2.1 ÁREA DE ESTUDO E COLETA DO MATERIAL BOTÂNICO
Frutos de L. cultratus foram coletados em agosto de 2016, em 10 matrizes localizadas nas áreas adjacentes ao Rio Paraná, no município de Porto Rico, Paraná, Brasil, nos limites aproximados de 22º 40’ a 22º 55’S e 53º 10’ a 53º 40’W (Romagnolo & Souza, 2006).
Diferentes tipos de formações vegetais ripárias podem ser encontrados ao longo da área de estudo, tais como Floresta Estacional Semidecidual Submontana, Floresta Estacional Semidecidual Aluvial e formações de campo representadas pelas várzeas e áreas antropizadas (Campos & Souza, 1997). O clima da região é um tipo de Cfa, de acordo com a classificação climática de Köppen, e é caracterizado como subtropical, úmido e mesotérmico, com verões quentes e precipitação média anual de 1.500 mm (Almeida et al., 2016). Os frutos foram levados ao Laboratório de Ecofisiologia Vegetal da Universidade Estadual de Maringá, onde foram processados para a obtenção das sementes.
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2.2 TESTE DE GERMINAÇÃO
Para avaliação da germinação, as sementes foram desinfestadas por 10 minutos com hipoclorito de sódio comercial diluída em água na proporção de 1:3. As sementes foram divididas em dois tratamentos: sementes-controle, colocadas em caixas gerbox contendo dois discos de papel filtro umedecidos com água destilada, e sementes totalmente submersas, mantidas em caixas gerbox contendo areia previamente esterilizada, com água à 2 cm acima do nível do substrato. Para cada tratamento utilizou-se 100 sementes distribuídas em 10 caixas gerbox. As caixas gerbox foram mantidas em câmara de germinação, sob 25ºC e fotoperíodo de 12h. A avaliação da germinação foi realizada diariamente, sendo consideradas sementes germinadas, as que apresentaram protrusão da raiz primária.
Os parâmetros de germinação analisados foram: porcentagem de germinação (PG), índice de velocidade de germinação (IVG) e o tempo médio de germinação (TMG), de acordo com Ferreira & Borghetti (2004).
2.3 ENSAIO EM VASOS
Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação entre os meses de dezembro de 2016 a abril de 2017 no jardim didático do Departamento de Biologia (DBI) da Universidade Estadual de Maringá (UEM). As sementes foram semeadas em sacos plásticos pretos com medidas de 18 cm de largura por 30 cm de comprimento, contendo substrato constituído da mistura de areia com substrato comercial orgânico Provaso®, na proporção 2:1. Foram realizadas análises químicas e granulométricas do substrato do local de ocorrência e de coleta dos frutos, pelo Laboratório de Análise de Solos da Universidade Estadual de Maringá. Os valores obtidos destas análises foram utilizados para reprodução aproximada, da composição química e granulométrica, do substrato utilizado no ensaio em vasos.
Após 30 dias da emergência das plantas em casa de vegetação, os vasos foram submetidos aos seguintes tratamentos hídricos: grupo-controle que consistiu de vasos em capacidade de campo, com irrigação diária, e vasos que foram colocados em caixas plásticas de 60 e 90 litros contendo água. Estes foram submetidos a duas profundidades: alagado ao nível do substrato (AL), e total submersão (TS). Em cada caixa plástica foram colocadas 5 plantas, utilizando para cada tratamento 20 caixas plásticas, totalizando 100 plantas por tratamento.
Aos 30 DATH, 20 vasos do tratamento AL e 20 vasos do tratamento TS foram retirados das condições de alagamento e total submersão, e foram recolocados sob capacidade de campo para posterior avaliação, sendo denominadas de plantas de pós-alagamento (PA) e
pós-submersão (PS). Esses vasos foram distribuídos aleatoriamente na casa de vegetação do jardim didático.
2.4 AVALIAÇÃO MORFOANATÔMICA
As avaliações morfológicas consistiram em observações semanais, não sendo necessária para isso a retirada da planta do vaso. As avaliações anatômicas foram realizadas aos 30 e aos 60 dias após o início do tratamento hídrico (DATH), onde foram retiradas 20 plantas de cada tratamento (AL, CT e TS). As avaliações das plantas PA e PS foram realizadas 30 dias após a recolocação em capacidade de campo.
Para a avaliação anatômica foram coletados segmentos do sistema subterrâneo principal localizados a dois centímetros abaixo da região do coleto. Na análise anatômica foliar foram coletados segmentos da região mediana do primeiro eofilo da planta jovem. Os segmentos foliares e do sistema subterrâneo, já submetidos à desidratação em série alcoólica etílica e incluídos em historresina Leica, conforme orientações especificadas no produto, foram secionados transversalmente em micrótomo de rotação. As seções assim obtidas foram coradas com azul de toluidina (O’Brien et al, 1964). Para a detecção de amido, utilizou-se Lugol (Berlyn & Miksche, 1976). As fotografias foram feitas em microscópio de luz Leica EZ4D com câmera digital e, posteriormente, processadas usando o software Leica Application Suite version 1.8. A partir das imagens obtidas foram realizadas as medidas descritas abaixo, através do uso do software Image-Pro® Plus 4.5 image analysis software (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA).
Nos sistemas subterrâneos, foram realizadas as seguintes medidas do eixo principal do sistema: diâmetro total, diâmetro da medula e espessura radial do xilema (xilemas primário + secundário) (μm). Nas folhas foram realizadas as seguintes medidas: espessura da epiderme das faces adaxial e abaxial (μm), espessura do parênquima paliçádico e lacunoso (μm), espessura do mesofilo e espessura do limbo (μm). Para a obtenção destas medidas foram mensurados cortes transversais de 10 indivíduos de cada tratamento. Para a obtenção da eletromicrografia de varredura, segmentos foliares foram fixados em glutaraldeído por 48 horas, desidratados em série alcoólica crescente, submetidos à secagem ao ponto crítico, recobertos com uma película de ouro e montados em stubs. O material foi processado e fotografado na central de microscopia eletrônica (CMI), localizado no Complexo de Centrais de Apoio à Pesquisa (COMCAP) da Universidade Estadual de Maringá.
Para a avaliação da área foliar específica (AFE), foram utilizadas 10 plantas de cada tratamento, das quais foram obtidos os valores de área foliar e massa seca. Para a análise da
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área foliar as folhas completamente expandidas de cada indivíduo foram digitalizadas em scanner, e os valores de área foliar foram obtidos através do uso do software Image-Pro® Plus 4.5 image analysis software (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Para obtenção da massa seca, as folhas previamente escaneadas foram submetidas à secagem em estufa a 60°C durante 48h. As determinações da massa seca foram obtidas em balança analítica de precisão, modelo MARK/M214Ai. A área foliar específica (AFE) foi determinada a partir da razão entre os valores da área foliar expressos em cm2 e a massa seca das folhas expressos em gramas.
2.5 ANÁLISE DOS DADOS
As análises foram realizadas comparando-se as médias dos resultados obtidos nas avaliações quantitativas dos parâmetros germinativos e anatômicas avaliados entre os três tratamentos, e entre as duas épocas de coleta. Para isto foi utilizada a análise de variância ANOVA two-way. Também foi realizada análise de variância ANOVA one-way, onde foram consideradas somente as datas de avaliação (entre AL e PA, e TS e PS). Foram considerados significativos os atributos analisados que obtiverem p<0,05. Foi utilizado o teste de Fisher para comparações a posteriori. Para realização da ANOVA foram testados os pressupostos de independência (no delineamento experimental), de normalidade, com um teste de Shapiro-Wilk, e homocedasticidade utilizando o teste de Levene. Quando os parâmetros avaliados não alcançaram os pressupostos da análise, foi utilizada uma análise não paramétrica correspondente (Kruskal-Wallis). A comparação das médias dos parâmetros de germinação foi realizada utilizando-se teste T (n≤20). Estas análises foram realizadas com o auxílio do pacote estatístico Statistica versão 7.1.