Descrição Detalhada do Subprojeto
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos serão realizados na Fazenda Experimental de São Gonçalo dos Campos, pertencente à Escola de Medicina Veterinária da UFBA, e serão executados em três etapas seqüenciais, sendo a primeira etapa conduzida nos anos de 2012/2013; a segunda nos anos de 2013/2014 e a terceira
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nos anos de 2014/2015, quando serão feitas as avaliações de utilização da torta de dendê (Elaeais
guineensis), de amendoim (Arachis hypogaea) e de girassol (Helianthus annuus), respectivamente.
Em cada etapa serão utilizadas 8 vacas mestiças (Holandesas x Zebu), com peso médio de 500 kg, entre o 60º e o 90º dia de lactação e produção média de 15 kg de leite/dia. A área do experimento será de 8 ha, formados de Panicum maximum cv. Tanzânia, divididos em 10 piquetes de 0,8 ha, delimitados por fios eletrificados, com cochos e bebedouros. Cada experimento constará de 4 períodos experimentais de 21 dias, sendo os 15 primeiros dias de adaptação e os 6 finais de coletas. As vacas serão distribuídas em quatro quadrados latinos 4x4 (4 tratamentos; 4 períodos e 4 animais por tratamento). Os tratamentos consistirão na suplementação com rações contendo 0; 25; 50; e 75% de inclusão das respectivas tortas na MS do concentrado, e as dietas experimentais serão formuladas segundo o NRC (2001). O volumoso será o pasto de Panicum maximum cv. Tanzânia e os ingredientes dos concentrados serão: farelo de milho, farelo de soja, uréia e as tortas nos respectivos níveis propostos. Pretende-se que as dietas contenham teores semelhantes de nitrogênio (15,6% de PB) e de energia (77% de nutrientes digestíveis totais).
Cada animal receberá 3 kg de suplemento concentrado por dia, em duas refeições diárias (6 e 16 h), logo após as ordenhas da manhã e da tarde. O consumo do suplemento e as sobras, caso hajam, serão diariamente controlados. Água será fornecida à vontade.
A pastagem será manejada em sistema rotacionado, com 3 dias de ocupação e 27 dias de descanso, com oferta de forragem de 8% do peso vivo (PV) em lâminas verdes, por meio do sistema put and take. Serão reservados 3 ha para os animais reguladores. Para garantir a oferta de forragem pretendida será feito um acompanhamento da disponibilidade da pastagem. Para isto, um dia antes da entrada dos animais nos piquetes, quadrados de 0,5 m (Haydock e Shaw, 1975) serão lançados em pontos aleatórios e a forragem cortada ao nível do solo, então separada no laboratório em lâmina/bainha, colmo e material senescente. Este material será seco em estufa de ventilação forçada e feitas amostragens para determinação do teor de MS, e, conseqüentemente, do seu rendimento para ajuste da pressão de pastejo. Assim, na pastagem serão avaliadas: a disponibilidade de MS e a relação folha/colmo da forrageira e a composição química- bromatológica.
Para calcular o peso vivo total dos animais que deverão pastejar a forragem do piquete, segundo a oferta pretendida, aplicar-se-á a equação proposta por Paladines et al. (1982). A composição da forragem ingerida pelos animais será determinada na extrusa. Para tanto, serão utilizados três animais canulados no esôfago, aos quais, após jejum prévio, serão adaptadas bolsas coletoras da extrusa. A coleta será feita no período da manhã, durante 6 dias (45 minutos/dia).
Nas amostras compostas do pasto (extrusa), dos alimentos concentrados, suplementos e nas tortas serão determinados os teores de matéria seca (MS), matéria orgânica (MO), cinzas, extrato etéreo (EE) e nitrogênio total (N), conforme as técnicas descritas por Silva e Queiroz (2002), sendo que o teor de proteína bruta (PB) será obtido multiplicando-se o teor de N pelo fator 6,25. Os teores de fibra em detergente neutro (FDN), ácido (FDA), e lignina em detergente ácido (LDA) serão determinados conforme Van Soest et al. (1991). Os teores de nitrogênio insolúvel em detergente neutro (NIDN) e ácido (NIDA) seguindo-se a
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metodologia de Licitra et al. (1996). Os carboidratos totais (CT) serão obtidos pela equação de Sniffen et al. (1992) e os teores de carboidratos não fibrosos (CNF), pela expressão proposta no NRC, (2001).
A estimativa do consumo será realizada conforme a equação: CMS (kg/dia) = {[(PF x CIF) IS]/CIFO} + CMSS, sendo: CMS = consumo de matéria seca (kg/dia); PF = produção fecal (kg/dia); CIF = concentração do indicador nas fezes (kg/kg de MS); IS = indicador presente no suplemento (kg/dia); CIFO = concentração do indicador na forragem (kg/kg de MS); CMSS = consumo de matéria seca do suplemento (kg/dia). A estimativa da PF será feita, aplicando 10 g de óxido crômico, divididas em duas aplicações diárias,(8:00 e 16:00 hora), por 12 dias (7 de adaptação e 5 de coleta). As fezes serão retiradas diretamente no reto, do 8º ao 12º dia, concomitantemente ao fornecimento do indicador (Hopper et al., 1978). As amostras serão acondicionadas em sacolas plásticas identificadas e congeladas a -10ºC. Após a secagem (65º C), as amostras serão moídas (1 mm), compostas por animal, tratamento e período, e analisadas quanto ao teor de Cr. Para determinação da PF, será utilizada a fórmula: Produção fecal (kg/dia) = (Cr fornecido (g/dia)/Cr fezes (g/kg de MS)).
Como indicador interno será utilizada a fibra em detergente neutro indigestível (FDNi). Para a determinação do indicador serão tomadas aproximadamente 0,5 g das amostras de extrusa, alimentos concentrados, sobras e fezes, com granulometria igual a 2 mm, as quais serão incubadas em sacos de TNT, com porosidade específica, no rúmen dos animais que serão usados para avaliação da dinâmica do nutriente no trato digestivo, conforme abaixo, ao final de todo o experimento, por um período de 144 horas, segundo adaptação da técnica descrita por Cochran et al. (1986). Após a incubação, o material remanescente será submetido à análise de FDNi para sua utilização na estimativa do consumo e digestibilidade dos nutrientes. O consumo de suplemento será determinado pela diferença entre o oferecido e sobra.
A estimativa de consumo de nutrientes digestíveis totais (CNDT) será obtida, para cada animal por período, a partir da diferença entre o ingerido e o recuperado nas fezes de cada nutriente, com base na MS, conforme a equação de Sniffen et al. (1992). Para estimar a digestibilidade da MS, será utilizada concentração de FDNi, como indicador interno, de acordo com a fórmula: D(%) = 100 [100 x (FDNID/FDNIF)], sendo D = coeficiente de digestibilidade da matéria seca; FDNID = a concentração de FDNi na dieta; e FDNIF = a concentração de FDNi nas fezes.
As análises da composição química-bromatológica das amostras de alimentos, sobras e fezes serão realizadas conforme já descrito. O conteúdo de Cr nas amostras de fezes será determinado por espectrometria de absorção atômica (Williams et al., 1962).
A produção de leite será medida diariamente. Nos dois últimos dias de cada período experimental, a cada ordenha, serão obtidas amostras de 150 mL de leite de cada animal, acondicionadas em frascos contendo conservante Bronopol e refrigeradas para posteriores análises de composição e qualidade do leite. Ao final do período experimental as amostras de leite serão compostas por animal, tratamento e período. Nelas serão avaliados os teores de sólidos totais, proteína bruta, gordura e lactose, através de analisador infravermelho. A contagem de células somáticas será executada por um contador eletrônico (Somacount 500). Para a extração de gordura, as amostras de leite serão congeladas após a liofilização, e armazenadas
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em tubos lacrados e insuflados com N2. Após a metilação, o perfil de ácidos graxos será determinado através de cromatografia gasosa utilizando-se uma coluna capilar de sílica fundida, e detector de ionização de chama.
Os custos com alimentação serão determinados e descontados do preço pago pelo leite e determinados para cada tratamento de modo a determinar o tratamento mais eficiente do ponto de vista econômico.
Para determinar o balanço de nitrogênio e a síntese de compostos nitrogenados microbianos, proceder-se-á à coleta spot de urina às 4 horas após a alimentação, sob micção espontânea ou estimulada, no 17º dia de cada período experimental. Após a observação da micção, a urina será filtrada em gaze e homogeneizada. Em seguida, tomar-se-á uma alíquota de 10 mL, a qual será adicionada a um frasco contendo 40 mL de ácido sulfúrico (H2SO4) a 0,036 N, para evitar a destruição bacteriana dos derivados de
purinas e precipitação do ácido úrico, e armazenadas a -10ºC para análises posteriores.
Alíquotas das amostras de leite serão desproteinizadas com ácido tricloroacético (10 mL de leite serão misturados com 5 mL de ácido tricloroacético a 25%, filtrado em papel-filtro e armazenado a -20ºC), para a determinação de alantoína.
As análises de derivados de purina, alantoína (urina e leite) e ácido úrico (urina) serão feitas, aplicando-se o método colorimétrico, segundo Fujihara et al. (1987), citados por Chen & Gomes (1992). A excreção total de derivados de purinas será calculada pela soma das quantidades de alantoína e ácido úrico excretados na urina e da quantidade de alantoína secretada no leite, expressas em mmol/dia.
As purinas microbianas absorvidas (X, mmol/dia) serão calculadas a partir da excreção dos derivados de purina na urina (
Yˆ
, mmol/dia), por intermédio da equação:Yˆ
= 0,85X + 0,385 PV0,75, em que 0,85 é arecuperação das purinas absorvidas como derivados urinários de purinas e 0,385 PV0,75, a contribuição
endógena para a excreção de purinas (Verbic et al., 1990).
O fluxo de compostos nitrogenados microbianos (Nmic) (
Yˆ
, g Nmic/dia) será calculado em função das purinas microbianas absorvidas (X, mmol/dia), utilizando-se a equaçãoYˆ
= (70X) / (0,83 × 0,116 x 1000 × 1000), em que 70 representa o conteúdo de N nas purinas (mg N/mmol), 0,83 a digestibilidade das purinas microbianas e 0,116 a relação N-purina: N-total nas bactérias (Chen e Gomes, 1992).Simultaneamente à coleta de urina, realizar-se-á a obtenção de amostras de sangue diretamente da veia jugular, sendo o sangue acondicionado em tubos de ensaio contendo gel acelerador de coagulação. Em seguida, as amostras serão centrifugadas a 2500 RPM por 15 minutos e o plasmaarmazenado a -10ºC, para posteriores análises de uréia e creatinina. A uréia será determinada na urina, no plasma e no leite desproteinizado, e a creatinina na urina e no plasma, com a utilização de kits comerciais.
A partir da excreção média diária de creatinina, obtida Rennó et al. (2000) de 27,36 mg/kg de peso corporal por dia e da concentração de creatinina (mg/L) na amostra de urina spot, será estimado o volume urinário diário, através da equação: PC (kg) x excreção de creatinina (mg/kg PV) / Concentração de creatinina (mg/mL). O volume obtido então será utilizado para estimar a excreção diária de uréia de cada animal.
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A concentração de N na uréia sérica e no leite será obtida pelo teor de uréia no soro multiplicado por 0,466, correspondente ao teor de N na uréia. As excreções diárias de uréia serão obtidas por meio do produto entre as concentrações de uréia e o volume urinário estimado.
O balanço de nitrogênio, expresso em quantidades diárias de compostos nitrogenados, será calculado pela equação: N retido (g/dia) = N ingerido (g/dia) – N fecal (g/dia) – N urinário (g/dia) – N leite (g/dia). A eficiência alimentar será obtida dividindo-se a produção de leite (kg) pela quantidade de ração consumida (kg) durante o período de experimentação.
Para avaliar a dinâmica de digestão e passagem e os parâmetros ruminais provenientes das dietas contendo as tortas serão utilizados quatros bovinos machoscastrados, Holandês x Zebu, canulados no rúmen. Os animais serão distribuídos em quadrado latino 4 x 4 (quatro animais x quatro períodos x tratamentos). Cada período será composto por sete dias iniciais de adaptação às dietas e sete dias subseqüentes para as coletas necessárias como segue.
Para determinar a degradabilidade ruminal in situ da MS, PB e FDN dos alimentos que compõem a dieta, será utilizada a técnica do saco de náilon, proposta por Mehrez e Orskov (1977), obedecendo-se as recomendações propostas por Nocek (1988). Os sacos serão incubados no rúmen no 7º dia de cada período experimental, por 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72 e 96 horas (Mertens, 1993). A metodologia para determinação da MS, PB e FDN seguirá o procedimento já descrito.
A determinação da degradação da MS, PB e FDN serão feitas pela diferença entre as quantidades incubadas e os resíduos dessas frações, após cada tempo de incubação. Os dados obtidos para MS e PB serão ajustados ao modelo matemático proposto por Orskov e McDonald (1979). A degradabilidade da FDN e a degradabilidade efetiva (DE) no rúmen serão calculados conforme as respectivas equações propostas por Mertens e Loften (1980).
A taxa de passagem de fluidos pelo rúmen-retículo será determinada utilizando-se Co-EDTA, preparado pelo método descrito por Udén et al. (1980). O complexo Co-EDTA será fornecido em dose única de 5 g por animal-teste, diluído em 400 ml de água destilada e infundido em vários locais do rúmen, através da fístula, no 9º dia de cada período experimental, antes da alimentação. Serão obtidas amostras de 50 mL de fluido ruminal nos tempos 0 (imediatamente após o fornecimento Co-EDTA), 2, 4, 6, 8, 12, 16, 24, 30 e 36 horas pós-dosagem, de acordo com Colucci et al. (1990). As amostras serão filtradas em tecido duplo de algodão e conservadas a -10ºC. Depois de descongeladas, a temperatura ambiente, e decantadas, subamostras de 10 mL do líquido ruminal serão centrifugadas a 28.100×g por 15 minutos e submetidas à análise para determinação da concentração de cobalto em espectrofotômetro de absorção atômica com chama de acetileno, com comprimento de onda de λ = 240,7 nm e abertura de fenda de 0,2 mm, conforme Huhtanen e Kukkonen (1995).
Para determinação da taxa de passagem de fluidos, as curvas de concentração ruminal do cobalto serão ajustadas ao modelo exponencial unicompartimental, conforme Colucci et al. (1990) e os componentes da dinâmica da fase líquida serão calculados conforme Colucci et al. (1990).
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A taxa de passagem de partículas das tortas e do capim será estimada com o preparo do indicador Cr-mordante, fixado à parede celular do alimento, adaptando-se os procedimentos descritos por Udén et al. (1980). As amostras marcadas serão fornecidas aos animais 15 minutos antes da alimentação, via fístula ruminal, em dose única de 50, acondicionadas em cápsulas de papel, no 8º dia de cada período experimental.
A dosagem do Cr será realizada nas fezes, a partir de amostras coletadas nos tempos zero (imediatamente após a administração do alimento marcado), 4, 8, 12, 16, 24, 30, 36, 48, 72, 96, 120 e 144 horas. As amostras de fezes para determinação do Cr serão preparadas de acordo com as recomendações de Coleman et al. (1984), por intermédio do método descrito por Williams et al. (1962).
Para a determinação da taxa de passagem da fase sólida e do tempo de retenção de sólidos no rúmen e nos intestinos, proceder-se-á ao ajuste das curvas de excreção fecal dos indicadores ao modelo bicompartimental proposto por Matis (1972). Os cálculos da dinâmica da fase sólida serão realizados de acordo com Colucci et al. (1990).
No 9º dia de cada período experimental, amostras de líquido ruminal serão coletadas imediatamente antes, 2, 4, 6, 8 horas após o fornecimento da alimentação. As análises de pH serão feitas imediatamente após as coletas, utilizando-se pHgâmetro digital. Para determinação da concentração do nitrogênio amoniacal (N-NH3), amostras de aproximadamente 25 ml de líquido ruminal serão filtradas em gaze e
adicionadas em recipiente contendo 1 ml de ácido sulfúrico 1:1, que serão armazenados a -10°C para análises posteriores do teor de N-NH3. Após o descongelamento, as amostras serão destiladas com solução
de KOH 2N, seguindo os procedimentos de Silva e Queiroz (2002) para nitrogênio total. Parte do total de líquido ruminal coletado será utilizado para determinar a concentração dos ácidos graxos voláteis (acético, propiônico e butírico), conforme a metodologia descrita por Campos et al. (2004). Parte do total de líquido ruminal coletado, será utilizada para estimar a síntese de proteína microbiana conforme Lowry et al. (1951).
As análises estatísticas serão realizadas utilizando-se o Sistema para Análises Estatísticas e Genéticas (SAEG, 2007). As médias serão comparadas por meio do Teste de Tukey, adotando-se 0,05, como nível de significância.
METAS
Ao final de três anos de pesquisa pretende-se alcançar as metas a seguir:
• Formar três mestrandos e três doutorandos com conhecimentos aprofundados de utilização das tortas na alimentação de vacas leiteiras;
• Formar dois pós-doutores com excelência na área de nutrição e produção animal;
• Contribuir para a formação de dois bolsistas de iniciação tecnológica na área e seis bolsistas de iniciação científica;
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• Produzir 24 artigos em revistas e 48 resumos em congressos sobre o tema;
• Levar para pelo menos 200 produtores rurais, em dia de campo, informações sobre a utilização das tortas para vacas leiteiras;
• Produzir 2000 folhetos informativos sobre o tema;
• Produzir livros, brochuras e manuais sobre a utilização das tortas;
• Capacitar 20 técnicos extensionistas, por meio de palestras formativas, para transferência de tecnologia no campo.