COMPOSIÇÃO E DIVERSIDADE PIGMENTAR NA COMUNIDADE DE MICROFITOBENTOS DO ESTUÁRIO DO TEJO

Departamento de Biologia Vegetal

COMPOSIÇÃO E DIVERSIDADE PIGMENTAR NA

COMUNIDADE DE MICROFITOBENTOS DO

ESTUÁRIO DO TEJO

Carlos Rafael Borges Mendes

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Biologia e Gestão de Recursos Marinhos (área Biodiversidade e Ecologia Marinha)

Departamento de Biologia Vegetal

COMPOSIÇÃO E DIVERSIDADE PIGMENTAR NA

COMUNIDADE DE MICROFITOBENTOS DO

ESTUÁRIO DO TEJO

Carlos Rafael Borges Mendes

Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Biologia e Gestão de Recursos Marinhos (área Biodiversidade e Ecologia Marinha)

Tese orientada por:

Professora Doutora Vanda Costa Brotas Gonçalves Lisboa, 2005

DECLARAÇÃO

Na presente dissertação inclui-se um trabalho que foi objecto de publicação em colaboração com os seguintes autores: V. Brotas e P. Cartaxana.

Para efeitos no disposto do ponto 1 do Artigo 40 do Regulamento de Estudos Pós-Graduados publicado no Diário da República n.º 153 de 5 de Julho de 2003, o autor desta dissertação declara que interveio em todas as partes da concepção do trabalho submetido a publicação. Nomeadamente na concepção e execução do trabalho experimental, na interpretação dos resultados e na redacção do manuscrito.

Carlos Rafael Borges Mendes

Dezembro de 2005

Gostaria de agradecer não só pela ajuda preciosa que tive na elaboração desta dissertação, mas essencialmente por todo o apoio que tenho tido no início da minha carreira como Biólogo:

À Prof. Doutora Vanda Brotas, por tudo o que me tem ensinado e pela forma como me orientou neste trabalho. Estou-lhe muito agradecido pela amizade, compreensão, liberdade e confiança que sempre depositou na minha pessoa.

Ao Paulo Cartaxana, pela ajuda preciosa que me deu nas técnicas de HPLC e pela forma como fez a revisão da dissertação.

Ao Bruno de Jesus, por ter tido sempre uma grande disponibilidade em apoiar-me no trabalho de laboratório e pela ajuda que dispensou na elaboração e revisão deste manuscrito.

A todas as pessoas do Instituto de Oceanografia, em especial às do grupo de Botânica Marinha, pela amizade e camaradagem.

À equipa do Sat-Tagis do DBA, liderada pelo Dr. Zé Pedro Granadeiro, por terem efectuado as colheitas de sedimento para a análise de pigmentos.

À Sofia, pela ajuda que disponibilizou na correcção ortográfica do manuscrito e por nunca se cansar de tentar corrigir o meu “Português Ribatejano”.

Aos colegas de laboratório, por me terem “aturado” durante as muitas horas que passei no aparelho de HPLC. Um agradecimento especial ao Lourenço e à Carla pela amizade e boa disposição, e à Vera por me ter auxiliado no trabalho com as culturas.

Finalmente, aos meus Pais e aos meus irmãos por me terem acompanhado em mais uma importante etapa da minha vida. Sem eles, todo este trabalho teria sido muito mais difícil, ou mesmo, impossível.

As coisas não são o que são, mas tornam-se, na sua influência sobre

nós, o que nós vamos pensando delas.

Resumo 1

Summary 3

1. Introdução geral 5

Enquadramento e objectivos 5

2. Determinação da biomassa de microfitobentos por análise pigmentar:

comparação dos métodos de HPLC e espectrofotometria 7

Resumo 9

Introdução 10

Material e métodos 12

Resultados 15

Discussão 18

3. Estudo comparativo de colunas C8 e C18 na discriminação de pigmentos 21

fotossintéticos por HPLC Resumo 23 Introdução 24 Material e métodos 25 Resultados 28 Discussão 37

4. Estudo da comunidade de microfitobentos do estuário do Tejo através da análise

de pigmentos fotossintéticos por HPLC 41

Resumo 43 Introdução 44 Material e métodos 46 Resultados 48 Discussão 59 Conclusão 62 5. Conclusões finais 65 Referências bibliográficas 67

RESUMO

No decorrer deste trabalho testaram-se diferentes métodos de espectrofotometria e HPLC (Cromatografia Líquida de Elevada Resolução) para quantificação da clorofila a (índice de biomassa) em microalgas bênticas colonizadoras dos sedimentos intertidais do Estuário do Tejo. O método espectrofotométrico de Jeffrey & Humphrey (1975) sobrestimou os valores de clorofila a, em sedimentos vasosos, por estes apresentarem um elevado teor em feopigmentos. O método de Lorenzen (1967), pelo facto de entrar em conta com os produtos de degradação, demonstrou ser um método eficaz na quantificação da biomassa, independentemente do tipo de sedimento. No entanto, os métodos de HPLC são importantes quando se pretende, para além da concentração de clorofila a, uma correcta quantificação da concentração de feopigmentos e carotenoides. Na comparação de duas metodologias de HPLC (colunas C8 e C18), concluiu-se

que, com o método da coluna C18 (Kray et al., 1992), foi possível separar de forma

eficiente a quase totalidade dos pigmentos fotossintéticos. Este método apresenta uma relação custo/tempo mais vantajosa, relativamente ao método da coluna C8 (Zapata et

al., 2002), não permitindo, contudo, a separação das clorofilas c1 e c2, o que é possível

com a coluna C8.

A distribuição espacial do microfitobentos no Estuário do Tejo foi estudada através da quantificação dos pigmentos fotossintéticos existentes nos 2 mm superficiais de sedimento. Os valores de clorofila a detectados situaram-se entre os 4,5 e 119,9 µg g -1 _{(65% dos quais entre 10 e 40 µg g}-1_{), sendo que os mais elevados se registaram nas}

zonas com cota de maré mais elevada. Por outro lado, os valores de biomassa não apresentaram nenhuma relação directa com o tipo de sedimento, no entanto, algumas razões pigmentares, onde se destaca a razão de feopigmentos/clorofila a e a razão de fucoxantina/clorofila c, apresentaram valores mais elevados nos sedimentos vasosos, relativamente aos sedimentos de areia. Numa zona central do estuário, dominada por sedimentos de vasa, detectaram-se os valores mais elevados de feopigmentos e de detritos de fanerogâmicas e/ou macroalgas por esta ser uma zona menos hidrodinâmica e, como tal, propícia a fenómenos de deposição.

Palavras-chave: Microfitobentos, biomassa, pigmentos fotossintéticos, HPLC,

SUMMARY

Different methods of spectrophotometry and HPLC (High Performance Liquid Chromatography) were tested in order to quantify chlorophyll a (biomass index) in the benthic microalgae community that colonizes the intertidal sediments of Tagus Estuary. In “muddy” sediments, Jeffrey & Humphrey (1975) overestimated chlorophyll a, as their method does not include acidification, and pheopigments are quantified as chlorophyll a. Lorenzen method (1967) proved to be efficient in biomass quantification regardless of the type of sediment, because it also takes in consideration degradation products (pheopigments). HPLC methods allow the quantification of other photosynthetic pigments, besides chrophyll a, some of which are markers of the main taxonomic groups of microalgae present in the microphytobenthic community.

Two different HPLC methodologies (C8 and C18 columns) were compared,

showing that C18 column (Kray et al., 1992) is efficient in separating the majority of

photosynthetic pigments. This method presents a more advantageous ratio effort/achievement when compared to C8 column method (Zapata et al., 2002). In the

C18 method, chlorophyll c1 and c2 co-elute, being completely separated by the C8

method.

Spatial distribution of microphytobenthos in the Tagus Estuary was investigated through the quantification of photosynthetic pigments in the upper 2 mm of sediment. Concentrations of chlorophyll a varied between 4.5 and 119.9 µg g-1 _{(65% of which}

between 10 and 40 µg g-1_{). The maximum values were obtained in the areas with higher}

tidal height. Biomass values did not present any correlation with the type of sediment, however, some pigment ratios as pheopigments/chl a and fucoxanthin/chl c showed higher values in “muddy” sediments than in “sandy” sediments. Maximum values of pheopigments were registered in a central area of the Estuary, rich in “muddy” sediments. This area also presented considerable amounts of phanerogam and macroalgae debris, possibly related to its low hydrodynamism, favorable to deposition events.

Keywords: Microphytobenthos, biomass, photosynthetic pigments, HPLC,

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO GERAL

ENQUADRAMENTO E OBJECTIVOS

O microfitobentos é definido como a comunidade de microalgas unicelulares, que coloniza a superfície dos sedimentos aquáticos nas zonas entre-marés e nas zonas costeiras pouco profundas. Esta comunidade é constituída por diatomáceas, euglenófitas e cianobactérias, sendo o grupo das diatomáceas o mais abundante. Estas microalgas bênticas são importantes produtores primários marinhos dos sistemas estuarinos, contribuindo para que as zonas intertidais dos estuários, apesar das amplitudes de temperatura e salinidade a que estão sujeitos, se situem entre os ecossistemas mais produtivos da Terra. Por outro lado, esta comunidade entra na base das cadeias tróficas estuarinas, é importante para a estabilização dos sedimentos e desempenha um papel importante nos ciclos biogeoquímicos que ocorrem na interface sedimento/ar.

Uma das formas de caracterizar esta comunidade é através da análise dos seus pigmentos fotossintéticos. As técnicas de cromatografia, como as de HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Resolução), têm sido usadas extensivamente na separação e quantificação de pigmentos em microalgas, pois permitem uma separação eficiente dos diversos pigmentos fotossintéticos e de seus respectivos produtos de degradação. Esta é uma vantagem dos métodos de HPLC relativamente a outros métodos com menor poder de discriminação, como o caso do espectrofotómetro. A quantificação de todos os pigmentos fotossintéticos permite efectuar uma análise a nível taxonómico, utilizando para isso pigmentos diagnosticantes de determinado taxon

Nesta dissertação efectuou-se uma abordagem à diversidade de pigmentos fotossintéticos existentes no sedimento e discutiu-se as metodologias associadas à sua análise. Desta forma, dando grande importância aos aspectos metodológicos de análise pigmentar, a investigação efectuada incidiu nos seguintes objectivos:

– Comparar os métodos de espectrofotometria e de HPLC (cromatografia líquida de alta resolução), no cálculo da biomassa de microfitobentos.

– Testar a eficiência de dois métodos diferentes de HPLC na separação e quantificação de pigmentos fotossintéticos, usando culturas e amostras naturais de microfitobentos e fitoplâncton.

– Fazer uma análise da distribuição espacial do microfitobentos das zonas intertidais do Estuário do Tejo, tendo como base a análise pigmentar.

CAPÍTULO 2

DETERMINAÇÃO DA BIOMASSA DE MICROFITOBENTOS POR

ANÁLISE PIGMENTAR: COMPARAÇÃO DOS MÉTODOS DE HPLC

E ESPECTROFOTOMETRIA.

Parte deste capítulo constitui o seguinte artigo, aceite para publicação na revista

Hydrobiologia, em Fevereiro de 2005:

Brotas, V., C. R. Mendes & P. Cartaxana, 2005. Microphytobenthic Biomass Assessment by Pigment Analysis: Comparison of Spectrophotometry and High Performance Liquid Chromatography Methods.

RESUMO

Amostras de microfitobentos recolhidas no Estuário do Tejo foram analisadas, relativamente ao conteúdo em pigmentos fotossintéticos, por espectrofotometria e por Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC). Os valores de clorofila a obtidos por HPLC e espectrofotometria revelaram uma correlação positiva com elevada significância para ambos os métodos espectrofotométricos usados: Lorenzen (1967) e Jeffrey & Humphrey (1975). Contudo, constatou-se que a relação entre os dois métodos espectrofotométricos variou consoante o tipo de sedimento, ou seja, nos sedimentos arenosos os valores de clorofila a foram bastante semelhantes, enquanto que nos vasosos se verificou uma sobrestimação por parte do método de Jeffrey & Humphrey. Concluiu-se que os métodos espectrofotométricos fornecem valores correctos de clorofila a (biomassa), pelo que podem ser utilizados em análises de rotina, nas quais um elevado número de replicados seja necessário. No entanto, para uma correcta estimação da concentração de feopigmentos e carotenoides, a análise por HPLC é indispensável. Tendo em conta que na literatura é frequente encontrar os valores de clorofila a expressos por unidade de peso (µg g-1) ou por unidade de área (mg m-2), discutiu-se a influência da unidade utilizada nos resultados obtidos. Propôs-se, ainda, um factor de conversão de unidades baseado na percentagem de água do sedimento.

INTRODUÇÃO

Microfitobentos é a comunidade de algas unicelulares que coloniza a superfície dos sedimentos e é constituída essencialmente por diatomáceas, euglenófitas e cianobactérias. As microalgas que fazem parte desta comunidade são importantes produtores primários marinhos e, juntamente com o fitoplâncton, as macroalgas e as halófitas constituem a base das cadeias tróficas dos sistemas estuarinos. Para além disso, possuem um papel importante nos ciclos biogeoquímicos que ocorrem na interface sedimento/ar, contribuem para a oxigenação da interface sedimento-água e para a consolidação dos sedimentos através da produção de compostos extracelulares coesivos.

Uma das metodologias utilizada em estudos de Biologia Marinha é a determinação da clorofila a, importante na estimativa da biomassa de algas em vários ambientes marinhos e de água doce (Barlow et al., 1990). A biomassa da comunidade de microfitobentos é usualmente determinada usando como aproximação a concentração de clorofila a por unidade de peso de sedimento ou por unidade de área (Perkins et al., 2003). As múltiplas funções que esta comunidade desempenha nos ambientes costeiros, justificam a necessidade de se obter uma estimativa correcta do valor da biomassa. O principal objectivo deste estudo foi comparar e discutir as metodologias utilizadas na determinação da biomassa (espectrofotometria e HPLC) usando um grande conjunto de dados de campo.

O método espectrofotométrico é o mais simples na determinação da concentração da clorofila a. O primeiro método espectrofotométrico (tricromático) usado para pigmentos de algas em ambiente marinho foi descrito por Richards & Thompson (1952), e normalizado pela SCOR-UNESCO (UNESCO, 1966). Esta metodologia tem sofrido algumas alterações, nomeadamente no que respeita aos coeficientes utilizados nas equações tricromáticas, sendo o trabalho de Jeffrey & Humphrey (1975) um dos mais citados na bibliografia. A estrutura química da clorofila

a é alterada por diversos processos biológicos e físico-químicos que conduzem a

derivados fotossinteticamente inactivos, mas que absorvem luz no mesmo comprimento de onda que a molécula de clorofila a. O método anteriormente referido, não tendo em conta estas formas degradadas, introduz um erro no cálculo da concentração da clorofila

a. As transformações mais frequentes que ocorrem na molécula de clorofila a são a

em feofitina a e clorofilide a, respectivamente. A feofitina, por sua vez, ao perder a cadeia de fitol transforma-se em feoforbide a (Figura 2.1). Apesar destes compostos apresentarem um espectro de absorção muito semelhante, a clorofila a tem um coeficiente específico de absorção superior, ou seja, absorve maior quantidade de luz por unidade de peso. Lorenzen (1967), a fim de eliminar o efeito dos produtos de degradação, propôs a acidificação do extracto. Adicionando ácido diluído a uma solução contendo clorofila a, esta perde o átomo de magnésio e transforma-se em feofitina a. O decréscimo da absorvância com a acidificação é proporcional à concentração de clorofila a e a absorvância lida após a adição do ácido é atribuída ao total de feofitinas e feoforbides (Brown et al., 1981). Existem outros produtos de degradação da clorofila a que retêm o magnésio, tais como clorofilides e outros pigmentos não identificados (possivelmente isómeros e alómeros da clorofila a) que absorvem a luz de forma semelhante à clorofila a e que não podem ser distinguidos por uma simples acidificação. De modo a solucionar este problema, pode recorrer-se à separação dos pigmentos utilizando um sistema de HPLC (Gieskes & Kray, 1983).

As técnicas de cromatografia, como a de HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Resolução), têm sido usadas extensivamente em análises pigmentares com o objectivo

21 23 4 1 20 19 18 1716 15 5 31 1 2 3 6 7 8 9 10 11 12 14 13 12 1 2 8 8 1 2 1 13 13 P3 P2 P1 P7 P11 17 2 17 17 18 1 1 7 P15 P15 P16 P11 3 3 P31 3 1 P73 1 CH H CH H O O C 3 COOCH O H H H Mg 24 N 23N 22N 21 N 3 CH H CH H O O C 3 COOCH O H H H N N N N H H 3 3 COOCH O H H H Mg N _N N N COOH COOH O H H H N N N N H H 3 COOCH A) B) C) D)

Figura 2.1: Estrutura química da Clorofila a e dos seus derivados. A – Clorofila a; B – Feofitina a; C – Clorofilide a; D – Feoforbide a (figura cordialmente cedida por Bruno de Jesus).

de investigar a composição taxonómica do microfitobentos (Riaux-Gobin et al., 1987; Klein & Riaux-Gobin, 1991; Brotas & Plante-Cuny, 1998). Com estes métodos quase todos os pigmentos e seus respectivos produtos de degradação podem ser separados e correctamente quantificados (Riaux-Gobin et al., 1987). Desta forma, o método de HPLC pode fornecer medidas exactas da concentração de clorofila a pois permite separá-la dos seus respectivos produtos de degradação (Riaux-Gobin & Bourgoin, 2002; Brotas & Plante-Cuny, 2003; Cartaxana & Brotas, 2003). É de consenso geral que o método de HPLC é o mais exacto e o que apresenta maior confiança como técnica na medição da concentração da clorofila a (Pinckney et al., 1994). No entanto, com este método, o processamento das amostras é relativamente demorado e mais caro, tornando-se num método menos prático quando tornando-se quer processar um grande número de amostras.

Na vasta literatura disponível sobre microfitobentos, as unidades usadas para exprimir a concentração da clorofila a diferem consoante o estudo em questão. Alguns autores apresentam os valores de clorofila a em µg g-1 (Klein & Riaux-Gobin, 1991; Brotas & Plante-Cuny, 2003), outros apresentam em mg m-2 (Pinckney et al., 1994; Garrige, 1998; Méléder et al., 2003) e outros ainda apresentam nas duas unidades (Perkins et al., 2003; Montani et al., 2003). A apresentação dos valores de clorofila a em ambas as unidades permite leituras diferentes dos resultados. Foi o que constatou Perkins et al. (2003) que só conseguiram visualizar o ciclo tidal (com picos de clorofila

a em maré baixa) com os valores expressos em µg g-1. Segundo Cahoon & Safi (2002),

que calcularam as concentrações por unidade de área, os sedimentos que apresentaram maiores valores de biomassa foram os arenosos. Outros trabalhos, como por exemplo o de Brotas et al. (1995), que apresentam os valores de clorofila a em µg g-1, obtêm os valores mais elevados de biomassa nos sedimentos vasosos. A relação da biomassa e das unidades em que é expressa com o tipo de sedimento é uma das questões abordadas no presente trabalho.

MATERIAL E MÉTODOS Área de estudo e amostragem

A área de estudo foi o estuário do Tejo (38º44’N, 09º08’W), um estuário pouco profundo, mesotidal e com uma área de aproximadamente 320 Km2. Possui uma extensa

área de zona intertidal (cerca de 20 a 40% da sua área total, em marés mortas e marés vivas, respectivamente) que é constituída por sapais, antigas ostreiras e bancos de vasa e areia. Os sedimentos são tipicamente de areia em zonas de maior hidrodinamismo e de vasa em zonas mais abrigadas.

Figura 2.2: Esquema de um “contact corer”, conforme Honeywill et al. (2002).

As amostras foram recolhidas de dois em dois meses, desde Setembro de 2002 a Julho de 2004, em seis locais de amostragem distribuídos por uma área de 0,24 Km2, localizada em Alcochete, na região média do estuário. A amostragem foi realizada durante a baixa-mar tendo-se usado como método de amostragem o “contact corer” (Figura 2.2).

O “contact corer”, primeiramente descrito por Honeywill et al. (2002), consiste num pequeno disco de metal (área 18,86 cm2) com 2 mm de profundidade, usado para extrair os 2 mm superficiais de sedimento (Figura 2.2). O “contact corer” é colocado sobre a superfície do sedimento e na cavidade que fica voltada para cima coloca-se azoto líquido de forma a congelar o sedimento da cavidade inferior. Deixa-se o azoto líquido a actuar durante 2-3 minutos (o tempo varia de acordo com as condições do sedimento, como por exemplo o teor em água, o vento, etc.). Retira-se o “contact corer” e raspa-se a superfície com a ajuda de uma faca de forma a obter um cilindro de sedimento com uma espessura de 2 mm. De seguida as amostras são embrulhadas em papel de alumínio, previamente identificado, e congeladas imediatamente em azoto líquido.

As amostras foram transportadas do campo para o laboratório num contentor com azoto líquido. No laboratório, as amostras foram pesadas e liofilizadas durante 48 horas. Depois da liofilização as amostras foram novamente pesadas de forma a obter-se o seu teor em água. Adicionalmente foram recolhidas amostras para determinar a

granulometria do sedimento, tendo-se usado uma bateria de crivos para esse fim. De acordo com a classificação de Folk (1954), identificaram-se quatro locais de amostragem de areia e dois locais de vasa. Obteve-se um total de 207 amostras (138 de areia e 69 de vasa) que foram analisadas através do espectrofotómetro e de Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC).

Análise Espectrofotométrica

No laboratório, os pigmentos fotossintéticos foram extraídos, usando-se sub-amostras de sedimento liofilizado (0,3-0,6 g), com 3 ml de acetona a 90%. A extracção foi realizada durante 48 horas no escuro a -80ºC (livro de protocolos do HIMOM, 2005). Findo este tempo as amostras foram agitadas com a ajuda do “vortex”, centrifugadas a 3500rpm durante 15 minutos e extraiu-se o sobrenadante que foi analisado através de um espectrofotómetro Shimadzu UV-1603. Os valores da concentração de clorofila a e dos feopigmentos foram obtidos antes e depois da acidificação com 0,5 M HCl (12 µl de HCl para 1 ml de extracto), respectivamente (Lorenzen, 1967). Os valores da concentração de clorofila a foram, também, estimados a partir das equações tricromáticas de Jeffrey & Humphrey (1975) as quais não incluem o passo da acidificação. Os resultados foram expressos em µg g-1 e em mg m-2.

Análise de HPLC

Sub-amostras de aproximadamente 0,2 g de sedimento liofilizado foram utilizadas para se efectuar a extracção dos pigmentos com 2 ml de metanol tamponizado (com 2% de acetato de amónio) durante 15 minutos a -20ºC no escuro. No início da extracção as amostras foram sujeitas a um período de 30 segundos de ultra-sons. Os extractos obtidos foram filtrados (filtros de membrana Whatman de 0,2 µm de poro) imediatamente antes da análise de HPLC. Esta análise efectuou-se usando um aparelho de HPLC Shimadzu que inclui um módulo distribuidor de solvente (LC-10ADVP) com um sistema de controlo (SCL-10AVP), um detector de fotodiodos (SPD-M10AVP) e um detector de fluorescência (RF-10AXL). A separação cromatográfica dos pigmentos foi efectuada usando uma coluna C18 de fase reversa (Supelcosil; 25 cm de comprimento; 4,6 mm de diâmetro e 5 µm de tamanho das partículas). Os solventes usados foram 0,5 M de acetato de amónio em metanol e água (85:15; v/v), acetonitrilo e

água (90:10; v/v) e 100% de acetato de etilo. O gradiente dos solventes seguiu o método de Kraay et al. (1992) adaptado por Brotas & Plante-Cuny (2003) com um fluxo de 0,6 ml min-1 e um volume de injecção de 100 µl. A identificação e calibração dos picos foi efectuada usando standard de clorofila a da Sigma e standard de feofitina a da DHI. O standard de feoforbide a foi preparado a partir da macroalga Enteromorpha intestinalis, de acordo com o procedimento descrito por Brotas & Plante-Cuny (1996). Os pigmentos foram identificados pelos espectros de absorção e respectivos tempos de retenção. A concentração foi calculada a partir do sinal obtido pelo detector de fotodiodos e/ou pelo detector de fluorescência.

Para análise dos resultados obtidos aplicou-se uma regressão linear modelo II, método mais adequado quando se trabalha com variáveis independentes (sujeitas a erros de medida). Calculou-se os valores de correlação de Pearson e o respectivo nível de significância.

RESULTADOS

As concentrações de clorofila a determinadas pelos métodos de espectrofotometria utilizados neste trabalho encontram-se bastante correlacionadas com os valores obtidos por HPLC (r=0,95 para o método de Lorenzen; r=0,94 para o de Jeffrey & Humphrey)

Figura 2.3: Regressão linear Modelo II entre os valores de clorofila a determinados pelos métodos

espectrofotométricos e HPLC. A) Relação entre a clorofila a medida pelo método de Lorenzen (1967) e o de HPLC (r=0,95; p<0,001; n=207); B) Relação entre a clorofila a medida pelas equações de Jeffrey & Humphrey (1975) e o método de HPLC (r=0,94; p<0,001; n=207). Clorofila a (µg g-1) Lorenzen, 1967 0 50 100 150 200 H P L C 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 A) y = 1,05x + 3,24 Clorofila a (µg g-1)

Jeffrey & Humphrey, 1975

0 50 100 150 200 H P L C 0 50 100 150 200 B) y = 0,74x + 5,72

(Figura 2.3A e 2.3B). No entanto, os valores apenas são bastante similares para o método de Lorenzen (declive=1,05) (Figura 2.3A), enquanto que para o método de Jeffrey & Humphrey existe uma sobrestimação na determinação da concentração da clorofila a relativamente ao valor determinado por HPLC (declive=0,74) (Figura 2.3B).

Comparando os dois métodos de espectrofotometria, constatou-se que ambos se correlacionam fortemente entre si (r=0,98). Contudo, a relação entre eles variou de acordo com o tipo de sedimento (Figura 2.4A). Desta forma, para os sedimentos arenosos, os valores obtidos para a clorofila a foram bastante idênticos (declive=1,07), enquanto que nos sedimentos de vasa o método de Jeffrey & Humphrey (sem acidificação da amostra) sobrestimou o valor da concentração da clorofila a em cerca de 20 % (declive=1,18), relativamente ao método de Lorenzen (com acidificação) (Figura 2.4A). Em relação aos feopigmentos, usando o método de Lorenzen (1967), verificou-se a existência de uma forte correlação entre os resultados obtidos no espectrofotómetro e por HPLC. Contudo, o método espectrofotométrico sobrestimou consideravelmente os produtos de degradação da clorofila a em relação ao método de HPLC (Figura 2.4B).

Figura 2.4: Regressão linear Modelo II A) entre os valores de clorofila a calculados pelos dois métodos espectrofotométricos para as amostras de areia (r=0,98; p<0,001; n=138) e de vasa (r=0,99; p<0,001; n=69) e B) entre os valores de feopigmentos calculados por Lorenzen (1967) e HPLC (r=0,96; p<0,001; n=207). Clorofila a (µg g-1) Lorenzen, 1967 0 50 100 150 200 J e ff re y & H u m p h re y , 1 9 7 5 0 50 100 150 200 Areia Vasa A) y = 1,18x + 19,27 y = 1,07x + 4,68 Feopigmentos (µg g-1) Lorenzen, 1967 0 20 40 60 80 100 H P L C 0 5 10 15 20 Areia Vasa B) y = 0,23x - 0,79

A interpretação dos resultados depende das unidades em que os valores de clorofila a são expressos. Quando os valores de clorofila a foram expressos por unidade de área (mg m-2) os valores mais elevados de biomassa registaram-se nos sedimentos arenosos, enquanto que quando expressos por unidade de peso (µg g-1_{) ocorreu o}

contrário, ou seja, os valores mais elevados registaram-se nos locais de vasa (Figura 2.5A). O factor que contribui para esta discrepância dos valores em relação às unidades utilizadas é certamente a percentagem de água das amostras, que é bastante elevada nos sedimentos de vasa (60 – 80%) em comparação com os 20 – 40% existentes nos sedimentos arenosos. Consequentemente, estimou-se um factor de conversão entre as duas unidades. Este factor/razão varia de acordo com o teor em água da amostra (Figura 2.5B). Considerando:

(

)

(

)

então, de acordo com a figura 2.5B

( )

Figura 2.5: Comparação entre a clorofila a expressa por unidade de peso de sedimento (µg g-1_{) e por}

unidade de área (mg m-2_{). A) Regressão linear Modelo II da clorofila a expressa em µg g}-1 _versus clorofila a expressa em mg m-2 _{para sedimentos de areia (r=0,91; p<0,001; n=138) e de vasa (r=0,90;}

p<0,001; n=69). B) Factor de conversão de unidades (µg g-1 em mg m-2), como uma função da

percentagem de água do sedimento (r=0,93; p<0,001; n=207).

Clorofila a (HPLC) µg g-1 0 50 100 150 200 250 m g m -2 0 50 100 150 200 250 Areia Vasa A) y = 3,55x - 25,25 y = 0,70x + 6,22

Factor de conversão de unidades

% água 20 30 40 50 60 70 80 F a c to r d e c o n v e rs ã o 0 1 2 3 4 5 B) y = -0,053x + 4,39

Este factor de conversão pode ser aplicado em outros trabalhos, para concentrações de clorofila a nos primeiros 2 mm de sedimento, ou para outras camadas de sedimento desde que o teor em água seja constante dentro da mesma camada.

DISCUSSÃO

A partir dos resultados obtidos, pode concluir-se que os métodos espectrofotométricos são eficazes na determinação dos valores de concentração de clorofila a, podendo ser usados para análises de rotina onde seja necessário um grande número de replicados. O uso do método de acidificação de Lorenzen (1967) é mais correcto na estimativa da biomassa que o de Jeffrey & Humphrey (1975). No entanto, a determinação do total de clorofila a e feopigmentos, pela aplicação das equações tricromáticas, pode ser importante em estudos cujo objectivo seja relacionar a biomassa com a reflectância do sedimento (Kromkamp et al., em impressão). O tipo de sedimento encontra-se bastante relacionado com a concentração de pigmentos degradados. Desta forma, para a determinação da biomassa em sedimentos vasosos (com maiores concentrações de feopigmentos) ou quando se pretende comparar a biomassa entre sedimentos com característica diferentes, o método de Lorenzen (1967) ou a análise por HPLC são a escolha mais apropriada. A escolha entre estas duas metodologias é dependente da razão entre o esforço e o custo da metodologia. A análise de HPLC é cerca de 10 vezes mais dispendiosa quer a nível de preço quer a nível de tempo, relativamente aos métodos espectrofotométricos.

Para além da interferência dos produtos de degradação, existem na literatura científica, várias referências à interferência da clorofila b na determinação da biomassa através do método da acidificação (Lorenzen & Jeffrey, 1980). Esta interferência é amplamente discutida em artigos tais como Varela (1981). No presente trabalho, a concentração de clorofila b foi calculada por análise de HPLC e as razões médias obtidas de clorofila b/clorofila a foram para a vasa e areia de 0,0017 e 0,0006, respectivamente, sendo o valor máximo registado de 0,006. Como estes valores são bastante baixos, o efeito negativo que a clorofila b pode ter na estimativa do valor correcto de biomassa é negligenciável.

Diversos trabalhos têm sido desenvolvidos com o intuito de comparar a análise de HPLC com os métodos espectrofotométricos. Gieskes & Kraay (1983) constataram

que para culturas não existia uma discrepância significativa entre os métodos, no entanto, em amostras naturais a concentração de clorofila a determinada por HPLC era sempre mais baixa que os valores baseados nos métodos espectrofotométricos, mesmo com acidificação. Outros autores chegam a conclusões semelhantes: Daemen (1986) apresenta valores obtidos por HPLC cerca de 30% mais baixos que os calculados por espectrofotometria; Pinckney et al. (1994) obtêm um valor de sobrestimação por parte do método de espectrofotómetro de 16%, apesar dos métodos estarem relacionados linearmente com um elevado nível de significância. Outros autores, porém, como Riaux-Gobin et al. (1987) relatam uma sobrestimação por parte da análise de HPLC. No entanto, existem autores que não encontram diferenças significativas entre as duas metodologias (Barlow et al., 1990; Plante-Cuny et al., 1993), o que está de acordo com a conclusão obtida neste trabalho.

A elevada sobrestimação dos produtos de degradação pelo método espectrofotométrico (cerca de 4 vezes), relativamente ao HPLC, está de acordo com os resultados de Neveux et al. (1990), que apresentam uma sobrestimação de 2,8 vezes. De qualquer maneira, todos os autores são unânimes na necessidade de se efectuarem intercalibrações entre os métodos de espectrofotómetro e HPLC (uma vez que constituem aproximações complementares para o estudo das comunidades de microfitobentos) de forma a poderem ser comparáveis.

No que diz respeito à distribuição espacial da clorofila a, podem obter-se padrões opostos dependendo das unidades em que se apresentem os valores de concentração, somente devido ao efeito que o teor em água do sedimento exerce sobre o cálculo da biomassa (Jesus, 2005). Com os resultados expressos em mg m-2, os valores mais elevados de biomassa registaram-se na areia (baixo teor em água) enquanto que quando expressos em µg g-1 registou-se o contrário, ou seja, uma biomassa mais elevada na vasa (elevado teor em água). Desta forma é necessário ter em atenção as unidades usadas quando se faz a interpretação dos resultados.

As características do sedimento tais como a granulometria, a densidade e a percentagem de água encontram-se fortemente correlacionadas. No entanto, o teor em água é de todos estes factores o mais fácil de determinar. A partir desta característica do sedimento, calculou-se um factor de conversão de unidades que poderá ser usado por outros autores para o Estuário do Tejo e para outros ecossistemas intertidais. Este factor permite converter uma unidade (por exemplo, µg g-1) na outra (mg m-2) quando não se possui informação acerca dos valores de densidade do sedimento.

O tipo de sedimento inclui uma diversidade de factores importantes que determinam o crescimento das microalgas, tais como a penetração da luz, a concentração de nutrientes, o hidrodinamismo, entre outros. A discussão acerca da ecologia destas relações é amplamente descrita na literatura (Cahoon et al., 1999; Underwood & Kromkamp, 1999, e referências aqui citadas), contudo as conclusões obtidas diferem consoante o autor, local de estudo e unidades escolhidas. No entanto, não é objectivo do presente trabalho discutir a influência das características do sedimento na biomassa ou na composição taxonómica, mas sim alertar para a importância da escolha das unidades de biomassa para uma correcta análise dos resultados obtidos.

CAPÍTULO 3

ESTUDO COMPARATIVO DE COLUNAS C

E C

NA

RESUMO

Neste trabalho foram comparadas duas metodologias de análise de pigmentos fotossintéticos por HPLC, utilizando-se duas colunas com características diferentes. A coluna C8, vulgarmente utilizada na separação de pigmentos em fitoplâncton,

demonstrou ser extremamente eficiente na separação das clorofilas c1 e c2. No entanto,

apresentou algumas limitações no que diz respeito à separação de pigmentos característicos do sedimento, tais como a neofucoxantina, o diadinocromo e o fucoxantinol. Por outro lado, o método usado com esta coluna apresentou um nível de detecção mais baixo que o da coluna C18, dificultando a detecção de pigmentos que

apareceram em concentrações reduzidas. Para além disto, constatou-se que a coluna C8

retém no seu interior pigmentos que são extraídos nas corridas seguintes, dificultando uma análise correcta dos resultados obtidos. Outro aspecto importante a ter em conta é o menor tempo gasto em cada corrida e a menor quantidade de solventes necessários no método da coluna C18. Concluiu-se que o método com a coluna C18 é mais económico e,

salvo seja importante a separação das clorofilas c1 e c2, mais eficiente na separação dos

pigmentos fotossintéticos. Para este estudo, utilizaram-se culturas de Cylindroteca

INTRODUÇÃO

As técnicas de cromatografia, como o HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Resolução), têm sido usadas extensivamente na estimação da concentração de pigmentos em fitoplâncton e microfitobentos. Com estes métodos quase todos os pigmentos e os seus respectivos produtos de degradação podem ser separados e correctamente quantificados (Gieskes & Kraay, 1983; Mantoura & Llewellyn, 1983; Riaux-Gobin et al., 1987).

Os pigmentos fotossintéticos e os seus produtos de degradação podem fornecer informação acerca da biomassa, produtividade, taxonomia e estado fisiológico das microalgas em sistemas aquáticos (Neveux et al., 1990). Em estudos de produtividade primária marinha, este conhecimento aprofundado da presença e das quantidades dos pigmentos fotossintéticos é um conhecimento fundamental pois deles depende a forma como a luz é absorvida pelos organismos fotossintéticos (Gieskes & Kraay, 1983). Esta técnica de cromatografia, de fluxo rápido, consiste no uso de uma coluna de pequeno diâmetro, cujo interior é preenchido com partículas de tamanho reduzido (Brotas & Plante-Cuny, 2003). Os diversos métodos de HPLC divergem no tipo de coluna usada (fase estacionária) e no tipo de solventes da fracção móvel. Características como a composição da fase móvel (solventes), o gradiente de solventes utilizado, sistemas de temperatura controlada (necessários para a estabilidade dos tempos de retenção dos pigmentos) e o tipo de coluna, têm sido testadas ao longo dos últimos anos em investigação oceanográfica. Diversos tipos de colunas têm sido utilizados na análise de pigmentos, como a Octadecilsílica C18, a Octilsílica C8 e mesmo colunas C30 com

diferentes diâmetros, comprimentos, tamanho das partículas e com diferentes graus de eficiência (Zapata et al., 2000; Barlow et al., 2002; Rodriguez et al., 2002).

O objectivo deste trabalho consistiu em comparar as metodologias usadas por Kraay et al. (1992) e por Zapata et al. (2000), utilizando standards de pigmentos, amostras naturais de fitoplâncton, de microfitobentos e culturas da diatomácea

Cylindroteca closterium. O método de HPLC descrito por Kraay et al. (1992) utiliza

uma coluna C18 e uma fase móvel constituída por três solventes (metanol, acetonitrilo e

acetato de etilo). Este método tem sido bastante utilizado na análise de pigmentos em estudos de microfitobentos (Cartaxana & Brotas, 2003; Brotas & Plante-Cuny, 2003; Cartaxana et al., 2003). Por sua vez, a metodologia usada por Zapata et al. (2000), onde se utiliza uma coluna C8 e cujo procedimento é optimizado com a introdução, na fase

móvel, de uma solução aquosa de piridina tem sido utilizado, frequentemente, em amostras de fitoplâncton e em culturas (Zapata et al., 2000; Rodriguez et al., 2002; Zapata et al., 2004).

MATERIAL E MÉTODOS

Para a análise de HPLC foram usados standards comerciais, amostras de microfitobentos, de fitoplâncton e uma cultura de Cylindroteca closterium. O aparelho utilizado foi um HPLC Shimadzu que inclui um módulo distribuidor de solventes (LC-10ADVP) com um sistema de controlo (SCL-10AVP), um detector de fotodiodos (SPD-M10AVP) e um detector de fluorescência (RF-10AXL). A separação cromatográfica dos pigmentos foi efectuada com dois tipos de colunas, cujas características se encontram na tabela 3.1. Nesta tabela encontra-se, também, a constituição da fase móvel (solventes utilizados em cada metodologia). Os gradientes de solventes utilizados na coluna C18 e C8 encontram-se, respectivamente, na tabela 3.2 e 3.3.

Standards comerciais

Os standards usados serviram para comparar as duas metodologias em estudo neste trabalho, para efectuar a calibração dos métodos e para proceder à identificação e quantificação dos pigmentos analisados. Os standards utilizados foram clorofila a, clorofila b e β-caroteno da Sigma e clorofilide a, clorofila c2, clorofila c3, fucoxantina,

feoforbide a, diadinoxantina, anteraxantina, diatoxantina, luteina, zeaxantina, neoxantina, violaxantina e feofitina a da DHI. De forma a optimizar a forma dos picos no cromatograma, a injecção dos standards efectuou-se com a adição de 10% de água (HPLC-grade). Em alguns pigmentos de maior polaridade, como a clorofila c2, a

Tabela 3.1: Características dos dois métodos utilizados neste trabalho, incluindo a composição da fracção móvel (solventes) e da fase estacionária (tipo de coluna).

Tipo de coluna Fracção móvel (solventes) Tempo de

eluição Fluxo Coluna C18 (Supelcosil, 250×4,6 mm, 5 µm de tamanho das partículas e 100Å de tamanho de poro). Octadecilsílica A – 0,5 M de acetato de amónio em metanol e água (85:15, v/v). B – Acetonitrilo e água (90:10, v/v). C – 100% de acetato de etilo. 35 min 0,6 ml min-1

Coluna C8 (Waters Symmetry,

150×4,6 mm, 3,5 µm de tamanho das partículas e 100Å

de tamanho de poro). Octilsílica

A – Metanol, acetonitrilo e solução

aquosa de 0,25 M piridina com pH ajustado a 5,0 utilizando ácido

acético (50:25:25).

B – Metanol, acetonitrilo e acetona

(20:60:20).

40 min 1 ml min-1

Tabela 3.2: Gradiente da fase móvel (solventes) usado com o método da coluna C18. Os solventes são os

descritos na tabela 3.1.

Solventes

Tempo (min) A (%) B (%) C (%) Tipo de gradiente

0 60 40 0 Injecção 2 0 100 0 Linear 7 0 80 20 Linear 17 0 50 50 Linear 21 0 30 70 Linear 28.5 0 30 70 Linear 29.5 0 100 0 Linear 30.5 60 40 0 Linear 35 60 40 0 STOP

Tabela 3.3: Gradiente da fase móvel (solventes) usado com o método da coluna C8. Os solventes são os

descritos na tabela 3.1.

Solventes

Tempo (min) A (%) B (%) Tipo de gradiente

0 100 0 Injecção

20 60 40 Linear

26 5 95 Linear

38 5 95 Linear

Amostras de fitoplâncton

As amostras de fitoplâncton foram recolhidas em Outubro de 2004, em mar aberto, ao largo da Figueira da Foz. Para tal, foram recolhidos 5 litros de água superficial que foram guardados num recipiente protegido da luz. À chegada ao laboratório procedeu-se à filtração da amostra utilizando um filtro GF/F (0,7 µm de poro e 47 mm de diâmetro). O filtro foi imediatamente congelado a -80ºC. A extracção efectuou-se com 3 ml de metanol tamponizado (com 2% de acetato de amónio), macerou-se o filtro com uma vareta de vidro, submeteu-se aos ultra-sons durante 30 segundos e deixou-se a extrair durante 20 minutos a -20ºC. De seguida centrifugou-se a 2500 rpm, durante 5 minutos, a 4ºC. Retirou-se o sobrenadante e antes de se proceder à injecção no HPLC, filtrou-se usando filtros de membrana Whatman (0,2 µm de poro). No caso da coluna C8, aos

extractos a injectar no HPLC, foi adicionado 10% de água, tal como descrito por Zapata et al. (2000).

Amostras de microfitobentos

As amostras de microfitobentos foram recolhidas no Estuário do Tejo (38º44’N, 09º09’W), em dois locais com características sedimentares diferentes. Um dos locais de amostragem era dominado por sedimentos arenosos e o outro por sedimentos vasosos. A amostragem foi realizada usando o “contact corer” (Honeywill et al., 2002). Desta forma, obteve-se um disco de sedimento com espessura de 2mm, que foi rapidamente congelado pela acção do azoto líquido. À chegada ao laboratório, as amostras foram liofilizadas durante 48 horas e armazenadas a -80ºC (livro de protocolos do HIMOM, 2005). Para análise de HPLC foram usadas sub-amostras de aproximadamente 0,2 g de sedimento liofilizado. A extracção dos pigmentos efectuou-se usando 2 ml de metanol tamponizado (com 2% de acetato de amómio) durante 15 minutos a -20ºC, no escuro. No início da extracção as amostras foram sujeitas a um período de 30 segundos de ultra-sons. Os extractos obtidos foram filtrados (filtros de membrana Whatman de 0,2 µm de poro), imediatamente antes da análise de HPLC. No caso da coluna C8, aos extractos a

Amostra de células de euglenófitas

Para o caso da amostra de euglenófitas, foi recolhida uma camada superficial (primeiros milímetros) de sedimento arenoso com uma típica coloração verde-claro, colocou-se num recipiente e transportou-se para o laboratório. À chegada ao laboratório, as células de euglenófitas foram ressuspendidas usando água do local de amostragem, previamente filtrada. Desta forma, as microalgas, que por verificação microscópica eram na sua maioria euglenófitas, ficaram em suspensão na água. Esta foi filtrada por um filtro GF/F (0,7 µm de poro e 47 mm de diâmetro) e imediatamente congelada a -80ºC. Para se efectuar a extracção, adicionou-se 5 ml de metanol tamponizado (com 2% acetato de amónio), macerou-se com uma vareta de vidro, submeteu-se a um banho de ultra-sons durante 30 segundos e deixou-se a extrair, durante 20 minutos, a -20ºC. De seguida, centrifugou-se a 2500 rpm, durante 5 minutos, a 4ºC. Retirou-se o sobrenadante e antes de se proceder à injecção no HPLC, filtrou-se usando filtros de membrana Whatman (0,2 µm de poro). No caso da coluna C8, aos extractos a injectar no HPLC, foi

adicionado 10% de água, tal como descrito por Zapata et al. (2000).

Cultura de Cylindroteca closterium

A Cylindroteca closterium é uma diatomácea comum tanto no microfitobentos como no fitoplâncton costeiro. O meio de cultura utilizado para o crescimento das microalgas foi o f/2 enriquecido (Guillard & Ryther, 1962), com uma salinidade de 28. A cultura encontrava-se acondicionada com um fotoperíodo de 14:10 (14 horas de luz e 10 de escuro), a uma temperatura de 16±1ºC e com uma radiação luminosa de aproximadamente 50 µmol fotões m-2 s-1. Para a análise de HPLC foram usados aproximadamente 50 ml de cultura. Este volume foi filtrado, utilizando um filtro GF/F (0,7 µm de poro) que foi imediatamente guardado a -80ºC. A extracção efectuou-se como descrito anteriormente para as amostras de fitoplâncton.

RESULTADOS

Os dois factores a ter em conta na comparação das duas metodologias são os tempos de retenção e os valores de absorvância máxima. Com a utilização dos standards, a coluna

C18 apresentou um problema nos tempos de retenção devido à proximidade dos

seguintes pares de pigmentos: 19’-hexanoyloxifucoxantina com a neoxantina, divinyl clorofila a com a clorofila a e a feofitina a com o β-caroteno (Tabela 3.4). A coluna C8

apresentou o mesmo problema mas entre os seguintes pares de pigmentos: violaxantina com a 19’-hexanoyloxifucoxantina, luteina com a zeaxantina e a divynil clorofila a com a clorofila a (Tabela 3.4). A proximidade nos tempos de retenção pode ser problemática, pois existe a possibilidade de pigmentos com tempos de retenção próximos co-eluirem. As diferenças nos máximos de absorvância, entre os dois métodos, não foram muito acentuadas registando-se apenas pequenas alterações, como foi o caso das clorofilas c3,

c2 e b, em que os máximos de absorvância foram mais elevados na coluna C8 (Tabela

3.4).

Tabela 3.4: Lista dos standards de pigmentos utilizados, seus respectivos tempos médios de retenção e valores máximos de absorvância, nas colunas C18 e C8.

Tempo de retenção (min) γγγγmax (nm)

Número _Pigmento Coluna C18 Coluna C8 Coluna C18 Coluna C8

1 Clorofila c3 7,58 7,30 454, 586 458, 591 2 Clorofilide a 7,91 9,88 431, 665 429, 664 3 Clorofila c2 8,69 10,68 445, 581, 630 452, 584, 633 4 Peridinina 10,48 13,77 475 475 5 19’-Butanoyloxifucoxantina 11,26 17,31 445, 470 447, 469 6 Fucoxantina 11,80 18,18 448, 465 450, 464 7 19’-Hexanoyloxifucoxantina 12,76 20,91 445, 470 447, 469 8 Neoxantina 12,71 19,10 414, 438, 466 414, 437, 466 9 Prasinoxantina 13,51 19,67 454 455 10 Violaxantina 14,23 20,54 417, 441, 471 417, 440, 470 11 Diadinoxantina 15,45 23,06 424, 448, 477 424, 446, 476 12 Anteraxantina 16,53 24,13 424, 448, 476 423, 446, 475 13 Aloxantina 16,84 24,85 429, 454, 483 429, 453, 482 14 Diatoxantina 17,77 25,51 430, 454, 482 428, 453, 481 15 Luteina 18,24 26,21 425, 447, 475 425, 447, 475 16 Zeaxantina 18,71 26,04 430, 454, 481 428, 453, 479 17 Feoforbide a 19,86 15,93 410, 506, 536, 609, 666 409, 507, 536, 608, 665 18 Clorofila b 22,97 30,20 457, 596, 646 462, 599, 648 19 Divinyl Clorofila a 24,84 31,55 438, 616, 663 440, 618, 664 20 Clorofila a 25,00 31,72 430, 617, 663 431, 617, 663 21 Feofitina a 27,83 33,84 409, 505, 535, 608, 666 409, 506, 535, 608, 665 22 β-Caroteno 28,02 34,77 430, 454, 481 429, 454, 480

Na análise das amostras de fitoplâncton, microfitobentos, euglenófitas e Cylindroteca

closterium, registaram-se algumas diferenças entre as duas metodologias utilizadas

(Tabela 3.5). A principal diferença foi a co-eluição das clorofilas c1 e c2 por parte da

coluna C18, comparativamente à eficiente separação destes pigmentos por parte da

coluna C8 (Figura 3.1, 3.2, 3.3 e 3.5). Por outro lado, nas amostras de microfitobentos, a

coluna C18 foi capaz de separar os pigmentos característicos do sedimento

(fucoxantinol, neofucoxantina, diadinocromo e um carotenoide não identificado), o mesmo não acontecendo com a C8 (Figura 3.2 e 3.3). Outro aspecto relevante na análise

dos cromatogramas é a menor resolução (ver escalas dos cromatogramas) da coluna C8

na separação dos pigmentos e produtos de degradação. Desta forma, com a coluna C8

não se conseguiu identificar o clorofilide a da amostra de vasa (Figura 3.2b) por este se encontrar em concentrações reduzidas. Com a coluna C18 foi relativamente fácil a sua

identificação (Figura 3.2a).

Tabela 3.5: Diferenças registadas nos cromatogramas das amostras analisadas com o método da coluna C18 e C8.

Diferenças registadas

Tipo de amostra Coluna C18 Coluna C8

Fitoplâncton (Figura 3.1)

- Co-eluição das clorofilas c. - Não identificação da neoxantina.

- Separação das clorofilas c. - Co-eluição da violaxantina com a 19-hexanoyloxifucoxantina. - Co-eluição da prasinoxantina com um pigmento não identificado.

Microfitobentos (Vasa) (Figura 3.2)

- Co-eluição das clorofilas c. - Identificação do clorofilide a. - Separação eficiente de todos os carotenoides.

- Separação das clorofilas c. - Não identificação do clorofilide a. - Co-eluição da diatoxantina com um carotenoide não identificado. - Co-eluição do fucoxantinol com a clorofila c1.

Microfitobentos (Areia) (Figura 3.3)

- Co-eluição das clorofilas c. - Separação eficiente de todos os caretonoides.

- Separação das clorofilas c. - Co-eluição da diatoxantina com um carotenoide não identificado; Células de euglenófitas

(Figura 3.4)

- Separação eficiente de todos os pigmentos.

- Co-eluição da diatoxantina com um carotenoide não identificado. Cultura de Cylindroteca

closterium

(Figura 3.5)

- Co-eluição das clorofilas c. - Separação eficiente de todos os carotenoides.

- Separação eficiente de todos os pigmentos.

Minutos 0 10 20 30 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) 0 5 0 1 0 0 0 50 100 1 5 6 7 910 11 13 14 15 16 ₁₈ 20 4 Coluna C18 Fitoplâncton C hl c1 + c2 Minutos 0 10 20 30 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) 0 5 0 1 0 0 0 50 100 1 5 6 7 910 11 13 14 15 16 ₁₈ 20 4 Coluna C18 Fitoplâncton C hl c1 + c2 Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 2 0 4 0 0 20 40 1 C hl c2 C hl c1 4 5 6 8 9 10 7 11 13 14 ₁₆ 15 18 20 Coluna C₈ Fitoplâncton Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 2 0 4 0 0 20 40 1 C hl c2 C hl c1 4 5 6 8 9 10 7 11 13 14 ₁₆ 15 18 20 Coluna C₈ Fitoplâncton

Figura 3.1: Cromatogramas referentes a uma amostra de fitoplâncton utilizando uma coluna C18 (a) e uma coluna C8 (b). Os números correspondem aos pigmentos da tabela 3.4.

b)

a)

Minutos 0 10 20 30 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) 0 1 0 0 2 0 0 0 100 200 2 6 11 12 14₁₅ 20 22 16 18 Coluna C₁₈ VASA a b c d C hl c1 + c2 Minutos 0 10 20 30 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) 0 1 0 0 2 0 0 0 100 200 2 6 11 12 14₁₅ 20 22 16 18 Coluna C₁₈ VASA a b c d C hl c1 + c2 Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 50 100 150 C hl c2 C hl c1 6 11 14 b 16 15 18 20 22 Coluna C₈ VASA c d Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 50 100 150 C hl c2 C hl c1 6 11 14 b 16 15 18 20 22 Coluna C₈ VASA c d

Figura 3.2: Cromatogramas referentes a uma amostra de sedimento vasoso utilizando uma coluna C18 (a) e uma coluna C8 (b). Os números correspondem aos pigmentos da tabela 3.4. As letras são pigmentos que não se encontram na tabela: a = fucoxantinol; b = neofucoxantina; c = diadinocromo; d = carotenoide não identificado.

b)

a)

Minutos 0 10 20 30 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 100 200 300 C hl c1 + c2 6 11 14 16 20 22 b d Coluna C₁₈ AREIA A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Minutos 0 10 20 30 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 100 200 300 C hl c1 + c2 6 11 14 16 20 22 b d Coluna C₁₈ AREIA A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) 0 5 0 1 0 0 0 50 100 C hl c2 C hl c1 6 11 ₁₄ 16 20 22 b d Coluna C8 AREIA Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) 0 5 0 1 0 0 0 50 100 C hl c2 C hl c1 6 11 ₁₄ 16 20 22 b d Coluna C8 AREIA

Figura 3.3: Cromatogramas referentes a uma amostra de sedimento arenoso utilizando uma coluna C18 (a) e uma coluna C8 (b). Os números correspondem aos pigmentos da tabela 3.4. As letras são pigmentos que não se encontram na tabela: b = neofucoxantina;

d = carotenoide não identificado.

a)

Minutos 0 10 20 30 0 1 0 0 2 0 0 0 100 200 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Coluna C18 Euglenófitas 2 8 11 14 18 20 22 d e Minutos 0 10 20 30 0 1 0 0 2 0 0 0 100 200 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Coluna C18 Euglenófitas 2 8 11 14 18 20 22 d e Minutos 0 10 20 30 40 0 5 0 1 0 0 0 50 100 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Coluna C8 Euglenófitas 2 8 11 14 18 20 22 d e Minutos 0 10 20 30 40 0 5 0 1 0 0 0 50 100 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Coluna C8 Euglenófitas 2 8 11 14 18 20 22 d e

Figura 3.4: Cromatogramas referentes a uma amostra de células de euglenófitas utilizando uma coluna C18 (a) e uma coluna C8 (b). Os números correspondem aos pigmentos da tabela 3.4. As letras são pigmentos que não se encontram na tabela: d = carotenoide não identificado;

e = sifoneina.

a)

Minutos 0 10 20 30 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 100 200 300 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Coluna C18 Cylindroteca closterium 2 6 b 11 d 14 20 C hl c1 + c2 Minutos 0 10 20 30 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 100 200 300 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Coluna C18 Cylindroteca closterium 2 6 b 11 d 14 20 C hl c1 + c2 Minutos 0 10 20 30 40 0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 50 100 150 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Coluna C₈ Cylindroteca closterium C hl c2 C hl c1 6 11 14 20 b 2 Minutos 0 10 20 30 40 0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 50 100 150 A bs or vâ nc ia ( 44 0 nm ) Coluna C₈ Cylindroteca closterium C hl c2 C hl c1 6 11 14 20 b 2

Figura 3.5: Cromatogramas referentes a uma amostra de cultura de Cylindroteca

closterium utilizando uma coluna C18 (a) e uma coluna C8 (b). Os números

correspondem aos pigmentos da tabela 3.4. As letras são pigmentos que não se encontram na tabela: b = neofucoxantina; d = carotenoide não identificado.

b)

a)

A figura 3.6 ilustra um problema detectado ao analisar as amostras no HPLC. Ao correr uma amostra de areia dominada por euglenófitas (com sifoneina e clorofila b) seguida de uma cultura de Cylindroteca closterium (sem clorofila b, nem sifoneina) verificou-se que com a coluna C8, nesta última corrida, apareciam os pigmentos característicos das

euglenófitas, apesar de se estar a analisar uma diatomácea. Este problema não se verificou com a coluna C18.

Minutos 0 10 20 30 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 100 200 300 Coluna C18 Euglenófitas C lo ro fi la b S if on ei na 8 11 14 20 22 Minutos 0 10 20 30 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 100 200 300 Coluna C18 Euglenófitas C lo ro fi la b S if on ei na 8 11 14 20 22 A1 Minutos 0 10 20 30 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 100 200 300 Coluna C18 Cylindroteca C hl c1 + c2 6 11 14 20 Minutos 0 10 20 30 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 0 100 200 300 Coluna C18 Cylindroteca C hl c1 + c2 6 11 14 20 A2 Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 5 0 1 0 0 0 50 100 Coluna C8 Euglenófitas C lo ro fi la b S if on ei na 8 11 14 20 22 Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 5 0 1 0 0 0 50 100 Coluna C8 Euglenófitas C lo ro fi la b S if on ei na 8 11 14 20 22 B1 Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 50 100 150 Coluna C8 Cylindroteca C hl c2 C hl c1 6 11 14 20 S if on ei na C lo ro fi la b Minutos 0 10 20 30 40 A bs or vâ nc ia (4 40 n m ) 0 5 0 1 0 0 1 5 0 0 50 100 150 Coluna C8 Cylindroteca C hl c2 C hl c1 6 11 14 20 S if on ei na C lo ro fi la b B2

Figura 3.6: Cromatogramas referentes a uma amostra de sedimento dominado por euglenófitas (A1 e B1) e de uma cultura de Cylindroteca closterium (A2 e B2). Os cromatogramas A1 e A2 foram obtidos pelo método da coluna C18 e as respectivas amostras foram passadas no HPLC seguidas uma à outra (A1 → A2). Os cromatogramas B1 e B2 foram obtidos pelo método da coluna C8 e as respectivas amostras passadas no HPLC de uma forma consecutiva (B1 → B2).