MATERIAL E MÉTODOS

4.1) Manutenção dos Animais

Foram utilizados R. prolixus mantidos no insetário do Laboratório Integrado de Bioquímica Hatisaburo Masuda (NUPEM – UFRJ Campus Professor Aloísio Teixeira). A criação e manutenção dos organismos consiste em um sistema onde os insetos são separados em diferentes potes de acordo com os estágios de desenvolvimento: ovos pré-eclosão, cincos estágios ninfais e adultos de acordo com a quantidade de alimentações (o que permite estimar a idade e duração do ciclo de vida). Os potes são mantidos em uma estufa com temperatura constante de 28ºC e umidade relativa entre 70-80%. A alimentação dos insetos é realizada através da exposição controlada dos insetos a coelhos, para que os insetos possam realizar a ingestão de sangue através de picadas nas orelhas do coelho, onde é uma região de pouco pêlo e alta vascularização (SOUZA-FERREIRA et al., 2014b; BUXTON, 1930). Este projeto se encontra dentro das exigências da Comissão de Ética e Uso de Animais de Experimentação (CEUA - Mac032) do Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

4.2) Fixação dos Embriões

Após as fêmeas serem alimentadas, elas são monitoradas para observar o início do período de oviposição. A partir do início da oviposição, os ovos foram

coletados e separados em grupos que foram fixados em diferentes intervalos de tempo para obter embriões em todos os estágios de desenvolvimento. Os ovos coletados foram brevemente lavados com água destilada para a remoção do excesso de sujeira e em seguida foram colocados em um microtubo de 1,5mL até um volume de aproximadamente 200µL e depois foi adicionada água destilada até completar o volume de 1mL. O microtubo foi colocado em banho-maria, a 90ºC por 90 segundos e depois colocado no gelo até esfriar. A água do microtubo foi substituída por 1mL de solução de paraformaldeído a 12% e a amostra foi colocada na geladeira por 1hora para fixação. Após, a amostra foi retirada da geladeira e a solução de paraformaldeído foi substituída por uma solução de paraformaldeído 4% com Tween 20 a 0,1% e colocada novamente para fixar por mais uma hora sob agitação. A solução fixadora foi removida e o ovos foram lavados repetidamente com solução tampão PBST 1x. Por fim os embriões foram gradualmente transferidos do tampão para etanol 100%, no qual foram estocados a -20ºC até o momento da dissecção. Para a dissecção, os ovos são trazidos gradualmente para PBST 1x e colocados numa placa de petri de vidro. Os embriões foram dissecados ao estereoscópio com o auxílio de dois forceps (Dumont No.5 ou No.4) Em seguida os embriões foram refixados por 30 minutos em paraformaldeído 4%, depois lavados com solução de PBST 1X e estavam prontos para o uso ou são novamente transferidos gradualmente para etanol 100% e estocados a -20ºC até o momento de

serem utilizados. Protocolo adaptado de (LIU; KAUFMAN, 2004a)

4.3) Extração de RNA Total e Síntese de DNA Complementar

A extração e isolamento do RNA total foi feito utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen Cat. No. 15596018) através da técnica de extração com fenol e clorofórmio. Os ovos foram rapidamente lavados com água destilada para remover a sujeira e colocados em microtubo de 1,5 mL (estéril, livre de RNAses) até o volume de 100 µL. Em seguida foram adicionados 200 µL de TRIzol aos ovos e eles foram macerados com um pistilo e depois foram adicionados mais 800 µL de TRIzol. A amostra foi centrifugada a 12000 X g por 10 minutos, o sobrenadante foi transferido a um novo microtubo e depois foi adicionado 200 µL de clorofórmio. A amostra foi brevemente homogeneizada e incubada por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, a amostra foi centrifugada a 12000 X g por 15 minutos. Após a

centrifugação, a amostra se dividiu em três fases, onde a primeira fase na parte superior do tubo contém o RNA, a fase intermediária contém as proteínas e a terceira fase contém o DNA total. A fase contendo RNA foi transferida para um novo microtubo e em seguida foram adicionados 500 µl de isopropanol e 40 µL de acetato de amônia 5M para cada 200 µL da solução contendo RNA. Após a amostra foi incubada a -20ºC por 12 horas e em seguida foi centrifugada novamente a 14000 X g, 4ºC, por 30 minutos. Depois, o tubo foi vertido para remover o sobrenadante e o precipitado ficou aderido ao fundo do tubo. Foram adicionados ao precipitado 500 µL de etanol 70%, a amostra foi centrifugada novamente a 14000 X g, 4ºC, por 15 minutos e depois o tubo foi vertido novamente para remoção do sobrenadante e deixado vertido por 3 minutos para secar o precipitado que depois foi ressuspenso em 20 µL de água estéril livre de RNAses e DNAses. Esse protocolo foi adaptado de (STAPPERT et al., 2016) e a qualidade e concentração de RNA foi verificada em espectrofotômetro (LAN et al., 2009) e a integridade foi verificada através de eletroforese em agarose.

Para a síntese de DNA complementar (cDNA) foi utilizado o kit High-Capacity cDNA Reverse Transcription (Applied Biosystems Cat. No. 4368814) utilizando 2 µg de RNA total e seguindo as instruções do fabricante.

4.4) Busca por uma Sequência Homóloga de mille-pattes e de Genes Relacionados a Ele em R. prolixus

Para realizar a busca de sequências de genes já descritos em outros insetos que poderiam também estar presentes em R. prolixus, foram utilizadas as sequências já descritas para D. melanogaster, T. castaneum e O. fasciatus. A busca foi feita através da identificação dos genes nesses organismos utilizando o banco de dados de genes do National Center for Biotechnology Information - NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov). Em seguida, as sequências encontradas foram comparadas e alinhadas com sequências do genoma de R. prolixus (MESQUITA et al., 2015), utilizando a ferramenta BLAST do site Vector Base (https://www.vectorbase.org/). A sequências encontradas para R. prolixus foram verificadas através de um alinhamento local com as sequências de diversos organismos para verificar se coincidiam com as sequências de genes esperadas.

Para o mlpt, foi verificado a presença dos quatro sítios conservados das smORFs e para os genes do complexo Hox, foram verificadas as regiões de homeodomínio características de cada gene do complexo.

4.5) Desenho dos Primers

Após encontradas as sequências desejadas, elas foram utilizadas para utilizadas para a confecção de iniciadores (primers) necessários para a realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR - “Polymerase Chain Reaction”). Esse primers foram desenhados utilizando o programa Primer 3, presente na sessão de ferramentas do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Para os primers destinados à reação de PCR convencional, foram desenhados primers cujo produto varia entre 550-800 pares de bases, e foram acrescidos adaptadores (GGCCGCGG para os primers senso - “forward”- e CCCGGGGC para os primers anti-senso - “reverse”) aos primers que permitem que o produto amplificados apresentem os sítios de ligação da enzima T7 Polimerase, utilizada na síntese de RNA dupla fita e nas sondas para hibridização in situ. Para primers a serem utilizados para realização de PCR quantitativo em tempo real (RT qPCR - “Real Time quantitative PCR”), foram sintetizados primers cujo o produto final do amplicon seja em torno de 180-250 pares de bases. O tamanho ótimo dos primers está entre 20-22 pares de bases sem os adaptadores.

4.6) PCR Para Síntese de Moldes Para dsRNA e Sondas Para Hibridização in situ

Utilizando o cDNA obtido de embriões de diversos estágio e os primers listados abaixo (as partes das sequências em letras minúsculas referem-se aos adaptadores), foi realizada uma PCR com o kit GoTaq G2 Hot Start Polymerase (Cat. No.: M7405 - Promega). Utilizamos 1µL de cDNA e o volume utilizado dos primers foi calculado para uma concentração final de 0.2 µM na reação. O restante da reação foi preparada seguindo as instruções do fabricante, a temperatura de “melting” foi utilizada de acordo com as especificações de cada primer.

Gene (Primers) Sequência Rp-milli-pattes F (VB: ACPB03004889.1) ggccgcggAATACGCTCGATCCTACCGG Rp-milli-pattes R (VB: ACPB03016378.1) cccggggcTCGTCCGCTGTATTAATCCCA Rp-hedgehog F (VB: RPRC012384-RA) ggccgcggGTAGATCTGAGGCGGATTGC Rp-hedgehog R (VB: RPRC012384-RA) cccggggcCAGAAATTGGGTGCGCTACT Rp-Krüppel F (VB: RPRC000102-RA) ggccgcggCTATGGCTAGGCGAGAACCA Rp-Krüppel R (VB: RPRC000102-RA) cccggggcCTGTTCAGGGAGGTCGAGAG Rp-giant F (VB: ACPB03018756.1) ggccgcggTACACCACAGGCTTCACAGG Rp-giant R (VB: ACPB03018756.1) cccggggcAAAAGCCGCTCGTATAGCAA Rp-hunchback F (VB: ACPB03005501.1) ggccgcggCATGCCCAAAGTGTCCTTTT Rp-hunchback R (VB: ACPB03005501.1) cccggggcAAGCATCCGTGCTGTTCTCT Rp-shavenbaby F (VB :RPRC002781-RA) ggccgcggTCAGATCTTGATGGCTGCTG Rp-shavenbaby R (VB: RPRC002781-RA) cccggggcTTGCCATTCACTCTGTGCTC Rp-proboscipedia F (VB: FJ694871.1) ggccgcggTTGGCCTCATGTTATCAGCA Rp-proboscipedia R (VB: FJ694871.1) cccggggcGTAGATCTGAGGCGGATTGC Rp-Ultrabithorax F (VB: RPRC000565-RA) ggccgcggTCGAACAGACGGGCTTTTAC Rp-Ultrabithorax R (VB: RPRC000565-RA) cccggggcACAAAGCGTGAGCCATTTCT Rp-single-minded F (VB: ACPB03006262.1) ggccgcggACCAGAATGTCGGCCTAGTG Rp-single-minded R (VB: ACPB03006262.1) cccggggcCGGTTGATGATGGTGATGAG VB: Banco de dados VectorBase.

4.7) Síntese de dsRNA e Silenciamento Gènico Através de Interferência por RNA

Uma das técnicas mais utilizadas para silenciamento gênico é a da interferência por RNA (RNAi - RNA interference). Essa técnica consiste na introdução de fitas duplas de RNA (dsRNA) referentes ao gene de interesse no sistema do organismo de estudo. Essas dsRNA serão reconhecidas como material genético e são degradadas (VAN RIJ, 2008). Essa técnica foi desenvolvida por Craig Mello e Andrew Fire, onde dsRNA específicas para determinados genes foram injetadas em Caenorhabditis elegans provocando o silenciamento destes (FIRE et al., 1998). A dsRNA é inserida no organismos e lá é reconhecida pela proteína Dicer (endonuclease tipo III), que irá clivar a dsRNA em pequenos RNA de interferência (siRNA) e esses siRNA serão incorporados ao complexo de proteínas RISC/Argonauta que clivará o siRNA em fita simples, possibilitando que essa fita simples de RNA se anele de forma complementar à sequência presente no RNAm (tornando-se novamente uma dsRNA) e remova essa sequência, silenciando a expressão desse gene de interesse (Figura 13) (HAMMOND et al., 2000).

Figura 13: Mecanismo de RNAi. Esquema ilustrando o processo de degradação da fita

A dsRNA foi sintetizada através de um molde produzido através de uma reação de PCR, utilizando um gene que já foi previamente amplificado e os primers senso e anti-senso universais (primer universal senso: AGGGATCCTAATACGACTCACTATA GGGCCCGGGGC e primer universal anti-senso: GAGAATTCTAATACGACTCACTA TAGGGCCGCGG). Em seguida a dsRNA foi produzida com o kit MEGAScript T7 (Invitrogen - Cat. No. AM1334), seguindo as instruções do fabricante e utilizando 8 µL do molde na reação (aproximadamente 1µg de produto de amplificação). Ao final da reação, a cada 20µL de reação foram adicionados 25 µL de H2O estéril, 25 µL de acetato de amônia 5M, 150 µL de etanol 100%. A amostra foi colocada em repouso a -20ºC por 12 horas ou a -80ºC por duas horas e em seguida centrifugada por 30 minutos, a 4ºC e 14000 X g. Após, o microtubo com a amostra foi vertido cuidadosamente para remoção do sobrenadante e um sedimento contendo a sonda pôde ser visível ao fundo do microtubo. Em seguida foram adicionados 500 µL de etanol 70% e a amostra foi colocada para centrifugar novamente sob as mesmas condições, mas desta vez por 15 minutos. Novamente o microtubo foi vertido para retirada do sobrenadante e deixado em repouso com a boca do tubo voltada para baixo, sobre um lenço de papel limpo, para que o sedimento secasse. Por fim, a amostra foi ressuspendida em 100 µL de água estéril e dosada sua concentração por espectrofotometria, semelhantemente ao protocolo de extração de RNA descrito anteriormente.

Para a injeção de dsRNA, as fêmeas de R. prolixus (separadas após a primeira alimentação) foram colocadas para adormecer em uma caixa plástica em gelo e injetadas com uma seringa Hamilton 700 series de 10 µL (Hamilton Co. - Cat. No. 020734). A injeção foi realizada na lateral do abdome (Figura 14). Foram injetados 2 µL de solução de dsRNA a 5 µg/µL. Depois as fêmeas foram colocadas na estufa a 28ºC, adicionados machos uma proporção de 1 macho para cada 5 fêmeas e após 24 horas elas foram alimentadas. Assim que as fêmeas iniciam a oviposição, os ovos foram coletados para estudo da morfologia e para extração e RNA. Como controle do experimento, um grupo de fêmeas foi injetado com uma dsRNA não relacionada, dsRNA para o gene de resistència à Neomicina (dsNeo, um gene não presente no genoma de R. prolixus).

Figura 14: Injeção de dsRNA em R. prolixus. A ponta da agulha é colocada na região lateral

da fêmea, perfurando esse pele lateral que é elástica e que se regenera com facilidade.

4.8) Quantificação da Expressão de mlpt

Afim de quantificar a eficiência do silenciamento de mlpt, foi realizado uma PCR quantitativa em tempo real (RT qPCR) onde através da comparação entre os limiares dos ciclos (Cycle Threshold - Ct) que dará a expressão relativa de mlpt no grupo que foi silenciado em relação ao grupo controle, desta forma é possível estabelecer o quanto essa expressão foi reduzida. Como controle endógeno foram utilizados os primers para Ef 1 (Elongation factor 1) (BERNI et al., 2014; MAJEROWICZ et al., 2011). Para a reação foi utilizado o reagente SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems Cat. No. 4309155) e o termociclador StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems Cat. No.4376600). A reação e os primers utilizados seguem listados abaixo.

SYBR Green ... 8,5 µL Mix de Primers Senso e Anti-senso a 1µM ... 3,5 µL H2O estéril ... 1 µL cDNA diluído a 1:5 ……….…... 2 µL Volume total da reação ………... 15 µL .

Gene (Primers) Sequência

Rp-mille-pattes F (VB : ACPB03004889.1) TTTAGCTCGGACTCCTTTGG Rp-mille-pattes R (VB : ACPB03004889.1) GGTAGGATCGAGCGTATTGG Rp-Ef1 F (VB : RPRC015041-RA) GATTCCACTGAACCGCCTTA Rp-Ef1 R (VB : RPRC015041-RA) GCCGGGTTATATCCGATTTT

4.9) Síntese de Sonda e Hibridização in situ

Para a síntese da sonda, inicialmente foi feito um molde através de uma reação comum de PCR (uma segunda PCR), onde o cDNA foi substituído pelo produto da primeira PCR. Para a síntese da sonda anti-senso foram utilizados o primer senso específico e um primer anti-senso universal (o mesmo utilizado para síntese de dsRNA) e para a sonda senso (controle da reação) foram utilizados o primer anti- senso específico e um primer senso universal (o mesmo utilizado para síntese de dsRNA). Em seguida, o molde (produto da segunda PCR) foi utilizado, junto ao kit MaxiScript T7 (Invitrogen - Cat. No. AM1314) para a produção da sonda para hibridização, seguindo as instruções do fabricante, com exceção dos nucleotídeos que foram substituídos pelo DIG RNA Labeling Mix (Roche - Cat. No. 11277073910), que é uma solução de nucleotídeos que possuem uracilas marcadas com digoxigenina para posterior detecção da sonda por anticorpo durante o processo de hibridização in situ (TAUTZ; PFEIFLE, 1989). Ao final da reação, a cada 10µL de reação foram adicionados 40 µL de H2O estéril, 5 µL de acetato de amônia 5M, 150 µL de etanol 100% e 2 µL de RNAt a 20mg/ml (o RNAt atua reduzindo a capacidade da sonda de se ligar especificamente). A amostra foi precipitada da mesma forma que na síntese de dsRNA. Ao final, a amostra foi ressuspensa em 100 µL de solução Hyb II. As amostras foram submetidas a um protocolo de hibridização in situ onde elas foram tratadas com solução de lise RIPA por uma hora, depois lavadas com PBST 1X e tratadas com Proteinase K (Roche - Cat. No. 03115836001) por 5 minutos. Em seguida, as amostras foram incubadas com a sonda anti-senso durante 36 horas e após lavadas repetidamente com pbST 1x para depois serem submetidas a um bloqueio com Solução de Bloqueio (Western Blocking Reagent - Roche - Cat. No. 11921673001) e em seguida, incubadas com o anticorpo anti-digoxigenina (Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments - Roche - Cat. No. 11093274910) por 12 horas e após foram lavadas, incubadas com tampão fosfato alcalino e com o reagente BM Purple (Roche - Cat. No. 11442074001), providenciando o substrato para a reação colorimétrica. Esse protocolo foi adaptado dos trabalhos (LIU; KAUFMAN, 2004a, 2004b).

4.10) Imuno-histoquímica e marcação nuclear com DAPI

A técnica de imuno-histoquímica se baseia em expor a amostra a anticorpos para a proteína de interesse e para a visualização de onde essa proteínas foram expressas. Esse anticorpo precisa ser reconhecido por um segundo anticorpo que ou possui acoplado a ele uma enzima que, quando exposta a seu substrato, depositará um produto com cor ou possuí um fluoróforo. Foi utilizado como anticorpo primário o anticorpo anti-Antp 8C11 (Developmental Studies Hybridoma Bank), que reconhece a proteína Antennapedia (numa diluição de 1:30) e como anticorpo secundário foi utilizado o anti-mouse Alexa Fluor 555 (Invitrogen Cat. No. Z25005) (HAYWARD et al., 1995). A marcação nuclear é uma técnica muito popular no estudo de biologia do desenvolvimento de pequenos organismos pois é uma método simples e rápido que permite a visualização da morfologia externa como um todo, em certos casos, permitindo até identificar diferentes populações celulares através da diferença de tamanho nos núcleos de uma região (ex.: células embrionárias e extra embrionárias) (PANFILIO; ROTH, 2010). O marcador mais popular é o 4',6- diamidino-2-phenylindole (DAPI), um intercalante de DNA que se liga nas regiões com abundância de ligações adenina-timina e é fluorescente quando exposto à luz ultravioleta (excitação em 365 nm e emissão em 450 nm) (RUSSELL; NEWMAN; WILLIAMSON, 1975). As marcações foram realizadas como já descrito por (NUNES DA FONSECA et al., 2008; SANTOS et al., 2013)

4.11) Preparação da Cutícula

Para a análise de de alterações morfológicas exteriores, é observada a superfície do embrião em seus últimos estágios de desenvolvimento (quando já há cutícula revestindo o embrião) ou no primeiro estágio de ninfa. Para isso é realizada uma digestão do conteúdo interno do embrião, para que se tenha somente a cutícula transparente. Essa preparação foi realizada utilizando o meio de montagem Hoyer (Hoyer’s Solution) (WIESCHAUS; NUSSLEIN-VOLHARD, 1986), que é uma solução de montagem rica em ácido lático, que realizará digestão do conteúdo interno à cutícula. O embrião (após ter sido removida a casca) ou a ninfa de primeiro estágio são anestesiados, colocados sobre uma lâmina para microscopia e em seguida é adicionado cerca de 100 µL de solução de Hoyer, a amostra é colocada na posição

desejada, coberta com uma lamínula e colocada a 60ºC por pelo menos 12 horas para que haja a total digestão e para que o meio de montagem endureça (STERN; SUCENA, 2011). Após isso, a lâmina com a cutícula está pronta para ser observada ao microscópio.

4.12) Aquisição de Imagem e Montagem

A documentação dos resultados foi realizada através da aquisição de imagens utilizando o estereoscópio Leica M205 A e o software Leica Application Suite AF (Leica Microsystems GmbH). Para a aquisição de imagens fluorescente foram utilizados os filtros para ondas ultra-violeta (emissão entre 358/461 nm) e filtro que absorve o comprimento de onda de emissão a 555 nm. A barra de escala dos resultados foi ajustada de forma em que é equivalente a 500 µm em todas a imagens presentes nesse trabalho. As imagens foram agrupadas e montadas utilizando os softwares Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems) e GNU Image Manipulation Program 2.8 (The GIMP Development Team). Para facilitar a comparação entre as marcações obtidas e a região do embrião onde se encontram, as imagens das hibridizações in situ fora passadas para o negativo e colorizadas artificialmente e sobrepostas com as imagens equivalentes marcadas com DAPI. Já no caso da marcação com anticorpo, as imagens foram apenas sobrepostas sem precisar passar para o negativo e colorir. Para a confecção dos esquemas complementares foi utilizado o software Inkscape 0.92 (The Inkscape Team).

5) RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1) Padrão de expressão do mlpt

O padrão de expressão de mlpt é bem dinâmico ao longo do desenvolvimento. No primeiro estágio ele é expresso em uma única faixa aproximadamente no meio do blastoderma (orientação antero-posterior, Figura 15 A). No segundo estágio, a expressão está presente na região onde será formada a cabeça e na forma de faixa na região mais posterior, sem chegar à borda da região posterior (Figura 15 B). No terceiro estágio, que compreende a gastrulação e início da extensão da banda

germinal, o mlpt continua sendo expresso na região da cabeça (de forma mais centralizada) e a faixa de expressão na região mais posterior desloca-se durante a extensão da região da banda germinal que dará origem ao tórax (Figura 15 C-F). No quarto estágio (Figura 15 G-J) o mlpt passa a ser expresso na região da banda germinal que dará origem à região anterior do abdome, nesse estágio a faixa de expressão se divide em várias faixas (pelo menos 4). Ao final do quarto estágio e início do quinto, quando a banda germinal completou sua extensão e começa a formação dos apêndices, o mlpt é expresso no télson (último segmento, Figura 15 K), mas assim que os apêdices locomotores começam a se diferenciar, o mlpt passa a ser expresso na região distal anterior das pernas e volta a ser expresso na cabeça, agora nos lóbulos da cabeça (Figura 15 L). No sétimo estágio a expressão de mlpt está presente em todo o corpo do embrião: nos lóbulos da cabeça, em todos os apêndices, na região dos apêndices gnatos e tórax, nas laterais do abdome e fracamente no télson (Figura 15 M). Durante a katatrepsis (oitavo estágio) a expressão de mlpt sofre novamente em seu padrão, passando a ser expressa no último segmento das antenas (nono estágio, Figura 15 N).

O gene mlpt em R. prolixus apresentou um padrão muito semelhante ao que foi descrito para T. castaneum (SAVARD et al., 2006) em diversos momentos, mas principalmente durante a formação da banda germinal (Figura 15 A-B), com algumas diferenças durante a gastrulação (Figura 15 C, C’, D, D’), mas novamente semelhante durante a extensão da banda germinal (Figura 15 E-J), sendo que em R.

prolixus foi visível a formação de faixas de expressão durante esse processo (Figura

15 H-J). O único momento em que mlpt foi expresso na zona de crescimento, foi ao final da extensão da banda germinal e segmentação (Figura 15 K), enquanto em T.

castaneum o mlpt é expresso na zona de crescimento ao fim da formação da banda

germinal, durante a gastrulação e durante a segmentação. Durante a formação e crescimento dos apêndices, em R. prolixus o mlpt é expresso na cabeça e na porção distal das pernas (Figura 15 L), enquanto em T. castaneum é expresso na base das pernas. Mais adiante no desenvolvimento, o mlpt é expresso em todo o corpo do embrião, nas laterais dos segmentos e na cabeçam semelhantemente à expressão de Tc-mlpt (Figura 15 M). Ao fim da embriogênese, a expressão de mlpt no último segmento das antenas que foi observada em R. prolixus, não foi observada em T.

Figura 15: Padrão de expressão de mlpt. Durante os primeiros estágios o mlpt é expresso

na borda dos futuros lobos da cabeça e na região de invaginação do embrião (A-D). Durante a extensão da banda germinal, inicialmente o mlpt é expresso na região torácica (E-F), depois é expresso no tórax e abdome em faixas (G-J) e mais tarde na extremidade da região posterior, últimos segmentos (K) Após, o mlpt também é expresso nas regiões mais distais dos apêndices e dos lobos da cabeça (L). Por fim, o mlpt é expresso lateralmente em toda a extensão do embrião (M) e nos últimos estágios é expresso nos últimos segmentos da antena (N). Marcação por DAPI em azul, para identificação do estágio embrionário e das