa de Sousa
TERESINA – PI 2018
FICHA CATALOGRÁFICA
Catalogação na publicação Antonio Luis Fonseca Silva– CRB/1035 S111a Sousa, Erica Caroline de Lima de.
Avaliação do potencial cicatrizante do cupuaçu (theobroma glandiflorum) em feridas cutaneas induzidas em ratos wistar / Erica Caroline de Lima de Sa. – Teresina: Uninovafapi, 2018.
Orientador (a): Prof. Me. Janayna Batista Barbosa de Sousa; Centro Universitário UNINOVAFAPI, 2018.
57. p.; il. 23cm.
Monografia (Graduação em Biomedicina) – Centro Universitário UNINOVAFAPI, Teresina, 2018.
1. Cicatrização. 2. Medicamento fitoterápico. 3. Ratos. I.Título. II.
Sousa, Janayna Batista Barbosa de.
C DD 615.1
ERICA CAROLINE DE LIMA DE SÁ
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CICATRIZANTE DO CUPUAÇU (THEOBROMA
GLANDIFLO) EM FERIDAS CUTANEAS INDUZIDAS EM RATOS WISTAR
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Centro Universitário de Saúde, Ciências Humanas e Tecnológicas do Piauí – UNINOVAFAPI como requisito parcial para
obtenção do Grau em Bacharel em
Biomedicina.
Orientadora: Msc. Janayna Batista Barbosa de Sousa
Aprovado em: 07/12/2018
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar à Deus por me ter dado todas as Graças para chegar até aqui.
À minha família, em especial aos meus pais por me terem dado todas as condições necessárias para a realização desta grande conquista. Se hoje concluo esta graduação, foi porque um dia, eles me me permiram sonhar, junto comigo acreditaram, e não mediram esforços para que tudo se tonasse possível.
Ao Centro Universitário Uninovafapi, todo o corpo docente, preceptores e colaboradores que se fizeram facilitadores da aprendizagem, me permitindo chegar hoje ao final desse ciclo de maneira satisfatória.
Gratidão a minha orientadora Professora Msc. Janayna Batista Barbosa de Sousa por sua disponibilidade, atenção, cuidado, por ter apostado em mim e no êxito deste trabalho. E principalmente pelos laços de confiança e amizade, admiração e respeito mutuo construídos durante este período.
“Dê-me, Senhor, agudeza para entender, capacidade para reter, método e faculdade para aprender, sutileza para interpretar, graça e abundância para falar. Dê-me, Senhor, acerto ao começar, direção ao progredir e perfeição ao concluir”
RESUMO
A busca pela melhoria no processo de cicatrização de feridas tem crescido. O alto custo dos procedimentos e tratamentos das lesões cutâneas tem levado à população a buscar o tratamento convencional, que traz inúmeros benefícios e uma dimensão mais humanizada. O objetivo deste trabalho foi Investigar o potencial cicatrizante do Theobroma grandiflorum, por meio de testes em cobaias. Foram utilizados 20 animais da linhagem Wistar ( Rattus novergicus), machos, com 90 dias de idade, formando aleatoriamente dois grupos de animais com Grupo controle e Grupo teste, onde este último será subdividido em três para cada tipo de concentração (pura, 1:1 e 1:2), tratados e monitorados diariamente, e feito uma avaliação macroscópica nos dia 7, 14 e 21 ( medição da lesão com paquímetro e analise de parâmetros da tabela em anexo) e ao fim dos 21 dias uma análise microscópica do corte histológico do tecido para análise dos eventos de reação inflamatória, proliferação fibroblástica, regressão do tecido de granulação, deposição de colágeno. Os resultados do presente estudo permitem concluir que o uso tópico Theobroma gradiflorum apresenta efeito significativo na cicatrização da pele de ratos em relação à área cirúrgica. Todos os grupos tratados houve retração significativa da lesões quando comparada ao controle negativo. A análise microscópica também mostra que os grupos tratados apresentam um epitélio hígido e o grupo controle negativo uma cicatrização mais tardia.
ABSTRACT
The search for improvement in the healing process of wounds has grown. The high cost of procedures and treatments of skin lesions has led the population to seek conventional treatment, which brings innumerable benefits and a more humanized dimension. The objective of this work was to investigate the healing potential of Theobroma grandiflorum, through tests in guinea pigs. Twenty-nine days old male Wistar rats (Rattus novergicus) were randomly assigned to two groups of animals with control group and test group, where the latter group was subdivided into three groups for each type of concentration (pure, 1: 1 and 1: 2), treated and monitored daily, and a macroscopic evaluation was performed on days 7, 14 and 21 (measurement of the lesion with pachymeter and analysis of parameters in the attached table) and at the end of 21 days a microscopic analysis of the cut tissue histology for the analysis of inflammatory reaction events, fibroblast proliferation, granulation tissue regression, collagen deposition. The results of the present study allow us to conclude that the topical use Theobroma gradiflorum has a significant effect on the healing of the skin of rats in relation to the surgical area. All treated groups had significant retraction of the lesions when compared to the negative control. Microscopic analysis also shows that the treated groups had a healthy epithelium and the negative control group a later healing.
LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS
Figura 1. Formulação das concentrações 1/1 e 1/2. Adição da substancia pura, DMSO (Dimetilsulfóxido ousulfóxido de dimetilo) e água destilada.
26
Figura 2. Fotografia da área epilada por tração manual (A). Lesão 1 cm no dorso do animal (B). Aplicação da pomada (C).
26
Figura 3. Registro fotográfico da contração da lesão, Grupo controle negativo (CN). A 7ª dia, B 14ª dia e C 21ª dia.
28
Figura 4. Registro fotográfico da contração da lesão, Grupo Puro. A 7ª dia, B 14ª dia e C 21ª dia
28
Figura 5. Registro fotográfico da contração da lesão, Grupo 1/1. A 7ª dia, B 14ª dia e C 21ª dia.
28
Figura 6. Registro fotográfico da contração da lesão, Grupo 1/2. A 7ª dia, B 14ª dia e C 21ª dia.
28
Figura 7. Registro fotográfico da contração da lesão, Grupo CN. Formação de pelo; fina camada de epitélio, poucos capilares e ausência de queratina. Configura uma cicatrização tardia. Aumento (4x).
30
Figura 8. Cote histológico do Grupo Puro. A e B Tecido completamente hígido. Espessa camada de epitélio e espessa camada de queratina. Tecido conjuntivo com bastante fibras colágenas. Aumento (40x).
30
Figura 9. Cote histológico do Grupo 1/1. Δ Glândulas sebáceas e folículo piloso. Formação de inervação. Aumento (10x). (A) e G 1/1. Espessa camada de epitélio e filetes de queratina. Aumento (40x). (B).
31
Figura 10. Cote histológico do Grupo 1/2. Δ Folículo piloso. ➔ Fibras colágenas. Aumento (10x). (A) e G 1/2 . Capilares (vaso sanguíneo). Aumento (40x). (B).
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µL Microlitros 21
ANOVA Análise da variância 22
CEUA Comitê de Ética no Uso de Animais 22
CN Controle negativo 30
DMSO Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo 21
GP Grupo Puro 30
ICTs Instituições de Ciência e Tecnologia 24
OMS Organização Mundial de Saúde 13
SUMÁRIO
1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS 13
2 REFERENCIAL TEÓRICO 15
2.1 O que é uma lesão 15
2.2 Mecanismo de cicatrização 15
2.3 Utilização de fitoterápicos na cicatrização de lesões 16
2.4 Esteroides vegetais 16 2.5 O cupuaçu 17 3 METODOLOGIA 19 3.1 Tipo de pesquisa 19 3.2 Período da pesquisa 19 3.3 Local da pesquisa 19 3.4 Coleta de dados 19
3.4.1 Aclimatação e distribuição dos grupos de animais 19
3.4.2 Procedimento cirúrgico 20
3.4.3 Obtenção e processamento histotécnico dos espécimes 20
3.4.4 Amostra 21
3.5 Análise dos dados. 21
3.6 Aspectos éticos 22 4 ARTIGO CIENTÍFICO 23 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS 47 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 48 ANEXO A 51 ANEXO B 55 ANEXO C 56 ANEXO D 57
1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS
A utilização dos produtos vegetais para o tratamento de diversas doenças tem atravessado milênios, haja vista, que, a propriedades terapêuticas já era conhecidas e transmitidas pelas gerações (PIRIZ et al., 2014).
Data de 60.000 anos A.C Gregos, Persas, Egípcios, Hindus como também Orientais foram os primeiros a explorarem tais recursos naturais, contribuindo assim para a difusão da Medicina Natural pelo mundo. Contudo, no Brasil, esse saber milenar só deixou de ser um conhecimento empírico e passou a ser um recurso terapêutico válido na última década do século XX (ROCHA et al., 2015).
Desde 1978 a Organização Mundial de Saúde OMS na Conferência Internacional sobre Atenção Primária em Saúde em Alma-Ata - Genebra- fala sobre a necessidade de regulamentação dos remédios naturais, uma vez que, estes tem sua eficácia comprovada e devido ao seu baixo custo atende as necessidades da atenção primaria. Com isso, no ano de 2006 foi criada no Brasil a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos por meio do Decreto Nº 5.813, de 22 de junho de 2006 (BRASIL, 2006).
O Brasil, mais especificamente a Amazônia, possui a maior biodiversidade do planeta sendo precursor e grande potencial para pesquisas e inovações com plantas medicinais. Logo, porque substâncias oriundas de plantas tem uso significativo tanto como agentes terapêuticos, quanto como matéria prima para a produção de medicamentos. Todavia, ainda são muito tímidas as pesquisas devido a falta de informações e recursos para estudos (ASSIS et al., 2015).
Embora os avanços na compreensão dos processos que envolvem a cicatrização tissular sejam significativos, a produção de curativos para tal fenômeno ainda é bastante oneroso. E isso provoca a necessidade do aumento de pesquisas à medicina alternativa, na tentativa de descobrir medicamentos que tenha um menor custo e, que além de maior eficácia seja acessível à população mais carente (SILVA et al., 2015).
O cupuaçu (Theobroma grandiflorum) é uma espécie da família Esterculiáceas, nativo da região sudeste-sul da região amazônica abrangendo estados como Pará e Maranhão. De grande importância cultural, social e econômica em nível regional, nacional e internacional, devido ao seu múltiplo uso. Da sua polpa de sabor e odor característico podem-se obter sucos, doces, licores, sorvetes, dentre outros e de sua semente a produção de chocolate além de que, são extraídos
lipídios destinados à indústria cosmética e sua casca para a produção de ração para animais (MANDELBAUM et al., 2003).
Portanto, este estudo é importante devido às peculiaridades da manteiga que contém o cupuaçu em ser usada há séculos pelas pessoas nativas da Amazônia para diminuir a flacidez e melhorar as condições naturais da pele, protegê-la dos raios nocivos do sol e restaurar a beleza natural. É um emoliente que restaura a elasticidade por agir como antioxidante e hidratante devido as suas propriedades fitoquímicas e por transportar água à pele torna-a mais macia e elástica.
O alto custo dos procedimentos e tratamentos das lesões cutâneas tem levado à população a buscar o tratamento convencional, que traz inúmeros benefícios e uma dimensão mais humanizada além de menos custo e maior adesão por parte do paciente. Plantas como Aloe vera, Calendula officinalis, Leucas lavandulaefolia, Copaíba, tem uma boa resposta à cicatrização de lesões, baixo custo e aceitação pela população (PIRIZ et al., 2014).
Estre trabalho objetivou investigar o potencial cicatrizante do Theobroma grandiflorum, por meio de testes em cobaias, testar em diferentes concentrações o extrato vegetal, bem como, acompanhar e avaliar a atividade cicatrizante das formulações desenvolvidas, além de analisar histologicamente o tecido cicatricial.
2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 O que é uma lesão
A pele é o maior órgão do corpo humano representado em torno de 10 a 15% do peso corporal. Além da regulação da temperatura corporal é responsável pela proteção das estruturas internas, proteção contra traumas físicos, térmicos, radiação ultravioleta, agentes oxidantes, invasões microbianas, perda de água e proteção imune. Este órgão pode estar comprometido quando se encontra lesionado. As causas mais prevalentes das lesões de pele relacionam-se às úlceras por pressão, insuficiência vascular, traumas, restrições na mobilidade e neuropatias diabéticas (DUIM et al., 2015)
Feridas ou lesão tecidual é consequência de uma agressão ao tecido vivo ou por distúrbios clínicos ou fisiológicos. Pode acometer desde a derme, epiderme, fáscia, cartilagens, músculos, órgãos ou qualquer estrutura do corpo estando relacionada a fatores extrínsecos, como agentes químicos, exposição térmica, pressão externa, atrito e fricção da pele e intrínsecos, como diminuição de glândulas responsáveis pela hidratação, alterações estruturais como diminuição da espessura da epiderme e derme e redução das fibras de colágeno e elastina (DUIM et al., 2015).
2.2 Mecanismo de cicatrização
A cicatrização de feridas é um processo complexo que envolve a organização de células, sinais químicos e remodelamento da matriz extracelular, com o objetivo de reparar o tecido. O início da cicatrização ocorre após a criação de uma ferida e este ambiente serve como um estímulo para hemostasia, inflamação e outros eventos. É um processo dinâmico que envolve fenômenos bioquímicos e fisiológicos que se comportem de forma harmoniosa a fim de garantir o perfeito reparo tecidual (MANDELBAUM, 2003).
A primeira fase é a inflamatória que tem início imediato após a lesão, com a liberação de substâncias vasoconstritoras, principalmente tromboxana A2 e prostaglandinas, pelas membranas celulares, onde o endotélio lesado e as plaquetas estimulam a cascata da coagulação. A resposta inflamatória se inicia com vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular, promovendo a quimiotaxia -
migração de neutrófilos e macrófagos que são células de defesa. A fase proliferativa é responsável pela reconstituição epidérmica, à chamada reepitelização, é constituída por quatro etapas fundamentais: epitelização, angiogênese, formação de tecido de granulação e deposição de colágeno. Esta fase tem início ao redor do 4º dia após a lesão e se estende aproximadamente até o término da segunda semana. E por fim, a fase de remodelamento ocorre deposição de tecido neoformado, que contribui para maturação de tecido cicatricial (MACEDO, 2017).
Entender o processo cicatricial é conceber que sua evolução está relacionada a uma série de fatores locais e sistêmicos que podem contribuir positiva ou negativamente na sua evolução fisiológica, além disso, o cuidado externo dispensado à lesão é um fator importante que pode prejudicar ou colaborar com o trabalho que o organismo se propõe a realizar (BLANCK, 2008).
2.3 Utilização de fitoterápicos na cicatrização de lesões
A utilização da terapia alternativa tem se intensificado em países desenvolvidos devido aos seus significativos potenciais para a cicatrização de feridas, na busca de medicamentos capazes de interagir com o tecido lesado. Esses produtos precisam não provocar reações alérgicas, inflamatórias, facilitar agregação celular e fazer a diferenciação das células epiteliais, além de propiciar ao paciente conforto, facilidade de aplicação e remoção e uma boa relação custo benefício (MACEDO, 2015).
O avanço da medicina, da indústria farmacêutica só foi possível pelo resgate acerca dos conhecimentos empíricos, de produtos de origem vegetal que foram a base para o tratamentos de inúmeras doenças, tanto na utilização de forma tradicional como pela utilização de vegetais como fonte de moléculas ativas. Atualmente há uma diversidade de recursos que auxiliam no processo de cicatrização na realização de curativos e técnicas para o tratamento de lesões (PIRIZ et al, 2014).
2.4 Esteroides vegetais
Os fitoesteróis ou esteroides vegetais são compostos de 28 a 29 carbonos, diferindo do colesterol que apresente 27 carbonos. Existem mais de 40 esteroides vegetais identificados e estão presentes em alimentos como soja, milho, trigo, frutos
oleaginosos e óleos vegetais em geral, principalmente de canola, arroz e girassol. Os polifenóis são uma classe de compostos bioativos encontrados nos vegetais, são estruturas químicas compostas por anéis fenólicos que se ligam a determinados tipos de átomos e radicais, formando estruturas como carotenóides, flavonóides, curcuminas, resveratrol, quercitina, bixina, catequinas, isoflavonas (PEREIRA, 2012). Os flavonóides constituem substâncias aromáticas contendo 15 átomos de carbono (C15) no seu esqueleto básico. Este grupo de compostos polifenólicos apresenta uma estrutura comum caracterizada por dois anéis aromáticos e um heterociclo oxigenado, formando um sistema C6-C3-C6. Têm-se diferentes classes de flavonóides: antocianinas, flavonóis, flavonas, isoflavonas, flavononas e flavanas, com múltiplos efeitos biológicos, como atividade antioxidante, antiinflamatória e antitumoral, poder de redução fragilidade e permeabilidade capilares; inibição da destruição do colágeno a agregação plaquetária. As antocianinas se destacam entre os flavonoides devidos suas propriedades antioxidantes que é extremamente importante na prevenção e retardo do aparecimento de diversas doenças
(VIEIRA et al., 2008).
Os flavonoides estimulam a cicatrização devido ao fato de interferem nos processos fisiológicos do organismo pois estes possuem ação antioxidante, combatem os radicais livres (RL), tem atividade antimicrobiana e moduladora do sistema imune, apresentam ação anti-inflamatória, analgésica, regenerativa de cartilagens, ossos e vasodilatação, além da de absorção de ferro e vitaminas (PEREIRA, 2012).
Os RL são produzidos naturalmente como processo fisiológico, contudo quando elevados podem produzir danos ao organismo, pois, agem acelerando o processo degenerativo e a perda da estabilidade celular, provocando situações adversas ao organismo e seus tecidos, favorecendo a perda da homeostasia do meio interno. Por isso, se faz necessário a ação dos antioxidantes que são um conjunto heterogêneo de substâncias formado por vitaminas, minerais, pigmentos naturais e outros compostos vegetais e, ainda, enzimas, que bloqueiam o efeito danoso dos radicais livres, formados nas reações metabólicas ou por fatores exógenos, ao organismo. A geração de radicais livres, fisiológica ou não, é normalmente equilibrada pela ação dos antioxidantes endógenos e exógenos (AQUINO et al., 2017).
2.5 Cupuaçu
O Theobroma glandiflorum Schum (cupuaçuzeiro) é uma árvore nativa da Região Amazônica, mais especificamente nos estados do Pará e Maranhão. É uma árvore de pequeno a médio porte que faz parte da mesma família do cacau, de aproximadamente 10 a 15 metros de altura. O seu fruto pode ser utilizado para diversos fins. Da polpa para obtenção de sucos, geleias, tortas, sorvetes. A sementes pode substituir o cacau para obtenção do chocolate, como também da manteiga na indústria cosmética e a casaca para a fabricação de ração para animais (VARGAS, 2015).
Da semente do cupuaçu pode ser obtida uma manteiga rica em fitoesteróis, ou esteróis vegetais (poliesteróis combatem radicais livres), que beneficia a pele seca e danificada e polifenóis que combate os danos dos radicais livres e ácidos graxos. Os ácidos gordurosos contidos na manteiga cupuaçu protegem e hidratam a pele, sendo esses de cadeia longa que são, na verdade, triglicerídeos que possuem um equilíbrio de ácidos graxos saturados e insaturados que proporcionam manteiga baixo ponto de fusão, facilitando a rápida absorção pela pele, agindo à nível celular regula a atividade da camada lipídica, assim estimulando a cicatrização (FLECK et al., 2012).
METODOLOGIA 3.1 Tipo de pesquisa
Trata-se de uma pesquisa exploratória, de caráter experimental que avaliou a eficácia do cupuaçu como agente cicatrizante em feridas cutâneas, induzidas cirurgicamente em cobaias, para avaliar o tempo de cicatrização, as variações macroscópicas e microscópicas do tecido cicatricial.
O método experimental consiste, especialmente, em submeter os objetos de estudo à influência de certas variáveis, em condições controladas e conhecidas pelo investigador, para observar os resultados que a variável produz no objeto (GIL, 2008).
3.2 Período da pesquisa
O desenvolvimento da será iniciado durante os meses de agosto a novembro de 2018 sendo que o período em questão é suficiente para a coleta de todos os dados necessários.
3.3 Local da pesquisa
Este estudo foi realizado no biotério do Centro Universitário de Ciências Humanas e Tecnológicas do Piauí - UNINOVAFAPI.
Neste local, os animais permaneceram durante todo o período experimental e foram coletados dados para avaliação clínica e histológica. O material foi analisado em um Laboratório particular do município de Teresina.
3.4 Coleta de dados
3.4.1 Aclimatação e distribuição dos grupos de animais.
Foram utilizados 20 ratos da linhagem Wistar (Rattus novergicus), machos, aclimatados no biotério da UNINOVAFAPI, distribuídos em cinco gaiolas nas quais receberam ração e água a livre demanda diariamente e distribuídos aleatoriamente em:
1. Controle (água destilada)
O grupo 2 será dividido futuramente em três subgrupos contendo cinco em cada um: Subgrupo 1. Cupuaçu puro;
Subgrupo 2. Cupuaçu com concentração de 1:1; Subgrupo 3. Cupuaçu com concentração de 1:2.
Os animais foram tratados de modo tópico onde cada animal segundo seu grupo correspondente e todos durante a manhã. Logo ao fim dos 21 dias os animais foram eutanasiados com superdosagem de Tiopental sódico.
3.4.2 Procedimento cirúrgico
Os animais foram submetidos à anestesia intraperitoneal (quetamina e xilazina), onde foi administrado por via intraperitoneal 0,1ml cloridrato de quetamina associado a 0,05 ml de cloridrato de xilazina para cada 100 gramas de peso do animal.
Não há necessidade de jejum pré-operatório uma vez que, o vômito nessa espécie não ocorre durante a indução. O jejum prolongado também pode levar o animal a estado de hipoglicemia, uma vez que este resulta em depleção das reservas de glicogênio (BRASIL, 2016).
Após a administração, realizou-se a epilação por tração manual no dorso de cada animal, para ter uma melhor visualização da lesão confeccionada posteriormente, de 1 cm no centro da área epilada. As lesões foram produzidas com o auxílio de um bisturi com cabo nº 3 e lâmina 11. Logo após as lesões foram lavadas com soro fisiológico, e o sangue estancado. Só então demos início ao tratamento dos grupos. Foi efetuada limpeza das lesões diariamente, utilizando soro fisiológico em abundância. As aplicações foram repetidas diariamente, sempre no mesmo horário.
3.4.3 Obtenção e processamento histotécnico dos espécimes
Após a eutanásia dos animais, foi realizada a coleta das amostras teciduais a partir da área de cicatrização. Para tal, as feridas foram removidas por excisão cirúrgica com margem de segurança de 10 mm em toda sua extensão, com o auxílio de lamina de bisturi n° 11, montada em cabo n° 3, pinça de Adisson e tesoura de Metzenbaum. As peças, para análise histológica, foram fixadas em formol tamponado a 10% por 24 horas. Em seguida, o material foi desidratado em
concentrações crescentes de etanol e processados para inclusão em parafina. Os blocos resultantes de parafina foram cortados em 2.5 m (micrômetros) de espessura, sendo posteriormente corados com hematoxilina e eosina para apreciação.
3.4.4 Amostra
Foram utilizados vinte ratos Wistar, machos, adultos, com peso variando entre 200 a 250 gramas, confinados em gaiolas em ambiente com temperatura controlada (22ºC) e ciclo caro/escuro de 12h. Estes provenientes do criador Francisco de Assis da Silva Filho (CPF 809. 789. 833-00).
A linhagem Wistar é o modelo mais utilizado para pesquisa devido ao seu pequeno porte, ciclo biológico curto, e por ter um alto grau de similaridade genética com seres humanos. Cerca de 80% do DNA é igual ao do humano (MATTARAIA, 2012).
Foi preparada uma formulação a partir da semente do cupuaçu (Theobroma grandiflorum), obtido através da secagem e trituração das sementes.
Por se tratar de uma substancia oleaginosa, não diluente em água, foi preciso adicionar DMSO (Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo) as concentrações de 1:1 e 1:2. Líquido orgânico, límpido, incolor, ligeiramente oleoso, sem odor em sua forma pura, derivado da lignina. Sua molécula, C2H6SO, é anfipática com grande domínio polar e a presença de dois grupos metil, apolares, resulta em solubilidade tanto em meio aquoso como em meio orgânico (PICOLI, 2015).
Para o preparo da formulação de 1/1 foi utilizado 500 mg da pomada, 100 µl de DMSO e 400 µl de água destilada, já na formulação de 1/2 foram utilizados 1000 mg da pomada, 300 µl de DMSO e 1700 µl de água destilada.
3.5 Análise dos dados
A análise macroscópica foi realizada com observação do diâmetro da lesão nos sete, quatorze e vinte e um dias com auxilio do paquímetro.
A análise microscópica foi realizada anotando-se os achados de modo qualitativo e quantitativo. A avaliação quantitativa será realizada com base em análise comparativa entre os grupos no período da avaliação.
Os resultados de todas as fases foram expressos com a média e erro padrão da média para todos os experimentos. Os dados paramétricos analisados pela Análise de Variância (ANOVA), seguido pelo teste t-Student-Newman-Keuls como post hoc teste. Por sua vez os dados não paramétricos foram analisados pelo teste de qui-quadrado pelo software GraphPad Prisma® 5.00. As diferenças serão consideradas significativas quando p<0,05.
3.6 Aspectos éticos
No que se refere aos aspectos éticos o projeto foi encaminhado para a CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais do Centro universitário Uninovafapi, que obedece aos critérios estabelecidos na Lei nº 11.794, de 8 de outubro de 2008 onde relata a criação e a utilização de animais em atividades de ensino e pesquisa científica, em todo o território nacional e esta pesquisa preconiza a Resolução Federal do Conselho Federal de Medicina Veterinária Nº 879, de 15 de fevereiro de 2008 a qual dispõe sobre o uso de animais no ensino e na pesquisa e regulamenta as Comissões de Ética no Uso de Animais (CEUAs).
4. ARTIGO CIENTIFICO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CICATRIZANTE DO CUPUAÇU (Theobroma
glandiflorum) EM FERIDAS CUTANEAS INDUZIDAS EM RATOS WISTAR
Erica Caroline de Lima de Sá1 Antônio Luiz Gomes Junior2 Janayna Batista Barbosa de Sousa2 1Departamento de Biomedicina do Centro Universitário de Saúde, Ciências Humanas e
Tecnológicas do Piauí – UNINOVAFAPI. Rua Vitorino Orthiges Fernandes, 6123, Uruguai CEP: 64073-505. Teresina - Piauí
2 Docente. Departamento de Biomedicina do Centro Universitário de Saúde, Ciências Humanas e
Tecnológicas do Piauí – UNINOVAFAPI. Rua Vitorino Orthiges Fernandes, 6123, Uruguai CEP: 64073-505. Teresina – Piauí
O alto custo dos procedimentos e tratamentos das lesões cutâneas tem levado à população a buscar o tratamento convencional, que traz inúmeros benefícios e uma dimensão mais humanizada. O objetivo deste trabalho foi Investigar o potencial cicatrizante do Theobroma grandiflorum, por meio de testes em cobaias. Foram utilizados 20 animais da linhagem Wistar (Rattus novergicus), machos, com 90 dias de idade, formando aleatoriamente dois grupos de animais com Grupo controle e Grupo teste, onde este último subdividido em três para cada tipo de concentração (pura, 1:1 e 1:2), tratados e monitorados diariamente, e feito uma avaliação macroscópica nos dia 7, 14 e 21, e ao fim dos 21 dias uma análise microscópica do corte histológico do tecido para análise dos eventos da cicatrização. Os resultados do presente estudo permitem concluir que o uso tópico Theobroma gradiflorum apresenta efeito significativo na cicatrização da pele de ratos em relação à área cirúrgica. Todos os grupos tratados houve retração significativa da lesões quando comparada ao controle negativo. A análise microscópica também mostra que os grupos tratados apresentaram um epitélio hígido e o grupo controle negativo uma cicatrização mais tardia.
INTRODUÇÃO
A fitoterapia representa uma grande oportunidade de desenvolvimento no setor farmacêutico no Brasil. Esta oportunidade é relevante não somente pelas riquezas naturais e diversidade no bioma, mas pelo conhecimento tradicional e científico acumulado sobre a atividade biológica dessas plantas pela sociedade civil e pelas Instituições de Ciência e Tecnologia (ICTs) (Hasenclever, 2017).
Uma grande parte da população mundial, cerca de 75% dela, utilizam a medicina natural no tratamento de doenças, devido a uma associação de características desejáveis ao uso, como a eficácia, baixo custo, reprodutibilidade e constância de qualidade (Lima, 2016). Logo, porque substâncias oriundas de plantas tem uso significativo tanto como agentes terapêuticos, quanto como matéria prima para a produção de medicamentos. Todavia, ainda são muito tímidas as pesquisas devido a falta de informações nesse sentido (Assis et al., 2015).
A utilização da terapia alternativa tem se intensificado em países desenvolvidos devido aos seus significativos potenciais para a cicatrização de feridas, na busca de medicamentos capazes de interagir com o tecido lesado. Esses produtos precisam não provocar reações alérgicas, inflamatórias, facilitar agregação celular e fazer a diferenciação das células epiteliais, além de propiciar ao paciente conforto, facilidade de aplicação e remoção e uma boa relação custo benefício (Macedo et al., 2017).
O cupuaçu (Theobroma grandiflorum) é uma espécie da família Esterculiáceas, nativo da região sudeste-sul da região amazônica abrangendo estados como Pará e Maranhão. De grande importância cultural, social e econômica em nível regional, nacional e internacional, devido ao seu múltiplo uso. Da sua polpa de sabor e odor característico podem-se obter sucos, doces, licores, sorvetes, dentre outros e de sua semente a produção de chocolate além de que, são extraídos lipídios destinados à indústria cosmética e sua casca para a produção de ração para animais (Xangai et al., 2015).
O cupuaçú é importante devido às peculiaridades da sua manteiga que é usada há séculos pelas pessoas nativas da Amazônia para diminuir a flacidez e melhorar as condições naturais da pele, protegê-la dos raios nocivos do sol e restaurar a beleza natural. É um emoliente que restaura a elasticidade por agir como
antioxidante e hidratante devido as suas propriedades fitoquímicas e por transportar água à pele torna-a mais macia e elástica (Fleck, 2012).
Estre trabalho objetivou Investigar o potencial cicatrizante do Theobroma grandiflorum, por meio de testes em cobaias, testar em diferentes concentrações o extrato vegetal, bem como, acompanhar e avaliar a atividade cicatrizante das formulações desenvolvidas, além de analisar histologicamente o tecido cicatricial.
MATERIAIS E METODOS Tipo de estudo
Pesquisa exploratória, de caráter experimental que avaliou a eficácia do cupuaçu como agente cicatrizante em feridas cutâneas, induzidas cirurgicamente no dorso de cobaias, para avaliar o tempo de cicatrização, as variações macroscópicas e microscópicas do tecido cicatricial.
Experimento animal
Foram utilizados vinte ratos Wistar, machos, adultos, com peso variando entre 200 a 250 gramas, aclimatados no biotério da UNINOVAFAPI, distribuídos em cinco gaiolas nas quais receberam ração e água a livre demanda diariamente e distribuídos aleatoriamente, em ambiente com temperatura controlada (22ºC) e ciclo caro/escuro de 12h. Neste local os animais foram mantidos durante todo o período experimental e foram coletados os dados para avaliação clínica e histológica. O material foi analisado em um Laboratório particular do município de Teresina. Estes provenientes do criador Francisco de Assis da Silva Filho (CPF 809. 789. 833-00). Foram alocados em quatro grupos. Grupo controle tratado com água destilada, grupo teste tratados com Theobroma glandiflorum, sendo este subdivido em três grupos: Puro, 1/1 e 1/2. Cada grupo contendo 5 animais.
Preparo do material e formulações
Foi preparada uma formulação a partir da semente do cupuaçu (Theobroma grandiflorum), obtido através da secagem e trituração das sementes.
Por se tratar de uma substancia oleaginosa, não diluente em água, foi preciso adicionar DMSO (Dimetilsulfóxido ou sulfóxido de dimetilo) para formulação das concentrações de 1:1 e 1:2 conforme a figura 1.
O DMSO é um líquido orgânico, límpido, incolor, ligeiramente oleoso, sem odor em sua forma pura, derivado da lignina. Sua molécula, C2H6SO, é anfipática com grande domínio polar e a presença de dois grupos metil, apolares, resulta em solubilidade tanto em meio aquoso como em meio orgânico (PICOLI, 2015).
Para o preparo da formulação de 1/1 foi utilizado 500 mg da pomada, 100 µl de DMSO e 400 µl de água destilada, já na formulação de 1/2 foram utilizados 1000 mg da pomada, 300 µl de DMSO e 1700 µl de água destilada.
Tratamento
Os animais foram submetidos à anestesia intraperitoneal. Após a administração, realizou-se a epilação por tração manual no dorso de cada animal, para ter uma melhor visualização da lesão confeccionada posteriormente, de 1 cm no centro da área epilada. Logo após foi iniciado o tratamento dos animais, cada um a seu grupo correspondente. Grupo controle 50 µL de água destilada, grupo puro 50 mg da pomada pura e grupos 1/1 e 1/2 50 µL das formulações correspondentes. Figura 2.
Figura 1. Formulação das concentrações 1/1 e 1/2.
Adição da substancia pura, DMSO e água destilada.
Figura 2. Fotografia da área epilada por tração manual (A). Lesão 1 cm no dorso do animal (B).
Após a administração os animais foram alojados em gaiolas individuas As aplicações foram repetidas diariamente, sempre no mesmo horário.
Análise dos dados
Todos os animais tiveram suas lesões fotografadas com celular modelo O Samsung Galaxy J2. Câmera de 5 megapixel. Os dados assim obtidos do processo de cicatrização, no 7º, 14º e 21º dias. A avaliação da cicatrização foi realizada em todos os animais mediante a mensuração da área de retração do ferimento com um paquímetro digital.
Estatística
Os resultados de todas as fases foram expressos com a média e erro padrão da média para todos os experimentos. Os dados paramétricos analisados pela ANOVA, seguido pelo teste t-Student-Newman-Keuls como post hoc teste. Por sua vez os dados não paramétricos foram analisados pelo teste de qui-quadrado pelo software GraphPad Prisma® 5.00. As diferenças serão consideradas significativas quando p<0,05.
Aspectos éticos
O estudo foi realizado no Laboratório de cirurgia experimental do Centro Universitario UNINOVAFAPI. O estudo foi aprovado pelo CEUA da IES com este número de protocolo 007p-v3/18.
RESULTADOS
Evolução pós operatório e exame da ferida.
O ato operatório de todos os animais transcorreu sem complicações. Todos os ratos recuperam-se bem da anestesia. Não houve óbitos. As avaliações clínicas diárias mostraram adequada recuperação, com manutenção do estado geral, presença de atividade física e disposição para alimentar-se no grupo controle e os grupos teste.
A evolução da ferida cutânea nos ratos do grupo controle e nos grupos Treobroma glandiflorum mostrou exsudação e formação de crostas delicadas até o 7º dia de pós-operatório. A partir do 7º dia, houve espessamento da crosta, que passou a destacar espontaneamente a partir do 14º dia; evoluindo para epitelização no 21º dia de pós-operatório, com crescimento de pelos em torno da lesão (Figuras 3, 4 ,5 e 6).
Na avaliação macroscópica, observou-se que nenhum animal apresentou secreção purulenta na ferida e houve formação de crosta, que é resultado do preenchimento da lesão por coágulos de fibrina e exsudatos (Correa, 2016).
A área da ferida diminuiu gradativamente com a evolução do tempo. Como pode ser observado no gráfico, as áreas das feridas diminuíram progressivamente de maneira significativa em ambos os grupos com a evolução.
Figura 3. CN. A 7ª dia, B 14ª dia e C 21ª dia. Figura 4. Puro. A 7ª dia, B 14ª dia e C 21ª dia.
Podemos verificar que após uma semana (7 dias) do tratamento da lesão com a substância pura (6,44 ± 1,01) o correu uma contração significativa (p>0,05), bem como na concentração de 1/1 (7,25 ± 1,36) quando comparado com o grupo controle negativo (9,62 ± 0,09). Não foi verificado diminuição da área de contração nos animais tratados com a concentração de 1/2 (9,90 ± 0,05). Com 14 dias de tratamento foi observado redução significativa (p>0,05) para todas as concentrações testadas (puro: 3,03 ± 0,43; 1/1: 2,50 ± 0,58; 1/2: 3,45 ± 0,76) em relação ao grupo controle negativo (6,24 ± 0,65), bem como foi verificado após 21 dias de tratamento para todas as doses testadas (puro: 0,28 ± 0,28; 1/1: 1,08 ± 0,32; 1/2: 1,51 ± 0,83) em comparação ao grupo controle (4,21 ± 0,69).
Avaliação microscópica
Na análise dos cortes histológicos, verificou-se ao fim dos 21 dias pós- cirúrgico, a fase de remodelação do processo de cicatrização normal do tecido.
Gráfico 1. Medida da contração da área cirúrgica dos ratos entre os grupos controle (Cn)
Evidenciou um epitélio bem formado, fibras colágenas, capilares, pelos, glândulas sebáceas e inervações. Grupo controle negativo (CN) apresentou um epitélio mais fino e sem formação de queratina e poucos capilares, assim, uma cicatrização mais tardia. Já o grupo puro (GP) apresentou um tecido totalmente hígido, configurando assim, uma cicatrização completa (Figuras 7, 8, 9 e 10).
Figura 8. Grupo Puro. A e B Tecido completamente hígido. Espessa camada de
epitélio e espessa camada de queratina. Tecido conjuntivo com bastante fibras colágenas. Aumento (40x).
Figura 7. CN. Formação de pelo; fina camada de
epitélio, poucos capilares e ausência de queratina. Configura uma cicatrização tardia. Aumento (4x).
DISCUSSÃO
Segundo Fleck (2012), o cupuaçú é rico em fitoesteróis, ou esteróis vegetais (poliesteróis combatem radicais livres), que beneficia a pele seca e danificada e polifenóis que combate os danos dos radicais livres e ácidos graxos. Os ácidos gordurosos contidos na manteiga cupuaçu protegem e hidratam a pele, sendo esses de cadeia longa que são, na verdade, triglicerídeos que possuem um equilíbrio de ácidos graxos saturados e insaturados que proporcionam manteiga baixo ponto de fusão, facilitando a rápida absorção pela pele, agindo à nível celular regula a atividade da camada lipídica, estimulano processo cicatricial.
Figura 9. G 1/1. Δ Glândulas sebáceas e folículo piloso. Formação de inervação. Aumento
(10x). (A) e G 1/1. Espessa camada de epitélio e filetes de queratina. Aumento (40x). (B).
Figura 10. G 1/2 . Δ Folículo piloso. Fibras colágenas . Aumento (10x). (A) e G 1/2 Capilares (vaso
Do mesmo modo que o própolis o cupuaçu apresenta em sua constituição esteroides vegetais, flavonoides mais especificamente os, que são considerados os principais responsáveis pelos efeitos terapêuticos da própolis, possuindo ação antibacteriana, antiviral, antioxidante, cicatrizante, imunomoduladora, antiinflamatória, analgésica, regenerativa de cartilagens e ossos e vasodilatadora (Batista, 2015).
O rato da linhagem wistar é amplamente utilizado em estudos experimentais (Crisci, 2015). Escolhido por ser de pequeno porte, de fácil aquisição e padronização no que diz respeito à idade, peso, sexo, alojamento, alimentação, cuidados de limpeza e manipulação experimental. Ele ainda apresenta boa resistência à manipulação e agressão cirúrgica, às infecções e podem ser utilizados em amostras significativas.
Muitas pesquisas que envolvem fitoterápicos são desenvolvidas em decorrência de informações terapêuticas obtidas do conhecimento da medicina popular (Marteline, 2018). O estudo dos fitoterápicos é extremamente complexo, pois diante da grande variedade de plantas com propriedades terapêuticas, muito ainda se tem a descobrir sobre os princípios ativos, isolamento, mecanismo de ação e efeitos colaterais (Macedo et al., 2017).
A revisão da literatura médica nas bases de dados da PubMed, MEDLINE, SciELO, não identificou nenhum trabalho clínico ou experimental que tenha avaliado o Theobroma gradiflorum no processo de cicatrização de ferida aberta no dorso de ratos. Desta forma, parece justificável, a realização do presente estudo.
A pomada tanto na forma pura, quanto diluída mostrou-se eficaz no tratamento. Os resultados mostraram que esta solução apresentou eficiência significativa no auxílio da reparação cicatricial de feridas cutâneas em ratos, corroborando com alguns estudos com plantas da mesma família, como a Malva. Ecker et al. (2015) aponta que esta planta apresenta atividade inibitória contra algumas infecções, demonstrando assim, um grande potencial anti-inflamatório, devido a substâncias como a mucilagem, flavonóides e taninos, que podem ajudar na cura de feridas.
Em todos os animais do grupo teste (Puro, 1/1 e 1/2) comparada as lesões controle e Theobroma grandiflorum, nota-se que houve diferenças entre elas, já que as lesões tratadas com o Theobroma grandiflorum apresentaram crosta mais espessa, indicando assim que ocorreu uma reparação tecidual mais acelerada. Em
estudo semelhante (Correa et al., 2016), observou na avaliação macroscópica, que nenhum animal apresentou secreção purulenta na ferida e houve formação de crosta, que é resultado do preenchimento da lesão por coágulos de fibrina e exsudatos.
Avaliação histopatológica
A última fase do processo de cicatrização é a colageneização, fase em que ocorre a maturação e remodelagem da matriz extracelular. Esta etapa é caracterizada pela grande e acelerada deposição de colágeno na lesão e é durante este período que a cicatriz adquire sua máxima resistência tênsil (Medeiros, 2016). Com relação à colageneização, ver-se uma colageneização acentuada em todos os grupos.
Na fase de remodelação, o colágeno é o principal componente da derme, sendo que nesta etapa ocorre a mudança do tipo de colágeno que a compõe. Onde a disposição do colágeno tipo III é inicialmente abundante, mas vai sendo degradado ao longo do processo de cicatrização. Em contraponto, o colágeno de Tipo I vai tendo sua produção aumentada por ação dos fibroblastos (Szwed, 2015).
A camada córnea mais externa da pele, é formada por queratinócitos que perderam suas organelas e núcleo, apresentam forma achatada e destacam-se da pele no processo de renovação celular. As células que a compõem são constituídas predominantemente por queratina, uma proteína que confere elasticidade e resistência (Pavani, 2016).
O grupo CN além de apresentar uma fina camada de epitélio, ainda apresentou uma formação sutil de queratina, o que demonstra uma cicatrização mais tardia. O que colabora com a análise amostral do gráfico,
pois ao fim dos 21 dias apresentou uma média de retração de (4,21 ± 0,69).
O emprego do Theobroma gradiflorum no processo de cicatrização de feridas cutâneas em seres humanos permanece ainda campo aberto a estudos, no entanto é importante que se amplie o estudo experimental em animais com dosagens menores, além do isolamento do componente ou componentes do responsáveis pela influência positiva no processo de reparação de tecidos.
Os resultados do presente estudo permitem concluir que o uso tópico Theobroma gradiflorum apresenta efeito significativo na cicatrização da pele de ratos em relação à área cirúrgica, sugerindo efeito benéfico do processo cicatricial. Novas pesquisas devem ser conduzidas de maneira criteriosa quanto à caracterização do produto utilizado, bem como o seu mecanismo de ação, favorecendo, dessa forma, um maior interesse de indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de produtos fitoterápicos com qualidade comprovada, servindo como incentivo para realização de estudos posteriores.
REFERENCIAS
Assis M, Morelli-Amaral V, Pimenta, F (2015). Grupos de pesquisa e sua produção científica sobre plantas medicinais: um estudo exploratório no Estado do Rio de Janeiro. Revista Fitos 9(1):1-72.
Correa J, Monteiro E, Pavanelli M, Biazon A (2016). Influência do extrato hidroetanólico das folhas de Tropaeolum majus na restauração tecidual em lesões cutâneas. Revista Saúde e Pesquisa 9(1): 101-109.
Crisci A, Cassemiro C, Borges C, Oliveira F, Jorge M (2015). Avaliação da exposição e da interrupção da nicotina durante a cicatrização em ratos wistar. Revista Saúde e Pesquisa 1(8): 85-95.
Ecker A, Martinsa I, Kirscha L, Lima L, Stefenonb L, Mozzini C (2015). Efeitos benéficos e maléficos da Malva sylvestris. Journal of Oral Investigations 4(1):39-43.
Fleck C, RN, BSN, MBA, APN/CNS, ET/WOCN, CWS, CFCN, DNC, FACCWS,Mackenzie Newman, MS (2012). Advanced Skin Care – A Novel Ingredient. Journal of the American College of Clinical Wound Specialists 4:92– 94.
Hasenclever L , Paranhos J, Costa C, Cunha G, Vieira D (2017). A indústria de fitoterápicos brasileira: desafios e oportunidades. Ciência & Saúde Coletiva. 22(8):2559-2569.
Lima I, Nascimento L, Silva M (2016). Comercialização de Plantas Medicinais no Município de Arapiraca-AL. Revista Brasileira de Plantas Medicinais., 2(18): 462-472.
Macedo J, Pereira I, Oliveira A, Magalhães M (2017). Eficácia da fitoterapia no processo de cicatrização tecidual de pacientes com diagnóstico de diabetes mellitus. Portuguese ReonFacema 3(1): 396-400.
Martelli A, Andrade T, Santos G (2018). Perspectivas na utilização de fitoterápicos na cicatrização tecidual: revisão sistemática. Arch Health Invest 7(8): 344-350. Medeiros A, Dantas A (2016). Cicatrização das feridas cirúrgicas. Journal of surgical
and clinical research 7(2): 87-102.
Pavani A, Fernandes T(2017). Plasma rico em plaquetas no rejuvenescimento cutâneo facial: uma revisão de literatura. Revista UNINGÁ 1(29):227-236.
Picoli T, Barbosa J, Vargas G, Hübner S, Fischer G (2015). Toxicidade e eficiência do dimetilsulfóxido (dmso) no congelamento de células madin-darby bovine kidney (mdbk). Science And Animal Health 3(2): 159-168.
Szwed D, Santos V (2015). Fatores de crescimento envolvidos na cicatrização de pele. Caderno da Escola de Saúde 15(1): 7-17.
Xangai G, Araújo A, Pereira T, Araújo L, Vargas, C, Colla E., Silva J (2015). Produtos Brasileiros patenteados por estrangeiros: Biopirataria - Um estudo bibiográfico. INTESA – Informativo Técnico do Semiárido 9 (2):30-36.
SCIENTIFIC ARTICLE
EVALUATION OF THE CUPUAÇU HEALING POTENTIAL (Theobroma
glandiflorum) IN WOUNDED CUTANEOUS WOUNDS IN WISTAR RATS
Erica Caroline de Lima de Sá1 Antônio Luiz gomes Junior2 Janayna Batista Barbosa de Sousa2
1 Department of Biomedicine of the University Center for Health, Humanities and Technology of Piauí - UNINOVAFAPI. Rua Vitorino Orthiges Fernandes, 6123, Uruguay CEP: 64073-505. Teresina –
Piauí.
2 Teacher. Department of Biomedicine of the University Center for Health, Humanities and Technology of Piauí - UNINOVAFAPI. Rua Vitorino Orthiges Fernandes, 6123, Uruguay CEP:
64073-505. Teresina – Piauí.
The high cost of procedures and treatments of skin lesions has led the population to seek conventional treatment, which brings innumerable benefits and a more humanized dimension. The objective of this work was to investigate the healing potential of Theobroma grandiflorum, through tests in guinea pigs. Twenty-nine-day-old male Wistar rats (Rattus novergicus) were randomly assigned to two groups of animals with control group and test group, where the latter group was subdivided into three for each type of concentration (pure, 1: 1 and 1: 2), treated and monitored daily, and a macroscopic evaluation was performed on days 7, 14 and 21, and at the end of the 21 days a microscopic analysis of the histological cut of the tissue for analysis of the healing events. The results of the present study allow us to conclude that the topical use Theobroma gradiflorum has a significant effect on the healing of the skin of rats in relation to the surgical area. All treated groups had significant retraction of the lesions when compared to the negative control. Microscopic analysis also shows that the treated groups had a healthy epithelium and the negative control group a later healing.
INTRODUCTION
Phytotherapy represents a great development opportunity in the pharmaceutical sector in Brazil. This opportunity is relevant not only for the natural wealth and diversity in the biome, but also for the accumulated traditional and scientific knowledge about the biological activity of these plants by civil society and the institutions of science and technology (Hasenclever, 2017).
A large part of the world's population, about 75% of them, use natural medicine in the treatment of diseases, due to an association of characteristics desirable for use, such as efficacy, low cost, reproducibility and constancy of quality (Lima, 2016). Therefore, because substances from plants have significant use both as therapeutic agents and as raw material for the production of medicines. However, research is still very timid due to lack of information in this regard. (Assis et al., 2015). The use of alternative therapy has intensified in developed countries because of its significant potential for wound healing in the search for drugs capable of interacting with the injured tissue. These products need not provoke allergic, inflammatory reactions, facilitate cell aggregation and differentiate epithelial cells, as well as provide the patient with comfort, ease of application and removal and a cost-effective benefit (Macedo et al., 2017).
The cupuaçu (Theobroma grandiflorum) is a species of the family Esterculiaceae, native to the south-east region of the Amazon region encompassing states such as Pará and Maranhão. Of great cultural, social and economic importance in regional, national and international level, due to its multiple use. From its pulp of flavor and characteristic odor juices, sweets, liqueurs, ice creams, among others and of its seed the production of chocolate can be extracted, besides, lipids are extracted for the cosmetic industry and its shell for the production of ration for animals (Shanghai et al., 2015).
Cupuaçú is important due to the peculiarities of its butter that has been used for centuries by native Amazonians to decrease sagging and improve natural skin conditions, protect it from the sun's harmful rays and restore its natural beauty. It is an emollient that restores elasticity by acting as an antioxidant and moisturizer due to its phytochemical properties and transporting water to the skin makes it softer and elastic (Fleck, 2012).
The objective of this study was to investigate the healing potential of Theobroma grandiflorum by means of tests on guinea pigs, to test the vegetal extract in different concentrations, as well as to monitor and evaluate the cicatrizant activity of the developed formulations, as well as to analyze histologically the cicatricial tissue.
MATERIALS AND METHODS Kind of study
An experimental exploratory study that evaluated the efficacy of cupuaçu as a healing agent in cutaneous wounds, surgically induced on the back of guinea pigs, to evaluate healing time, macroscopic and microscopic variations of scar tissue.
Animal experiment
Twenty adult male Wistar rats weighing between 200 and 250 grams, acclimatized in the UNINOVAFAPI breeding stock, were distributed in five cages in which they received ration and water at daily demand and were randomly distributed in a controlled temperature environment (22ºC) and expensive / dark cycle of 12h. At this site the animals were maintained throughout the experimental period and data were collected for clinical and histological evaluation. The material was analyzed in a private laboratory of the municipality of Teresina. Control group (treated with distilled water and DMSO, test group treated with Theobroma glandiflorum, which was subdivided into three groups: the control group (treated with distilled water and DMSO) Pure, 1/1 and 1/2 Each group containing 5 animals.
Preparation of material and formulations
A formulation was prepared from the cupuaçu seed (Theobroma grandiflorum) obtained by drying and grinding the seeds.
As an oil, non-diluent in water, DMSO (dimethylsulfoxide or dimethylsulfoxide) was added for formulations of 1: 1 and 1: 2 concentrations according to figure 1.
DMSO is a clear, colorless, slightly oily, organic liquid with no odor in its pure form derived from lignin. Its molecule, C2H6SO, is amphipathic with a large polar domain and the presence of two nonpolar methyl groups results in solubility in both aqueous and organic media (PICOLI, 2015).
500 mg of the ointment, 100 μl of DMSO and 400 μl of distilled water were used to prepare the 1/1 formulation, 1000 mg of ointment, 300 μl of DMSO and 1700 μl of water distilled.
Treatment
The animals were submitted to intraperitoneal anesthesia. After administration, manual traction epilation was performed on the back of each animal, to have a better visualization of the lesion made later, of 1 cm in the center of the epilated area. Soon after the treatment of the animals was started, each one to its corresponding group. Control group 50 μL of distilled water, pure group 50 mg of the pure ointment and groups 1/1 and 1/2 50 μL of the corresponding formulations. Figure 2.
After administration the animals were housed in individual cages. Applications were repeated daily, always at the same time.
Figure 1. Formulation of concentrations 1/1 and 1/2. Addition of
the pure substance, DMSO (dimethylsulfoxide or dimethyl sulfoxide) and distilled water
Figure 2. Photograph of the epilated area by manual traction (A). Injury 1 cm on the back of
Data analysis
All animals had their injuries photographed with model cell phone The Samsung Galaxy J2. 5 megapixel camera. The data thus obtained from the healing process, on the 7th, 14th and 21st days. The assessment of healing was performed in all animals by measuring the area of retraction of the wound with a digital caliper.
Statistic
The results of all phases were expressed as mean and standard error of the mean for all experiments. The parametric data analyzed by Analysis Variance (ANOVA), followed by Student-Newman-Keuls t-test as post hoc test. In turn the non-parametric data were analyzed by the chi-square test by the GraphPad Prisma® 5.00 software. Differences will be considered significant when p <0.05.
Ethical aspects
The study was conducted at the Laboratory of experimental surgery of the university center of Health, Humanities and Technological Sciences of Piauí - UNINOVAFAPI. The study was approved by the Committee on Ethics in the Use of Animals of the University Center Uninovafapi with my protocol number 007p-v3 / 18.
RESULTS
Postoperative evolution and wound examination.
The operative procedure of all the animals went without complications. All rats recovered well from anesthesia. There were no deaths. The daily clinical evaluations showed adequate recovery, with maintenance of the general condition, presence of physical activity and willingness to feed on the Control group and the test groups.
The evolution of the cutaneous wound in the Control group and in the Treobroma glandiflorum groups showed exudation and formation of delicate crusts until the 7th postoperative day. From the 7th day, there was thickening of the crust, which spontaneously began to detach from the 14th day; evolving to epithelialization on the 21st postoperative day, with hair growth around the lesion. (Figures 3, 4, 5 and 6).
In the macroscopic evaluation, it was observed that no animal presented purulent secretion in the wound and there was crust formation, which results from the filling of the lesion by fibrin clots and exudates (Correa, 2016).
T he area of the wou nd has grad uall y dimi nish ed with the evol utio n of time . As can be see n in the char t, wou nd areas progressively decreased significantly in both groups with evolution.
Figure 3. CN. The 7th day, B 14th day and
C 21st day.
Figure 4. Pure. The 7th day, B 14th day
and C 21st day.
Figure 5. 1/1. The 7th day, B 14th day
and C 21st day.
Figure 6. 1/2. The 7th day, B 14th day
We can verify that after a week (7 days) of the treatment of the lesion with the pure substance (6.44 ± 1.01) there was a significant contraction (p> 0.05), as well as in the concentration of 1/1 (7 , 25 ± 1.36) when compared to the negative control group (9.62 ± 0.09). No decrease in the area of contraction was observed in the animals treated with the concentration of 1/2 (9.90 ± 0.05). After 14 days of treatment, a significant reduction (p> 0.05) was observed for all concentrations tested (pure: 3.03 ± 0.43, 1/1: 2.50 ± 0.58, 1/2: 3, 45 ± 0.76) as compared to the negative control group (6.24 ± 0.65), as well as after 21 days of treatment for all doses tested (pure: 0.28 ± 0.28, 1/1 : 1.08 ± 0.32, 1/2: 1.51 ± 0.83) compared to the control group (4.21 ± 0.69).
Microscopic evaluation
In the analysis of the histological sections, the remodeling phase of the normal tissue healing process was verified at the end of the 21 postoperative days. It showed a well-formed epithelium, collagen fibers, capillaries, hair, sebaceous glands and innervations. Negative control group (CN) had a thinner epithelium and no keratin formation and few capillaries, thus, a later healing. The pure Group (GP)
Con tra c ti o n á re a (m m 3) CN Puro 1/1 1/2 Days
Graph 1. Measurement of contraction of the surgical area of the rats between the pure (p) 1/1
presented a totally healthy tissue, thus configuring a complete cicatrization. Figures 7, 8, 9 and 10.
DISCUSSION
According to Fleck (2012), cupuaçu is rich in phytosterols, or plant sterols (polyester free radical combatants), which benefits dry and damaged skin and polyphenols that fight the damage of free radicals and fatty acids. The fatty acids contained in the cupuaçu butter protect and moisturize the skin, these being long chain which are actually triglycerides that have a balance of saturated and unsaturated fatty acids that provide low melting point butter, facilitating rapid
Figure 8. Pure Group. A and B Completely healthy tissue. Thick layer of epithelium and thick
layer of keratin. Connective tissue with enough collagen fibers. Increase (40x).
Figura 7. CN. Formação de pelo; fina
camada de epitélio, poucos capilares e ausência de queratina. Configura uma cicatrização tardia. Aumento (4x).
Figure 9. G 1/1. Δ Sebaceous glands and hair follicles. Formation of innervation.
Increase (10x). (A) and G 1/1. Thick layer of epithelium and keratin fillets. Increase (40x). (B).
Figure 10. G 1/2. Δ Hair follicle. Collagen fibers. Increase (10x). (A) and G 1/2.
absorption through the skin, acting at the cellular level regulates the activity of the lipid layer, stimulating cicatricial process.
In the same way as propolis, cupuaçu has constituted plant steroids, flavonoids more specifically those, which are considered the main responsible for the therapeutic effects of propolis, possessing antibacterial, antiviral, antioxidant, healing, immunomodulatory, antiinflammatory, analgesic, regenerative action of cartilage and bone and vasodilator (Batista, 2015).
The wistar rat is widely used in experimental studies (Crisci, 2015), chosen for being small, easy to acquire and standardize with respect to age, weight, sex, housing, feeding, cleaning care and experimental manipulation . It still shows good resistance to manipulation and surgical aggression, to infections and can be used in significant samples.
Many researches involving herbal medicines are developed as a result of therapeutic information obtained from the knowledge of popular medicine (Marteline, 2018). The study of phytotherapics is extremely complex because, faced with the wide variety of plants with therapeutic properties, much remains to be discovered about active principles, isolation, mechanism of action and side effects (Macedo et al., 2017).
The review of the medical literature in the PubMed, MEDLINE, SciELO databases did not identify any clinical or experimental work that evaluated Theobroma gradiflorum in the process of open wound healing on the back of rats. In this way, the present study seems justifiable.
The ointment in both the pure and diluted form was effective in the treatment. The results showed that this solution showed significant efficiency in the aid of scar repair of cutaneous wounds in rats, corroborating with some studies with plants of the same family, such as Malva, (Ecker et al., 2015), this shows inhibitory activity against some infections , thus demonstrating a great anti-inflammatory potential, due to substances such as mucilage, flavonoids and tannins, which may help to heal wounds.
In all animals of the test group (Pure, 1/1 and 1/2). Comparing the control lesions and Theobroma grandiflorum, it was observed that there were differences between them, since the lesions treated with Theobroma grandiflorum showed thicker crust, indicating as soon as a more rapid tissue repair occurred. In a similar study (Correa et al., 2016), it was observed in the macroscopic evaluation that no
animal presented purulent secretion in the wound and there was crust formation, which is a result of the filling of the lesion by fibrin clots and exudates.
Histopathological evaluation
The last stage of the healing process is collagenization, the stage in which maturation and remodeling of the extracellular matrix occurs. This stage is characterized by the large and accelerated deposition of collagen in the lesion and it is during this period that the scar acquires its maximum tensile strength (Medeiros, 2016). With regard to collagenization, a marked collagenization was seen in all groups.
In the remodeling phase, collagen is the main component of the dermis, and in this stage the change in the type of collagen composing it occurs. Where the arrangement of type III collagen is initially abundant, but is degraded throughout the healing process. In contrast, Type I collagen has its production increased by the action of fibroblasts (Szwed, 2015).
The outermost cornea layer of the skin is formed by keratinocytes that have lost their organelles and nuclei, are flattened and detach from the skin in the process of cell renewal. The cells that compose it are composed predominantly of keratin, a protein that gives elasticity and resistance (Pavani, 2016).
The CN group besides presenting a thin layer of epithelium, still presented a subtle formation of keratin, which shows a later healing. This contributes to the sample analysis of the graph, since at the end of the 21 days it presented a mean retraction of (4.21 ± 0.69).
The use of Theobroma gradiflorum in the wound healing process in humans remains an open field of study, however, it is important to expand the experimental study in animals with smaller dosages, besides the isolation of the component or components of those responsible for the positive influence in the process of fabric repair.
CONCLUSION
The results of the present study allow us to conclude that the topical use Theobroma gradiflorum has a significant effect on the healing of the skin of rats in relation to the surgical area, suggesting a beneficial effect of the cicatricial process. New research should be conducted in a judicious manner regarding the characterization of the product used, as well as its mechanism of action, thus
