Foram realizadas entrevistas com pesquisadores da área de etnobotânica, membros de comunidades tradicionais com conhecimento de usos de plantas medicinais e ervanários que comercializam produtos de origem vegetal nas cidades de Nova Xavantina e Cuiabá, no Estado de Mato Grosso. A escolha das espécies ocorreu a partir das indicações dessas fontes, mas principalmente pelas informações obtidas da medicina popular. Nestas entrevistas foram apontadas aproximadamente 20 espécies vegetais com potencial tônico com destaque para Heteropterys aphrodisiaca e Anemopaegma arvense, as duas espécies nativas do cerrado com o uso mais difundido e, portanto, selecionadas como de interesse para estudos morfométricos associados à espermatogênese.
As coletas de raízes de H. aphrodisiaca e A. arvense foram realizadas nos Cerrados de Nova Xavantina, identificadas por botânicos e amostras das espécies foram depositadas no Herbário VIC da Universidade Federal de Viçosa, e registradas com os números 21.300 e 31.880 para H. aphrodisiaca e A. arvense, respectivamente.
2.2. Preparo das infusões
As raízes de ambas as plantas foram secas em temperatura ambiente, protegidas da incidência direta da luz solar. Em seguida, foram trituradas e usadas para o preparo
das infusões. Para isto, frações de 12,5 e 25 g foram pesadas em balança digital, das quais foram preparadas infusões em 100 mL de água destilada em ponto de fervura, obtendo-se assim, duas concentrações de cada planta. As infusões permaneciam em repouso por um período de quatro horas, sendo posteriormente filtradas e armazenadas em geladeira, por até quatro dias como solução-estoque. Após este período, desprezavam-se os produtos excedentes sendo preparadas novas extrações.
Para o preparo das concentrações em forma de infusão, tanto de H. aphrodisiaca, quanto de A. arvense para os tratamentos ad libitum, foram utilizados 20 mL do extrato de menor concentração misturado a 80 mL de água, perfazendo 100 mL disponibilizados diariamente a cada animal.
O preparo dos extratos, tempo de armazenamento e dosagens foram estabelecidas e adaptadas a partir das indicações mencionadas pela medicina popular, obtidas por meio das entrevistas.
2.3. Animais e grupos experimentais
Os procedimentos experimentais envolvendo os animais seguiram estritamente os protocolos indicados pelas normas para o uso de animais em ensino, pesquisa e extensão, do Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa (2006). Foram utilizados 72 ratos Wistar machos albinos (Ratus rattus) em idade reprodutiva (100 dias), pesando entre 310 e 330g, provenientes do Biotério Central do CCBS da Universidade Federal de Viçosa, mantidos em condições controladas de temperatura (22º) e com fotoperíodo de 12 horas claro e escuro respectivamente. Os extratos foram administrados aos animais por dois métodos, gavagem e ad libitum. Os animais foram distribuídos da seguinte forma: grupo I - 12 animais, grupo II - 15 animais, grupo III - 15 animais, grupo IV - 10 animais, grupo V - 10 animais, grupo VI - 5 animais e grupo VII - 5 animais. Os animais foram alimentados com ração comercial e a água para os grupos tratados por meio de gavagem foram oferecidas livremente. Para os animais dos grupos VI e VII, tratados ad libitum e mantidos em gaiolas individuais, a água foi substituída pelas infusões.
2.4. Tratamentos
Sessenta e dois animais foram submetidos diariamente, durante 56 dias, à gavagem, sendo que os animais do grupo I (controle) (n = 12) receberam 0,5 mL/dia de solução salina; animais do grupo II (n = 15) receberam 0,5 mL/dia de infusão de A. arvense na concentração de 12,5 g/100 mL de água; animais do grupo III (n = 15) receberam 0,5 mL/dia de infusão H. aphrodisiaca na concentração de 12,5 g/100 mL de água (infusão A); animais do grupo IV (n = 10) receberam 0,5 mL/dia de infusão de A. arvense na concentração de 25 g/100 mL de água; animais do grupo V (n = 10) receberam 0,5 mL/dia de infusão de H. aphrodisiaca na concentração de 25 g/100 mL de água (infusão B).
Dez animais foram tratados pelo método ad libitum, sendo que, para os animais do grupo VI (n = 5) tratados com a infusão de A. arvense e grupo VII (n = 5) tratados com a infusão de H. aphrodisiaca foram disponibilizados 20 mL das infusões A, diluídas em 80 mL de água, totalizando 100 mL, que foram oferecidos diariamente a cada animal (infusão C). Após período de 24 horas a quantidade ingerida por cada animal era mensurada e uma nova dosagem disponibilizada.
2.5. Coleta e preparação histológica
Ao término do período experimental, os animais foram pesados e eutanasiados de acordo com as normas descritas na Resolução no 714, de 20 de junho de 2002, do Conselho Federal de Medicina Veterinária-CFMV, que dispõe sobre procedimentos e métodos de eutanásia em animais. Assim, os animais foram eutanasiados sob anestesia volátil. Em seguida, foram removidos os testículos, que foram pesados em balança de precisão (0,001 g).
Ambos os testículos foram fixados por imersão em solução de Karnovsky. Aleatoriamente, testículos direito ou esquerdo foram armazenados para posterior dissecação e pesagem da albugínea. Fragmentos do testículo contralateral foram submetidos à desidratação em concentrações crescentes de etanol (50º, 70º, 80º, 90º, 95º e 100º GL) por 40 minutos cada, sendo posteriormente incluídos em resina glicolmetacrilato Historesin® (Leica). Foram obtidas secções histológicas de 3µm de espessura em micrótomo rotativo (Reichert-Jung, Alemanha) equipado com navalha de vidro. As secções foram coradas com azul de toluidina-borato de sódio 1 % e analisadas
em microscópio Olympus AX-70. Imagens do parênquima testicular foram obtidas e analisadas por meio do programa Image Pro Plus associado ao microscópio Olympus AX-70, no Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Biologia Vegetal da Universidade Federal de Viçosa.
2.6. Mensuração dos componentes testiculares e estimativas das populações celulares
A proporção volumétrica (%) de cada elemento foi estimada por meio da contagem de um total de 4.320 pontos, projetados sobre imagens capturadas em dez campos aleatoriamente distribuídos nos diferentes cortes histológicos do testículo de cada animal. Para tal, utilizou-se um retículo de 432 intersecções (pontos), em imagens capturadas com aumento de 400 vezes. O peso dos diferentes componentes testiculares foi considerado como volume uma vez que a densidade volumétrica do testículo de mamífero está em torno de 1 (1,046) (Johnson et al., 1981). O volume tubular e intertubular foram estimados a partir do percentual ocupado por estes componentes, e o volume total do parênquima testicular, o qual foi considerado como peso total do testículo descontando-se apenas o peso da albugínea testicular.
Em dez secções transversais de túbulos seminíferos, no estádio 1 do ciclo do epitélio seminífero de cada animal, segundo o método da morfologia tubular (Berndtson, 1977), foram quantificadas as populações de: espermatogônias do tipo A (SPTG A), espermatócitos primários em preleptóteno/leptóteno (PL), espermatócitos primários em paquíteno (PQ), espermátides arredondadas (AR) e células de Sertoli (CS). Devido às variações no tamanho dos vários tipos de células, as populações celulares foram corrigidas numericamente considerando-se a espessura do corte e o diâmetro nuclear ou nucleolar, este último, no caso das células de Sertoli, utilizando-se para isto a fórmula de Abercrombie (1946), modificada por Amann & Almquist (1961):
A partir destas populações foram determinados: coeficiente de eficiência de mitoses espermatogoniais (PL/SPTG A), rendimento meiótico (AR/PQ), rendimento geral da espermatogênese (AR/SPTG A) e coeficiente de manutenção de espermatócitos
primários (PQ/PL). A partir dessas populações também foram obtidos: os índices de células de Sertoli por total de células espermatogênicas (SPTG A + PL + PQ + AR/CS) e o índice de célula de Sertoli por espermátide arredondada (AR/CS) (Berndtson, 1977).
2.7. Análises estatísticas
Análise de variância (ANOVA), seguida de teste de Duncan (5 % de significância) foi utilizada para avaliar variações dos parâmetros estudados nos grupos- controle e tratados. Os valores dos parâmetros estão representados pelas médias, desvios-padrão e coeficientes de variação.
3. Resultados