A área de estudo foi o estuário do Tejo (38º44’N, 09º08’W), um estuário pouco profundo, mesotidal e com uma área de aproximadamente 320 Km2. Possui uma extensa
área de zona intertidal (cerca de 20 a 40% da sua área total, em marés mortas e marés vivas, respectivamente) que é constituída por sapais, antigas ostreiras e bancos de vasa e areia. Os sedimentos são tipicamente de areia em zonas de maior hidrodinamismo e de vasa em zonas mais abrigadas.
Figura 2.2: Esquema de um “contact corer”, conforme Honeywill et al. (2002).
As amostras foram recolhidas de dois em dois meses, desde Setembro de 2002 a Julho de 2004, em seis locais de amostragem distribuídos por uma área de 0,24 Km2, localizada em Alcochete, na região média do estuário. A amostragem foi realizada durante a baixa-mar tendo-se usado como método de amostragem o “contact corer” (Figura 2.2).
O “contact corer”, primeiramente descrito por Honeywill et al. (2002), consiste num pequeno disco de metal (área 18,86 cm2) com 2 mm de profundidade, usado para extrair os 2 mm superficiais de sedimento (Figura 2.2). O “contact corer” é colocado sobre a superfície do sedimento e na cavidade que fica voltada para cima coloca-se azoto líquido de forma a congelar o sedimento da cavidade inferior. Deixa-se o azoto líquido a actuar durante 2-3 minutos (o tempo varia de acordo com as condições do sedimento, como por exemplo o teor em água, o vento, etc.). Retira-se o “contact corer” e raspa-se a superfície com a ajuda de uma faca de forma a obter um cilindro de sedimento com uma espessura de 2 mm. De seguida as amostras são embrulhadas em papel de alumínio, previamente identificado, e congeladas imediatamente em azoto líquido.
As amostras foram transportadas do campo para o laboratório num contentor com azoto líquido. No laboratório, as amostras foram pesadas e liofilizadas durante 48 horas. Depois da liofilização as amostras foram novamente pesadas de forma a obter-se o seu teor em água. Adicionalmente foram recolhidas amostras para determinar a
granulometria do sedimento, tendo-se usado uma bateria de crivos para esse fim. De acordo com a classificação de Folk (1954), identificaram-se quatro locais de amostragem de areia e dois locais de vasa. Obteve-se um total de 207 amostras (138 de areia e 69 de vasa) que foram analisadas através do espectrofotómetro e de Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC).
Análise Espectrofotométrica
No laboratório, os pigmentos fotossintéticos foram extraídos, usando-se sub-amostras de sedimento liofilizado (0,3-0,6 g), com 3 ml de acetona a 90%. A extracção foi realizada durante 48 horas no escuro a -80ºC (livro de protocolos do HIMOM, 2005). Findo este tempo as amostras foram agitadas com a ajuda do “vortex”, centrifugadas a 3500rpm durante 15 minutos e extraiu-se o sobrenadante que foi analisado através de um espectrofotómetro Shimadzu UV-1603. Os valores da concentração de clorofila a e dos feopigmentos foram obtidos antes e depois da acidificação com 0,5 M HCl (12 µl de HCl para 1 ml de extracto), respectivamente (Lorenzen, 1967). Os valores da concentração de clorofila a foram, também, estimados a partir das equações tricromáticas de Jeffrey & Humphrey (1975) as quais não incluem o passo da acidificação. Os resultados foram expressos em µg g-1 e em mg m-2.
Análise de HPLC
Sub-amostras de aproximadamente 0,2 g de sedimento liofilizado foram utilizadas para se efectuar a extracção dos pigmentos com 2 ml de metanol tamponizado (com 2% de acetato de amónio) durante 15 minutos a -20ºC no escuro. No início da extracção as amostras foram sujeitas a um período de 30 segundos de ultra-sons. Os extractos obtidos foram filtrados (filtros de membrana Whatman de 0,2 µm de poro) imediatamente antes da análise de HPLC. Esta análise efectuou-se usando um aparelho de HPLC Shimadzu que inclui um módulo distribuidor de solvente (LC-10ADVP) com um sistema de controlo (SCL-10AVP), um detector de fotodiodos (SPD-M10AVP) e um detector de fluorescência (RF-10AXL). A separação cromatográfica dos pigmentos foi efectuada usando uma coluna C18 de fase reversa (Supelcosil; 25 cm de comprimento; 4,6 mm de diâmetro e 5 µm de tamanho das partículas). Os solventes usados foram 0,5 M de acetato de amónio em metanol e água (85:15; v/v), acetonitrilo e
água (90:10; v/v) e 100% de acetato de etilo. O gradiente dos solventes seguiu o método de Kraay et al. (1992) adaptado por Brotas & Plante-Cuny (2003) com um fluxo de 0,6 ml min-1 e um volume de injecção de 100 µl. A identificação e calibração dos picos foi efectuada usando standard de clorofila a da Sigma e standard de feofitina a da DHI. O standard de feoforbide a foi preparado a partir da macroalga Enteromorpha intestinalis, de acordo com o procedimento descrito por Brotas & Plante-Cuny (1996). Os pigmentos foram identificados pelos espectros de absorção e respectivos tempos de retenção. A concentração foi calculada a partir do sinal obtido pelo detector de fotodiodos e/ou pelo detector de fluorescência.
Para análise dos resultados obtidos aplicou-se uma regressão linear modelo II, método mais adequado quando se trabalha com variáveis independentes (sujeitas a erros de medida). Calculou-se os valores de correlação de Pearson e o respectivo nível de significância.
RESULTADOS
As concentrações de clorofila a determinadas pelos métodos de espectrofotometria utilizados neste trabalho encontram-se bastante correlacionadas com os valores obtidos por HPLC (r=0,95 para o método de Lorenzen; r=0,94 para o de Jeffrey & Humphrey)
Figura 2.3: Regressão linear Modelo II entre os valores de clorofila a determinados pelos métodos
espectrofotométricos e HPLC. A) Relação entre a clorofila a medida pelo método de Lorenzen (1967) e o de HPLC (r=0,95; p<0,001; n=207); B) Relação entre a clorofila a medida pelas equações de Jeffrey & Humphrey (1975) e o método de HPLC (r=0,94; p<0,001; n=207). Clorofila a (µg g-1) Lorenzen, 1967 0 50 100 150 200 H P L C 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 A) y = 1,05x + 3,24 Clorofila a (µg g-1)
Jeffrey & Humphrey, 1975
0 50 100 150 200 H P L C 0 50 100 150 200 B) y = 0,74x + 5,72
(Figura 2.3A e 2.3B). No entanto, os valores apenas são bastante similares para o método de Lorenzen (declive=1,05) (Figura 2.3A), enquanto que para o método de Jeffrey & Humphrey existe uma sobrestimação na determinação da concentração da clorofila a relativamente ao valor determinado por HPLC (declive=0,74) (Figura 2.3B).
Comparando os dois métodos de espectrofotometria, constatou-se que ambos se correlacionam fortemente entre si (r=0,98). Contudo, a relação entre eles variou de acordo com o tipo de sedimento (Figura 2.4A). Desta forma, para os sedimentos arenosos, os valores obtidos para a clorofila a foram bastante idênticos (declive=1,07), enquanto que nos sedimentos de vasa o método de Jeffrey & Humphrey (sem acidificação da amostra) sobrestimou o valor da concentração da clorofila a em cerca de 20 % (declive=1,18), relativamente ao método de Lorenzen (com acidificação) (Figura 2.4A). Em relação aos feopigmentos, usando o método de Lorenzen (1967), verificou-se a existência de uma forte correlação entre os resultados obtidos no espectrofotómetro e por HPLC. Contudo, o método espectrofotométrico sobrestimou consideravelmente os produtos de degradação da clorofila a em relação ao método de HPLC (Figura 2.4B).
Figura 2.4: Regressão linear Modelo II A) entre os valores de clorofila a calculados pelos dois métodos espectrofotométricos para as amostras de areia (r=0,98; p<0,001; n=138) e de vasa (r=0,99; p<0,001; n=69) e B) entre os valores de feopigmentos calculados por Lorenzen (1967) e HPLC (r=0,96; p<0,001; n=207). Clorofila a (µg g-1) Lorenzen, 1967 0 50 100 150 200 J e ff re y & H u m p h re y , 1 9 7 5 0 50 100 150 200 Areia Vasa A) y = 1,18x + 19,27 y = 1,07x + 4,68 Feopigmentos (µg g-1) Lorenzen, 1967 0 20 40 60 80 100 H P L C 0 5 10 15 20 Areia Vasa B) y = 0,23x - 0,79
A interpretação dos resultados depende das unidades em que os valores de clorofila a são expressos. Quando os valores de clorofila a foram expressos por unidade de área (mg m-2) os valores mais elevados de biomassa registaram-se nos sedimentos arenosos, enquanto que quando expressos por unidade de peso (µg g-1) ocorreu o contrário, ou seja, os valores mais elevados registaram-se nos locais de vasa (Figura 2.5A). O factor que contribui para esta discrepância dos valores em relação às unidades utilizadas é certamente a percentagem de água das amostras, que é bastante elevada nos sedimentos de vasa (60 – 80%) em comparação com os 20 – 40% existentes nos sedimentos arenosos. Consequentemente, estimou-se um factor de conversão entre as duas unidades. Este factor/razão varia de acordo com o teor em água da amostra (Figura 2.5B). Considerando:
( )
(
1)
2 − − = g µg a Chl m mg a Chl conversão de Factorentão, de acordo com a figura 2.5B
( )
% 4.39 água em conteúdo 053 . 0 × + − = conversão de FactorFigura 2.5: Comparação entre a clorofila a expressa por unidade de peso de sedimento (µg g-1) e por
unidade de área (mg m-2). A) Regressão linear Modelo II da clorofila a expressa em µg g-1 versus clorofila a expressa em mg m-2 para sedimentos de areia (r=0,91; p<0,001; n=138) e de vasa (r=0,90;
p<0,001; n=69). B) Factor de conversão de unidades (µg g-1 em mg m-2), como uma função da percentagem de água do sedimento (r=0,93; p<0,001; n=207).
Clorofila a (HPLC) µg g-1 0 50 100 150 200 250 m g m -2 0 50 100 150 200 250 Areia Vasa A) y = 3,55x - 25,25 y = 0,70x + 6,22
Factor de conversão de unidades
% água 20 30 40 50 60 70 80 F a c to r d e c o n v e rs ã o 0 1 2 3 4 5 B) y = -0,053x + 4,39
Este factor de conversão pode ser aplicado em outros trabalhos, para concentrações de clorofila a nos primeiros 2 mm de sedimento, ou para outras camadas de sedimento desde que o teor em água seja constante dentro da mesma camada.
DISCUSSÃO
A partir dos resultados obtidos, pode concluir-se que os métodos espectrofotométricos são eficazes na determinação dos valores de concentração de clorofila a, podendo ser usados para análises de rotina onde seja necessário um grande número de replicados. O uso do método de acidificação de Lorenzen (1967) é mais correcto na estimativa da biomassa que o de Jeffrey & Humphrey (1975). No entanto, a determinação do total de clorofila a e feopigmentos, pela aplicação das equações tricromáticas, pode ser importante em estudos cujo objectivo seja relacionar a biomassa com a reflectância do sedimento (Kromkamp et al., em impressão). O tipo de sedimento encontra-se bastante relacionado com a concentração de pigmentos degradados. Desta forma, para a determinação da biomassa em sedimentos vasosos (com maiores concentrações de feopigmentos) ou quando se pretende comparar a biomassa entre sedimentos com característica diferentes, o método de Lorenzen (1967) ou a análise por HPLC são a escolha mais apropriada. A escolha entre estas duas metodologias é dependente da razão entre o esforço e o custo da metodologia. A análise de HPLC é cerca de 10 vezes mais dispendiosa quer a nível de preço quer a nível de tempo, relativamente aos métodos espectrofotométricos.
Para além da interferência dos produtos de degradação, existem na literatura científica, várias referências à interferência da clorofila b na determinação da biomassa através do método da acidificação (Lorenzen & Jeffrey, 1980). Esta interferência é amplamente discutida em artigos tais como Varela (1981). No presente trabalho, a concentração de clorofila b foi calculada por análise de HPLC e as razões médias obtidas de clorofila b/clorofila a foram para a vasa e areia de 0,0017 e 0,0006, respectivamente, sendo o valor máximo registado de 0,006. Como estes valores são bastante baixos, o efeito negativo que a clorofila b pode ter na estimativa do valor correcto de biomassa é negligenciável.
Diversos trabalhos têm sido desenvolvidos com o intuito de comparar a análise de HPLC com os métodos espectrofotométricos. Gieskes & Kraay (1983) constataram
que para culturas não existia uma discrepância significativa entre os métodos, no entanto, em amostras naturais a concentração de clorofila a determinada por HPLC era sempre mais baixa que os valores baseados nos métodos espectrofotométricos, mesmo com acidificação. Outros autores chegam a conclusões semelhantes: Daemen (1986) apresenta valores obtidos por HPLC cerca de 30% mais baixos que os calculados por espectrofotometria; Pinckney et al. (1994) obtêm um valor de sobrestimação por parte do método de espectrofotómetro de 16%, apesar dos métodos estarem relacionados linearmente com um elevado nível de significância. Outros autores, porém, como Riaux-Gobin et al. (1987) relatam uma sobrestimação por parte da análise de HPLC. No entanto, existem autores que não encontram diferenças significativas entre as duas metodologias (Barlow et al., 1990; Plante-Cuny et al., 1993), o que está de acordo com a conclusão obtida neste trabalho.
A elevada sobrestimação dos produtos de degradação pelo método espectrofotométrico (cerca de 4 vezes), relativamente ao HPLC, está de acordo com os resultados de Neveux et al. (1990), que apresentam uma sobrestimação de 2,8 vezes. De qualquer maneira, todos os autores são unânimes na necessidade de se efectuarem intercalibrações entre os métodos de espectrofotómetro e HPLC (uma vez que constituem aproximações complementares para o estudo das comunidades de microfitobentos) de forma a poderem ser comparáveis.
No que diz respeito à distribuição espacial da clorofila a, podem obter-se padrões opostos dependendo das unidades em que se apresentem os valores de concentração, somente devido ao efeito que o teor em água do sedimento exerce sobre o cálculo da biomassa (Jesus, 2005). Com os resultados expressos em mg m-2, os valores mais elevados de biomassa registaram-se na areia (baixo teor em água) enquanto que quando expressos em µg g-1 registou-se o contrário, ou seja, uma biomassa mais elevada na vasa (elevado teor em água). Desta forma é necessário ter em atenção as unidades usadas quando se faz a interpretação dos resultados.
As características do sedimento tais como a granulometria, a densidade e a percentagem de água encontram-se fortemente correlacionadas. No entanto, o teor em água é de todos estes factores o mais fácil de determinar. A partir desta característica do sedimento, calculou-se um factor de conversão de unidades que poderá ser usado por outros autores para o Estuário do Tejo e para outros ecossistemas intertidais. Este factor permite converter uma unidade (por exemplo, µg g-1) na outra (mg m-2) quando não se possui informação acerca dos valores de densidade do sedimento.
O tipo de sedimento inclui uma diversidade de factores importantes que determinam o crescimento das microalgas, tais como a penetração da luz, a concentração de nutrientes, o hidrodinamismo, entre outros. A discussão acerca da ecologia destas relações é amplamente descrita na literatura (Cahoon et al., 1999; Underwood & Kromkamp, 1999, e referências aqui citadas), contudo as conclusões obtidas diferem consoante o autor, local de estudo e unidades escolhidas. No entanto, não é objectivo do presente trabalho discutir a influência das características do sedimento na biomassa ou na composição taxonómica, mas sim alertar para a importância da escolha das unidades de biomassa para uma correcta análise dos resultados obtidos.